Активные формы кислорода и состояние окислительного стресса
Биомембранология Болдырев А.А., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В.А.
- Системы генерации и утилизации активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов
- Участие активных форм кислорода в лейкоцитарном взрыве и синтезе простагландинов
- Активные формы кислорода и продукты перекисного окисления липидов как сигнальные молекулы
- Нарушения мембранных структур, связанные с повышением концентрации активных форм кислорода
Активные формы кислорода (АФК), накапливающиеся в ходе клеточного метаболизма, исторически привыкли считать вредными веществами, поскольку их чрезмерное накопление приводит к окислительному повреждению клеточных структур и гибели клеток. Таким образом, было постулировано, что как в норме, так и при патологических процессах необходимо ингибировать наработку активных форм кислорода и снижать активность перекисного окисления липидов (ПОЛ). Применяемые для этой цели разнообразные антиоксиданты стали усиленно рекомендовать клиницистам. Более того, современные производителей разнообразных пищевых добавок особенно подчеркивают, что эти добавки являются сильными антиоксидантами.
Исследования последних лет выявили важное регуляторное участие активных форм кислорода во многих физиологических и биохимических процессах – регуляции тонуса сосудов, клеточной пролиферации, синтезе простагландинов, в регуляции метаболических процессов в качестве внутриклеточных мессенджеров, а также, конечно, и в микробицидном действии фагоцитов. Неумеренное применение антиоксидантов, в том числе витаминов Е, С, и β-каротина будет затруднять выполнение клеточными активными формами кислорода вышеуказанных функций.
УЧАСТИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ЛЕЙКОЦИТАРНОМ ВЗРЫВЕ И СИНТЕЗЕ ПРОСТАГЛАНДИНОВ
Как уже отмечалось выше, в ряде случаев усиление генерации АФК является физиологически нормальной реакцией. Для объяснения прямой зависимости микробицидного, цитотоксического и мутагенного действия фагоцитов от активности ферментативных систем образования АФК предложено несколько механизмов (рис. 56).
При стимуляции фагоцитирующих клеток в результате активации НАДФН-оксидазы наблюдается резкое усиление продукции О2˙ (так, 10 4 гранулоцитов могут синтезировать 10 нмоль/час радикалов или околО200 миллионов молекул О2˙ в секунду на клетку). Мы отмечали, что супероксид-анион не обладает непосредственной микробицидной активностью, а является триггером каскада реакций, приводящих к образованию других более реакционно способных форм АФК и пероксинитрита. В присутствии СОД О2 ˙ быстро переходит в Н2О2 , а в реакциях с металлами переменной валентности из О2 ˙ образуются синглетный кислород и гидроксильный радикал. Гидроксильные радикалы вызывают повреждение нуклеиновых кислот, белков (прежде всего мембранных) и индуцируют образование органических радикалов.
НАДФН-оксидаза (КФ 1.6.99.6) фагоцитирующих клеток является ферментативным комплексом, специализированным на восстановлении молекулярного кислорода с образованием О2˙ (при стимуляции нейтрофилов около 90% потребляемого О2 идет на образование супероксидного аниона). Фермент представляет собой многокомпонентную систему, состоящую из мембрансвязанных и цитозольных компонентов. Мембрансвязанный низкопотенциальный цитохром b 558 состоит из 2 субъединиц α и β с молекулярными массами 22 кДа и 91 кДа (p22phox и gp91 phox , соответственно; phox – от phagocyte oxidase); их стехиометрическое соотношение составляет 1:1. α-Субъединица содержит гем, β-субъединица, по последним данным, представляет собой ФАД-содержащий флавопротеин. В нестимулированных нейтрофилах человека 85% цитохрома b 558 локализовано на мембранах специфических гранул и около 5% – на цитоплазматической мембране, остальные 10% связаны с секреторными везикулами. Для генерации О2˙ также необходимы два цитозольных белка с молекулярными массами 47 и 67 к Да (p47phox и p67phox соответственно), которые в покоящейся клетке находятся в виде комплекса с третьим 40 кДа цитоплазматическим белком (p40phox ); молекулярная масса комплекса составляет 240–250 кДа. Генетически обусловленное отсутствие или дисфункция любого из компонентов p22phox , gp91phox , p47phox и p67phox приводит к потере способности НАДФН-оксидазы генерировать О2˙ и лежит в основе хронического гранулематоза. В активации НАДФН-оксидазы участвуют мембранный ГТФ-связывающий белок (G-белок) Rap– lA и цитозольные белки из семейства малых цитозольных G-белков р21 rас1 и р21r ас2 ; последний в покоящейся клетке комплексируется с ингибитором диссоциации Rho ГДФ (GDI) в гетеродимер с молекулярной массой 45–50 кДа и у человека представляет собой преобладающую форму ГТФаз, связывающихся с p40phox . В то же время не выявлено случаев хронического гранулематоза, обусловленного отсутствием или аномальной функцией G-белков, также как и цитозольного компонента p40phox .
При стимуляции фагоцитов происходит быстрая самосборка из мембранных и цитозольных компонентов НАДФН-оксидазного комплекса (рис. 57), осуществляющего перенос электрона с цитозольного НАДФН на О2 с образованием О2 ˙. Индукция хемотаксическими пептидами происходит в течение 2 с. Цитохимическое изучение клеточных компартментов, в которых в нейтрофилах осуществляется продукция О2˙ показало, что уже через 1 мин после стимуляции большая часть НАДФН-оксидазной активности обнаруживается на внутриклеточных цилиндрических гранулах, содержащих также щелочную фосфатазу; в последующем (через 5 мин) основная активность НАДФН-оксидазы локализуется на внешней стороне цитоплазматической мембраны, попадая туда в результате экзоцитоза О2 ˙–продуцирующих гранул.
Как уже упоминалось выше, ферментативный синтез перекисей липидов играет важную роль, поскольку предшествует образованию биологически активных соединений. Свободные полиненасыщеные жирные кислоты могут окисляться по двум независимым путям: циклоксигеназному и липоксигеназному. Так, например, при циклогеназном окислении арахидоновой кислоты образуются циклические эндоперекиси – простагландины G 2 и H 2 , служащие метаболическими предшественниками различных классов простагландинов (PGE 2 , PGF 2α , PGD2), тромбоксанов (ТХА 2 , ТХВ 2 ) и простациклина (PGI 2 ). При липоксигеназном окислении арахидоновой кислоты образуются алифатические гидроперекиси – гидропероксиэйкозатетраеновые кислоты – промежуточные продукты биосинтеза лейкотриенов.
В ходе эволюции аэробных организмов выработалась регуляторная система, обеспечивающая связь между ферментативными и неферментативными механизмами утилизации кислорода, защиты от вредного действия его высокореакционных форм и продуктов свободнорадикальной и перекисной природы, а также способами восстановления поврежденных биомолекул (ДНК, белков, липидов) и клеточных структур. Динамический баланс между этими процессами позволяет нормально функционировать биологическим системам, а его нарушение, приводящее к усилению синтеза АФК и/или антиоксидантной недостаточности, ведет к окислительному стрессу.
АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ПРОДУКТЫ ПОЛ КАК СИГНАЛЬНЫЕ МОЛЕКУЛЫ
В последние годы выявлен широкий спектр физиологических эффектов АФК, к которым, прежде всего, относятся регуляция клеточной пролиферации и тонуса сосудов, индукция транскрипции определенных генов. Показано функционирование активных форм кислорода в качестве вторичных внутриклеточных мессенджеров. Так, активные формы кислорода непосредственно участвуют в активации онкогенов, а также гена, кодирующего главную форму фактора транскрипции АР–1, в ответ на ионизирующую радиацию. О2˙ и Н 2 О2 активируют фактор транскрипции NFκB, который вызывает экспрессию генов, кодирующих ряд цитокинов и вирусов, в том числе ВИЧ, a NO’ подавляет активацию NFκB, увеличивая индукцию ингибитора фактора транскрипции NFκB и стабилизируя его. В индукции синтеза белков теплового шока, повышающих резистентность клеток к высоким температурам, радиации, токсическому действию ионов тяжелых металлов и лекарственных препаратов, основная роль отводится перекиси водорода. NO* и СО* связываются с гемовой частью гуанилатциклазы и обратимо изменяют синтез цГМФ, тем самым управляя работой этих важных внутриклеточных регуляторов внутриклеточной коммуникации.
Одним из наиболее изученных факторов межклеточных сигнализации является оксид азота (нитроксид, NO-радикал), образующийся из L–аргинина и молекулярного кислорода с помощью фермента NO–синтазы: L-аргинин + НАДФН + О2 → цитруллин + NO + НАДФ + Радикал NO является важнейшим нейромедиатором, интермедиатом иммунной системы и регулятором сердечно–сосудистой системы человека. В животном организме NO работает как вторичный мессенджер и в периферической, и центральной нервной системе.
Существуют две основные формы NO-синтазы – конституционная, выделенная главным образом из эндотелия и нейронов, и индуцибельная, выделенная из макрофагов, гладких мышц и печени. Они отличаются по структуре и способу регуляции. Конституционная NO-синтаза постоянно присутствует в клетках и ее активность находится в прямой зависимости от уровня ионов Са, а регуляция осуществляется через кальмодулин, являющийся кофактором этого фермента. Индуцибельная форма не зависит от содержания кальция и транскрипционно регулируема. Эта форма индуцируется в макрофагах, гладких мышцах, гепатоцитах, нейтрофилах и других клетках под действием эндо- и экзотоксинов, цитокининов и продуцирует большое количество NО• в течение длительного времени. Последнее свойство важно, как основа адаптации клеток к изменяющимся условиям функционирования.
В результате повышения концентрации NO активируется цитозольная гуанилатциклаза, катализирующая превращение ГТФ в цГМФ, который активирует специфическую протеинкиназу (G-киназу) или непосредственно, или с помощью дополнительного сигнального пути, включающего еще один вторичный мессенджер – аденозиндифосфатрибозу. Последняя открывает Са-каналы внутриклеточных Са-депо, в результате чего повышается концентрация кальция в цитозоле, активируются Са-зависимые протеинкиназы, фосфорилируется белковый фактор регуляции транскрипции и начинается синтез белков теплового шока, обеспечивающих клеточную защиту. Оксид азота обладает широким спектром биологического действия. Он участвует в межклеточной сигнализации в центральной и периферической нервных систем. Его идентифицируют с эндотелиальным фактором релаксации, расслабляющим гладкие мышцы и предотвращающим агрегацию тромбоцитов и адгезию нейтрофилов к эндотелию. Его синтез фагоцитирующими клетками регулирует пролиферацию лимфоцитов. Он вносит вклад в, микробицидное и противоопухолевое действие фагоцитов. Более того нитроксид является регулятором внутриклеточной концентрации ионов Са 2+ и, соответственно, активности ряда Сa-зависимых ферментов. Источником NO в центральной и периферической нервной системе являются эндотелиоциты сосудов, клетки микроглии и астроциты, неадренергические нервные волокна и глутаматэргические нейроны (рис. 58).
Функции нейронального NO чрезвычайно разнообразны: он контролирует осцилляторную активность нейронов, является медиатором ноцицепции, участвует в формировании циркадных ритмов процессах термогенеза, обоняния, принятия пищи и воды, снижает тревожность, регулирует выход нейромедиаторов; играет существенную роль в процессах потенциации и, соответственно, долговременной памяти. Нейрональный NO является важнейшим вторичным мессенджером, с помощью которых нервная система управляет тонусом сосудов, снабжающих кровью все системы организма, причем он может действовать как непосредственно, так и опосредованно (например, стимулируя высвобождение вазопрессина).
Рис. 58. Увеличение концентрации АФК в результате активации глутаматных рецепторов нейронов (Болдырев, 1998)
Показано участие оксида азота, выделяющегося в синоатриальном узле, в автономном контроле сердцебиения. Снижение содержания цитоплазматического цГМФ при активации клеточных рецепторов L-глутаматом и его производными является NO-зависимым процессом. В зависимости от уровня NO он может или ингибировать, или потенцировать высвобождение глутамата и аспартата, тем самым защищая нейроны от экзайтотоксических эффектов медиатора. Избыточная продукция или недостаточно быстрая нейтрализация глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, выполняющих роль возбуждающих медиаторов в нейронах, приводит к нейротоксическим эффектам. В основе токсического действия лежит стимуляция АФК, способная приводить к окислительному повреждению тканей. Кроме того, NO защищает головной мозг от ишемических и нейротоксических инсультов, контролирует осцилляторную активность нейронов.