Взаимодействие вируса с клеткой-хозяином

Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии. Зинченко А.И., Паруль Д.А. — 2005

• Место интерферона среди факторов защиты орга­низма от вирусных инфекций
• Основные биологические свойства интерферонов
• Механизмы действия интерферона
• Типы взаимодействия вируса с клеткой
• Общая характеристика продуктивного процесса
• Этапы взаимодействия вируса с клеткой-хозяином
  • Общие представления о цикле репликации вирусов
  • Прикрепление вируса к клетке
  • Проникновение вируса в клетку
  • Раздевание вируса
  • Стратегия репликации генома и экспрессия генов
  • Сборка вирионов
  • Созревание и выход вирионов из клетки
• Система интерферона
  • Место интерферона среди факторов защиты орга­низма от вирусных инфекций
  • Основные биологические свойства интерферонов
  • Механизмы действия интерферона

ТИПЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ

При проникновении вируса в клетку образует­ся новый биологический комплекс «вирус- клетка». Этот комплекс содержит генетиче­ский аппарат клетки и генетический аппарат вируса, функции которых могут переплетать­ся самым причудливым образом. По сути дела — это «химера», гибрид двух организмов.

Несмотря на огромное разнообразие клеток и вирусов, можно выделить несколько основ­ных типов их взаимодействия.

• Клетка гибнет и при этом образуется но­вое поколение вирусных частиц. Такой тип взаимодействия вируса и клетки называется продуктивным или литическим. Вирусы, вы­зывающие лизис клеток-хозяев, носят назва­ние вирулентных. Так протекает большинство вирусных инфекций независимо от того, явля­ются ли вирусы крупными и сложно устроен­ными (например, вирусы герпеса, оспы) или мелкими (ВТМ, аденовирусы).
• Инфекционный процесс носит абортив­ный характер — клетка выживает, вирус не об­разуется. Иногда погибают оба партнера — и вирус, и клетка.
• Возникает интеграция двух геномов, ко­торые сосуществуют более или менее мирно на протяжении многих поколений. Такой тип взаимодействия называется вирогенией. Ви­русы, способные вызывать вирогению, назы­ваются умеренными. В случае бактериофагов, такое встраивание генома вируса в ДНК клет­ки-хозяина носит наименование лизогении, а сами фаги, способные к такому взаимо­действию с клеткой, именуются лизогенными.

Кроме лизогенных фагов (например, фаг X) интегративный процесс характерен для ретровирусов, многих ДНК-содержащих онкогенных вирусов (у них может происходить интеграция не только всего генома, но и его части), а так­же некоторых других вирусов (например, гепаднавирусов). Интегративный процесс часто приводит к трансфор­мации клетки — приобретению ею новых гено- и феноти­пических признаков.

Рассмотрим типы вирусных инфекций. В зависимости от степени антагонизма двух геномов — вирусного и кле­точного — возможны несколько типов инфекции. Феноме­нологически различают персистентные инфекции, при которых вирус выделяется из организма-хозяина в тече­ние значительно большего времени, чем при обычных ли- тических инфекциях, завершающихся гибелью клеток- хозяев. При латентной инфекции вирус находится в орга­низме хозяина в скрытой форме и выделяется в периоды рецидивов болезни. Медленные вирусные инфекции ха­рактеризуются очень длительным инкубационным перио­дом, который может длиться годами.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТИВНОГО ПРОЦЕССА

Циклы репродукции всех вирусов имеют общие черты (рис. 3.1). В течение некоторого времени после заражения клетки в ней практически не удается обнаружить вирус­ных частиц. Этот период известен как фаза эклипса (за­тмения). В это время вирусная частица находится в клетке в дезинтегрированном состоянии. Период эклипса найден у всех без исключения вирусов, и его наличие в настоящее время рассматривается как один из критериев для отнесе­ния того или иного биологического объекта к вирусам.

За периодом эклипса следует период созревания — ин­тервал, в течение которого вирионы потомства накаплива­ются внутри клетки с экспоненциальной скоростью. Фаза созревания завершается выходом потомства из клетки, что знаменует собой окончание латентного (инкубацион­ного) периода — минимального промежутка времени, в те­чение которого вирусные частицы отсутствуют в окружающей клетку среде. Цикл репродукции вирусов про­должается от 30-40 мин (у многих бактериофагов) до бо­лее чем 40 ч (герпесвирусы). При этом урожай вирионов широко варьирует и иногда достигает десятков тысяч час­тиц в расчете на одну клетку (вирус полиомиелита).

Рис. 3.1. Кривые, демонстрирующие цикл размножения бактериофага Т1 в клетках Е. coli

СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНА

Место интерферона среди факторов защиты организма от вирусных инфекций

У организма-хозяина имеется ряд защитных механиз­мов от вирусных инфекций. Одним из ответов организма позвоночных на вирусную атаку является активация гу­морального и клеточного разделов иммунной системы.

Гуморальный иммунный ответ находит свое выраже­ние в продукции противовирусных антител. Главный ре­зультат активности антител — очистка сыворотки крови от вирусных частиц, что предотвращает передвижение виру­са к неинфицированным клеткам и снижает нагрузку на другие защитные механизмы организма.

Прямая нейтрализация вирусов антителами достигает­ся целым рядом способов, включающих конформацион- ное изменение капсида, вызванное присоединением антител, блокировку антирецепторов и т.д. Вторичным следствием связывания вируса с антителами является фагоцитоз по­крытых антителами («опсонизированных») вирионов моноядерными клетками или полиморфноядерными лей­коцитами.

Связывание антител с вирионами приводит к актива­ции системы комплемента, которая также способствует нейтрализации вирусных частиц. Участие системы комп­лемента имеет особо важное значение на ранних стадиях инфекции, когда в организме синтезируются еще ограни­ченные количества низкоаффинных антител.

Как предполагают, в борьбе с вирусными инфекциями более эффективен, в сравнении с гуморальным, клеточ­ный тип иммунитета. Это предположение вытекает из сле­дующих наблюдений.

• Врожденные дефекты клеточного иммунитета прояв­ляются в предрасположенности прежде всего к вирусным ин­фекциям (и в гораздо меньшей степени — к бактериальным).
• В случае СПИДа происходит снижение соотношения числа клеток Т-хелперов (CD4+) к числу клеток Т-супрес- соров (CD8+) с 1,2 (нормальный уровень) до 0,2. При этом практически все больные начинают страдать от различ­ных оппортунистических вирусных инфекций (вызван­ных, например, вирусами простого герпеса, цитомегало- вирусами, вирусом Эпштейна-Барр), которые присутство­вали и до развития СПИДа, но были тогда подавлены ин- тактной иммунной системой.

Клеточно-опосредованный иммунитет находит свое вы­ражение в уничтожении (лизисе) вирус-инфицированных клеток с участием так называемых NK-клеток (нормаль­ных киллеров) и ЦТЛ (цитотоксических лимфоцитов).

Другим и, по-видимому, более важным фактором за­щиты организма-хозяина от вирусных инфекций являет­ся продукция им интерферона. Действительно, клеточ­ный и особенно гуморальный иммунные ответы — слиш­ком медленные, чтобы защитить организм от быстро реп­лицирующихся вирусов, особенно в том случае, когда не было предварительного контакта его с вирусом. В этом от­ношении более мобильной является система интерферона.

В 1957 г. английский вирусолог А. Айзекс совместно со своим стажером из Швейцарии Д. Линденманном обнару­жили, что заражение некоторых клеток вирусом делает их и соседние с ними клетки менее восприимчивыми к последующему заражению тем же или другим вирусом. Затем было установлено, что это явление связано с образо­ванием в зараженной клетке особого вещества белковой природы — интерферона. В настоящее время известно, что интерфероны относятся к важнейшим факторам неспеци­фической резистентности клетки и организма.

Общепринято следующее определение: интерфероны — это гетерогенный класс гормоноподобных белков, кото­рые продуцируются клетками позвоночных (от рыб до че­ловека включительно) в ответ на вирусную инфекцию или воздействие различных агентов (индукторов) и осущес­твляют в организме функции, направленные на сохранение гомеостаза.

Несмотря на такой обобщенный характер определения, оно указывает на два кардинальных свойства интерферо- нов, а именно:

• интерфероны — это биологически активные белки;
• для образования их в клетке необходима специаль­ная индукция.

Когда вирус инфицирует клетку, это вызывает ответ­ную защитную реакцию в форме синтеза интерферона. О значении интерферона свидетельствует тот факт, что у экспериментальных животных, которым после заражения вирусами вводят антисыворотку против интерферона, ви­русные инфекции протекают гораздо тяжелее, чем у конт­рольных животных, инфицированных теми же вирусами.

Система интерферона включает в себя три взаимосвя­занных звена: индукцию, продукцию и действие.

Индукция интерферона может осуществляться много­численными природными и синтетическими веществами, которые, в свою очередь, подразделяют на высоко- и низ­комолекулярные индукторы. В настоящее время извест­ны сотни таких индукторов. Индукторами интерферона являются: метилированный альбумин, гистоны, некото­рые гормоны, антибиотики и т.д. Наиболее активные ин­дукторы — двухцепочечные природные и синтетические полирибонуклеотиды. Характерно, что синтез интерферо­на способны стимулировать не только инфекционные, но нередко и инактивированные вирусы.

Наибольший индуцирующий эффект проявляют виру­сы с медленным репликативным циклом, например, пара­миксо- и альфавирусы. Слабыми индукторами являются вирусы, выраженно блокирующие синтез клеточных мРНК и протеинов, например, герпес- и аденовирусы.

В отсутствии индукторов клеточные гены, кодирую­щие синтез интерферонов, обычно не экспрессируются. Предполагается, что в результате взаимодействия индук­тора с цитоплазматической мембраной происходит дереп­рессия генов интерферона согласно модели репрессии-де­репрессии Жакоба и Моно, разработанной для синтеза ин- дуцибельных ферментов у бактерий. Непременное усло­вие для запуска синтеза интерферонов — сохранение спо­собности клетки к синтезу белка вообще. При этом похо­же, что прямого взаимодействия индукторов с репрессорами интерфероновых генов нет, поскольку показано, что, напри­мер, высокомолекулярные индукторы (а также иммобилизо­ванные низкомолекулярные) в клетки не проникают.

Продукция интерферона является результатом тран­скрипции гена интерферона с последующей трансляцией мРНК клеточной белоксинтезирующей системой. После соответствующего процессинга интерферон секретируется в окружающую среду.

Интерфероны подразделяются на три антигенных ти­па: а, (3 и у.

Интерферон-а — лейкоцитарный интерферон — проду­цируется преимущественно лейкоцитами периферической крови. Имеется, по крайней мере, 15 молекулярных видов этого интерферона, некоторые из них отличаются лишь по одной аминокислоте. Все гены (около двадцати), кодирую­щие интерферон-а, у человека локализуются на 9-й хромо­соме. Основными индукторами являются вирусы, природ­ные и синтетические полинуклеотиды. Зрелый белок (мо­лекулярная масса 17 ООО) содержит 143 аминокислоты.

Интерферон-β — фибробластный интерферон — проду­цируется преимущественно фибробластами при использо­вании тех же индукторов, которые вызывают синтез ин- терферона-а. Способность к образованию этого интерферо­на кодирует единственный ген, также расположенный на 9-й хромосоме. Зрелый белок состоит из 145 аминокислот и, в отличие от интерферона-а, гликозилирован.

Интерферон-у — иммунный интерферон — продукт сти­мулированных Т-лимфоцитов, нормальных киллеров и (возможно) макрофагов. Способность к образованию коди­рует один ген 12-й хромосомы. Зрелый белок содержит 146 аминокислот и гликозилирован. По первичной струк­туре имеет очень мало общего с описанными выше интер- феронами а и (3. Этот вид интерферона до сих пор остается наименее изученным.

Основные биологические свойства иитерфероиов

Противовирусная активность (наиболее детально изу­ченное биологическое свойство итерферонов) имеет следу­ющие основные черты:

• универсальность — интерфероны активны против ши­рокого круга как РНК-, так и ДНК-содержащих вирусов;
• видоспецифичность — каждый биологический вид продуцирует свои уникальные белки, порой весьма похо­жие по структуре и физико-химическим свойствам, но не способные проявлять антивирусное действие в условиях организма другого вида. Другими словами, интерфероны высокоактивны только в гомологичных системах и слабо­активны (или неактивны) в гетерологичных. Так, огром­ное количество интерферона, выделенного из мышиной ткани, оказывается неспособным защищать от вирусов ткань куриных фибробластов, и наоборот;
• последействие — даже после удаления интерферона в обработанных им клетках сохраняется способность подавлять репродукцию вирусов в течение довольно длительно­го времени;
• внутриклеточную точку приложения — интерферон не действует непосредственно на вйрионы или их нуклеи­новые кислоты, а подавляет процесс их внутриклеточной репродукции.

Развитие индуцируемого интерфероном состояния про­тивовирусной резистентности имеет характерную дина­мику. Резистентность начинает отмечаться спустя 1,5-2 ч после контакта клетки с интерфероном и достигает макси­мума к 5-6 ч. При этом достигаемый уровень резистент­ности зависит от сочетания таких параметров, как концент­рация интерферона, время его добавления по отношению к началу вирусной инфекции, множественность зараже­ния и т.д.

Интерферон обладает обширным спектром непротиво­вирусных эффектов. Из них наиболее важными считаются антипролиферативный, иммуномодуляторный и радио- протекторный.

Механизмы действия интерферона

Эксперименты показали, что антивирусным эффектом обладает непроникающий в клетки комплекс интерферона с высокополимерным углеводом — сефарозой. Следова­тельно, стадия проникновения интерферона в соседнюю клетку для придания ей антивирусного состояния не яв­ляется необходимой. В настоящее время установлено, что для активирования генов, ответственных за развитие ан­тивирусного состояния, достаточно интерферону адсорби­роваться на специальных рецепторах, локализующихся на клеточных мембранах.

Как отмечалось выше, интерферон не действует на ви­рионы или выделенную из них РНК, а действует лишь на вегетативную форму вирусов. Причем тот факт, что инги­бирующий эффект обнаруживается даже при использова­нии для заражения клеток инфекционных РНК, служит доказательством того, что интерферон не затрагивает ран­ние фазы размножения вирусов — адсорбцию, проникно­вение и раздевание.

Многочисленными экспериментами доказано, что ос­новной эффект интерферона заключается в нарушении способности вирусных мРНК транслироваться. К такому результату действия интерферона приводят следующие биохимические события.

Интерферон активирует ряд генов. Некоторые из них кодируют образование ферментов с прямым антивирус­ным действием — РНК-активируемой протеинкиназы (рис. 3.13) и 2’-5’-олигоаденилатсинтетазы (рис. 3.14). Индуцируемая протеинкиназа обладает способностью фосфорилировать в белках остатки серина и треонина. При связывании с двухцепочечной вирусной РНК она ак­тивируется, аутофосфорилируется, а затем фосфорилирует белковый фактор eIF2a. В норме eIF2a в комплексе с ГТФ заставляет мет-тРНК связаться с 40S рибосомальной субъединицей, что инициирует синтез белка. Фосфорилирование фактора инициации трансляции eIF2a приводит его к инактивации, вследствие чего рассматриваемая стадия синтеза белка блокируется. При этом избирательное подавление трансляции вирусных матриц обусловлено, по-видимому, несколько большей чувствительностью ви­русной системы трансляции к фосфорилированию упомя­нутого фактора.

Рис. 3.13. Механизм действия интерферона, опосредо­ванный индукцией протеинкиназы

Рис. 3.14. Механизм действия интерферона, опосредо­ванный индукцией 2*-5’-олигоаденилатсинтетазы

2^,-5’-олигоаденилатсинтетаза активируется в при­сутствии двухцепочечной РНК и полимеризует из АТФ семейство олигоаденилатов с общей формулой (2’-5’)рррА(рА)_д. В молекулах этих соединений остатки аденозина соединены друг с другом не обычными (3’-5’-, как в РНК), а так называемыми изомеризованны- ми 2’-5’-фосфодиэфирными связями. Для обозначения важнейшего (наиболее активного) из них — тринуклеотида (2’-5’)рррА(рА)₂ — принято сокращение 2’-5’А (рис. 3.15).

Образовавшийся 2’-5’А активирует латентную (неак­тивную) РНКазу-L, присутствующую в клетках, не обра­ботанных интерфероном. Наконец, активированная РНКаза-L разрушает свободные (не связанные с рибосома­ми) вирусные и клеточные РНК.

Блокирование стадии инициации трансляции мРНК и разрушение самих мРНК обусловливает универсальный механизм действия интерферона. Следует отметить, что платой за такую универсальность является приостановка в клетке-хозяине биосинтеза белка вообще. С этим, кстати, связан антипролиферативный эффект интерферона. Таким образом, отрицательный эффект действия интер­ферона имеет и положительную сторону — подавление опу­холевого роста.

Следует отметить, что интерферон может воздейство­вать и на другие стадии вирусной репродукции. Напри­мер, в ряде случаев происходит блокирование депротеи- низации нуклеокапсида (стадии раздевания вириона) или выхода зрелых вирусных частиц из клетки-хозяина.

Далее а- и б-интерфероны (но не у-интерферон) акти­вируют один из генов, находящихся на 21-й хромосоме че­ловека. Продукт экспрессии этого гена — белок М_х — инги­бирует транскрипцию генома вируса гриппа (но не других вирусов!). Точный механизм ингибирования пока не рас­шифрован.

Общепринято, что система интерферона представляет собой один из основных факторов, обусловливающих вы­здоровление человека от вирусных инфекций. Например, при отсутствии осложнений больные гриппом выздорав­ливают обычно спустя 3 дня. В то же время иммунитет (даже обусловленный выработкой в организме иммуно­глобулинов класса IgM) развивается не ранее чем через 4-5 дней.

Справедливости ради необходимо отметить, что, не­смотря на то что система интерферона является довольно мощной (причем широко специфичной и поэтому, каза­лось бы, надежной) защитной системой клетки, некото­рым вирусам удается с легкостью преодолевать этот эше­лонированный защитный редут. Среди таких вирусов можно упомянуть вирус осповакцины, который в значи­тельной мере устойчив к действию интерферона. Исследо­вания показали, что эта устойчивость обусловлена тем, что вирус сам способен направлять синтез белка, по пер­вичной структуре гомологичного клеточному белку eIF2, и таким образом в значительной мере нивелировать действие интерферониндуцированной клеточной протеин- киназы.

Реовирусный капсидный белок оЗ экранирует молеку­лы двухцепочечных РНК, препятствуя активации РНК- активируемой протеинкиназы.

При транскрипции ДНК аденовирусов синтезируются две небольшие молекулы РНК, которые не кодируют ни­какой информации и обладают двухспиральной структу­рой. Эти короткие РНК прочно связываются с РНК-активируемой протеинкиназой, что ингибирует ее активность.

В цикле репликации вируса Эпштейна-Барр также есть такие короткие РНК, которые защищают вирус от действия интерферона.