Принципы диагностики
Клинико-лабораторные проявления аутоиммунной патологии очень разнообразны и зависят в первую очередь от органов и систем, подвергшихся аутоагрессии. Тем не менее существуют универсальные признаки, типичные для всех заболеваний данной этиологии. Если не касаться деталей, то механизмы, лежащие в основе патогенеза аутоиммунных заболеваний, идентичны таковым противоинфекционного иммунитета и направлены на формирование воспаления. Поэтому клинические проявления воспаления (повышение температуры тела, сосудистые реакции, нарушение самочувствия, снижение аппетита), а также изменения лабораторных показателей, характеризующих активность воспалительного процесса, определяются практически при всех формах этой патологии.
Неспецифические признаки аутоиммуных заболеваний. К неспецифическим лабораторным признакам воспаления (в том числе аутоиммунного) относятся изменения в общем анализе крови: повышение СОЭ, лейкоцитоз или лейкопения, сдвиг лейкоцитарной формулы влево с появлением юных форм лейкоцитов. Кроме того, у пациентов может наблюдаться повышение в крови концентрации C-реактивного белка и других БОФ. Следует отметить, что при органных поражениях, когда количество антигена небольшое, указанные лабораторные изменения могут отсутствовать или быть выражены незначительно, в то время как при системных аутоиммунных заболеваниях показатели острофазового ответа, как правило, существенно отклоняются от нормальных значений и могут быть использованы для мониторинга эффективности лечения.
Специфические диагностические маркеры аутоиммунного заболевания. Наиболее специфичными лабораторными маркерами АИЗ являются повышенные концентрации аутоантител. Содержание антител обычно определяют методом непрямой иммунофлюоресценции и методом иммуноферментного анализа, или иммуноблоттинга. Метод непрямой иммунофлюоресценции является наилучшим для определения антител к нерастворимым тканевым аутоантигенам. Причем в одном тесте можно определить антитела к нескольким мишеням, что делает его оптимальным методом для скрининга аутоантител. Чтобы идентифицировать антиген – мишень аутоантител, используется метод иммуноферментного анализа, или иммуноблоттинг.
Диагностическая значимость определения аутоантител
Ревматоидный фактор (РФ). Представляет собой гетерогенную группу аутоантител (классов IgM, IgG, IgА) к Fc-фрагменту IgG. Классический ревматоидный фактор (до 90% случаев) – антитела класса М против Fc-фрагментов IgG. Ревматоидный фактор не является строго специфичным тестом для диагностики ревматоидного артрита (РА). В высоком титре ревматоидный фактор выявляется при идиопатическом фиброзирующем альвеолите, синдроме Шегрена, других аутоиммунных заболеваниях, сопровождающихся поражением суставов, а кроме того, при инфекционном эндокардите и некоторых хронических заболеваниях печени. В низком титре (до 1:80) ревматоидного фактора можно выявить у 1–5% здоровых лиц моложе 60 лет. С возрастом количество человек, у которых выявляется ревматоидный фактор в низком титре, увеличивается и среди людей старше 80 лет достигает 30%.
При ревматоидном артрите ревматоидны фактор определяется у 60–80% пациентов (диагностическая чувствительность теста). Недостатком ревматоидного фактора в качестве диагностического маркера РА является его низкая специфичность, не превышающая 60–70%, а также то, что уровень ревматоидного фактора при ревматоидном артрите повышается только через 3–6 месяцев от начала заболевания.
Другим заболеванием, в диагностике которого ревматоидный фактор имеет большое значение, является синдром Шегрена (аутоиммунное поражение слюнных и слезных желез). При этом заболевании диагностическая чувствительность повышения ревматоидного фактора составляет 90–95%. В диагностике других аутоиммунных заболеваний ревматоидный фактор не играет существенной роли.
Антитела к цитруллинированным протеинам. Для ранней диагностики ревматоидного артрита большое значение имеет выявление антител к цитруллинированным белкам. Причиной появления антицитруллиновых антител при РА является воспаление синовиальной оболочки, в результате которого разные белки соединительной ткани (фибрин, виментин и другие пептиды) подвергаются модификации и в них образуется множество остатков цитруллина, которые становятся мишенью аутоантител. В семейство антицитруллиновых антител входят антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП, или anti-CCP, – от англ. anticyclic citrullinated peptide antibody), антитела к модифицированному цитруллинированному виментину (АМЦВ, или anti-MCV), а также антикератиновые антитела (АКА).
Определение АЦЦП благодаря высокой диагностической чувствительности и специфичности, близким к 95%, стало золотым стандартом диагностики ревматоидного артрита. Эти аутоантитела могут появляться в сыворотке крови за 1 год до начала заболевания, их встречаемость в дебюте ревматоидного артрита составляет 40–50%, что значительно выше чувствительности ревматоидного фактора, которая на ранних этапах заболевания не превышает 10–15%. Антитела АЦЦП не встречаются у здоровых лиц, а вероятность обнаружения АЦЦП при других воспалительных поражениях суставов не превышает 2–5% случаев.
Чувствительность и специфичность тестов АМЦВ и АЦЦП при диагностике ревматоидного артрита сопоставимы. Установлено, что АМЦВ могут быть выявлены за 10–15 лет до развития болезни. Поэтому положительный результат исследования на эти антитела не является достаточным критерием для постановки клинического диагноза РА. Наличие АМЦВ связано с развитием деструктивных изменений суставов и более быстрым прогрессированием РА. Концентрация АМЦВ более точно отражает активность заболевания, чем концентрация АЦЦП. При иммуносупрессивной терапии титр АМЦВ постепенно снижается, и результат анализа может стать отрицательным. Поэтому тест на АМЦВ может быть использован для контроля за лечением РА. При трактовке результатов исследования следует помнить, что АМЦВ могут быть обнаружены при СКВ, синдроме Шегрена и псориатическом артрите, а также некоторых других АИЗ. Антикератиновые антитела направлены против филаггрина – белка многослойного плоского эпителия, который в ходе синтеза подвергается цитруллинированию. Среди пациентов с установленным РА присутствие АКА ассоциировано с тяжестью эрозивных поражений суставов, риском быстрой инвалидизации и высокой концентрацией циркулирующих иммунных комплексов.
Антинуклеарные антитела (АНА). Выявление антинуклеарных (антиядерных) антител представляет незаменимый инструмент ранней диагностики и идентификации аутоиммунных заболеваний соединительной ткани. Установлено, что частота выявления АНА при СКВ составляет 95%, лекарственном волчаночном синдроме – 100%, недифференцированном (смешанном) заболевании соединительной ткани (синдроме Шарпа) – 95%, системной склеродермии – 70–90%, CREST-синдроме – 60–90%, первичном синдроме Шегрена – 70%, ревматоидном артрите – 40–50%.
Антинуклеарные антитела могут быть обнаружены при множестве других АИЗ, не относящихся к системным (идиопатическом фиброзирующем альвеолите, аутоиммунном гастрите, неспецифическом язвенном колите, хроническом активном гепатите, мембранозной нефропатии, миастении, гемолитической анемии), а также при тяжелых инфекционных заболеваниях (гистоплазмозе, туберкулезе, инфекционном моно нуклеозе) и онкологической патологии.
Следует помнить, что у клинически здоровых людей частота встречаемости АНА достигает 1–5% и увеличивается с возрастом. Также более высокая вероятность выявления АНА у людей с аутоиммунными заболеваниями в семейном анамнезе. Антинуклеарные антитела входят в семейство аутоантител, насчитывающих более 200 антигенных специфичностей и реагирующих с нуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними белками.
Термином антинуклеарный фактор (АНФ) обозначают тест для выявления антинуклеарных антител с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции. Этот тест является «золотым стандартом» диагностики, поскольку позволяет определить максимальный спектр антинуклеарных антител и установить их количество. Кроме того, с помощью данной методики можно выявить расположение мишеней антинуклеарных антител в клетке и оценить аффинность антител. Учитывая ее высокую чувствительность, нередко проводят равенство между присутствием АНА в крови пациентов и положительным результатом АНФ. В норме титр АНФ составляет менее 1/80. Пограничные титры АНФ 1/80–1/160 изредка могут отмечаться у клинически здоровых лиц. Высокие титры АНФ (более 1/320) с большей вероятностью свидетельствуют о системном АИЗ.
Антигены, к которым образуются АНА, можно разделить на две группы:
- истинные ядерные антигены: двуспиральная ДНК, односпиральная ДНК, гистоны, ядерная РНК;
- экстрагируемые ядерные (Extractible Nuclear Antigen): Ro/SS-A, La/SS-B, Sm, U1-RNP, Scl-70 и Jo-1 (диагностическая значимость определения антител к указанным антигенам представлена в табл. 17).
Иногда выделяют третью группу – цитоплазматические анти гены, к которым относят Ro/SS-A, La/SS-B и Jo-1, поскольку они могут локализоваться как в ядрах, так и в цитоплазме. Название экстрагируемые ядерные (нуклеарные) антигены (ЭНА) объединяет фракцию растворимых ядерных белков, в состав которой входят шесть основных, указанных выше, а также ряд других минорных антигенов.
Нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК) водонерастворимы и отрицательно заряжены, поэтому в состав экстрагируемых ядерных антигенов не входят. Для выявления антител к ДНК и РНК используют ИФА. Антитела к двуспиральной (нативной) ДНК (дсДНК) являются высокоспецифичным маркером СКВ – обнаруживаются у 50–70% пациентов и практически не выявляются при других заболеваниях. Наличие антител к дсДНК наряду с антителами к Sm-антигену и кардиолипину составляют 10-й диагностический критерий СКВ Американского колледжа ревматологов. Антитела к дсДНК следует отличать от антител к односпиральной или денатурированной ДНК, так как последние самостоятельного диагностического значения не имеют и могут появляться на фоне вирусных и бактериальных инфекций.
Таблица 17. Частота выявления разных видов АНА при аутоиммунных заболеваниях
LE-клетки (волчаночные клетки). LE-клетки (от англ. Lupus Erythematosus cells) – это нейтрофилы или моноциты, имеющие в цитоплазме крупные включения, которые образовались в результате фагоцитоза ядер разрушенных клеток, опсонизированных антинуклеарными антителами. LE-клетки следует рассматривать в качестве вторичного показателя, указывающего на наличие антинуклеарных антител.
В норме LE-клетки в крови отсутствуют. Результат считается положительным при наличии в препарате ≥ 5 LE-клеток на 1000 лейкоцитов. LE-клетки могут выявляться в плевральном, перикардиальном, перитонеальном выпотах, синовиальной и спинномозговой жидкостях. LE-феномен не является ранним диагностическим критерием СКВ, примерно у 35% пациентов в дебюте заболевания LE-клетки не определяются. Отсутствие их не исключает СКВ.
Трудоемкая методика определения LE-клеток и низкая чувствительность теста не позволяют ему на равных конкурировать с другими диагностическими методами. В настоящее время вместо теста на выявление LE-клеток в большинстве лабораторий используются серологические методы обнаружения антинуклеарных антител к определенным ядерным антигенам.
Антитела к цитоплазме нейтрофилов (АНЦА, в английском варианте – ANCA). В литературе применяется термин «АНЦА-ассоциированные заболевания», к которым относят гранулематозные васкулиты (АНЦА-ассоциированные васкулиты), а в последнее время воспалительные заболевания кишечника (неспецифический язвенный колит (НЯК) и болезнь Крона). В результате действия антинейтрофильных антител происходит преждевременная дегрануляция активированных нейтрофилов – это нарушает трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов из сосудистого русла и приводит к образованию воспалительных гранулем, ассоциированных с мелкими сосудами, что и является морфологической картиной гранулематозных васкулитов.
По локализации антигенов – мишеней аутоантител, определяемой с помощью иммунофлюоресцентного анализа, все АНЦА делят на три группы:
- цитоплазматические АНЦА (цАНЦА, или англ. cANCA), иногда их называют еще классические АНЦА – наблюдается диффузное свечение цитоплазмы нейтрофилов;
- перинуклеарные АНЦА (пАНЦА) – наблюдается околоядерное свечение;
- атипичные АНЦА (аАНЦА) – невозможно четко определить локализацию свечения.
Мишенью цАНЦА является протеиназа-3. Обнаружение цАНЦА (антител к протеиназе-3) с высокой специфичностью (90%) может свидетельствовать о наличии у пациента гранулематоза Вегенера. Реже такая находка встречается при микроскопическом полиангиите (40–50%), узелковом периартериите (5–10%). Перинуклеарные АНЦА в подавляющем большинстве случаев (90%) вырабатываются к миелопероксидазе (МРО), гораздо реже мишенью этих антител является эластаза, катепсин G, лактоферрин или другие белки.
Антитела к МРО являются важнейшим маркером такого тяжелого заболевания, как быстро прогрессирующий нефритический синдром (65–75%). Также с высокой частотой они выявляются у пациентов с синдромом Черджа – Стросса (70–80%), при микроскопическом полиангиите (40–50%), синдроме Гудпасчера (20–30%), реже – при узелковом периартериите (5–10%). Для атипичных АНЦА белки-мишени неизвестны, но в некоторых случаях они те же, что и для пАНЦА. Нетипичные варианты АНЦА с наибольшей частотой выявляются при НЯК (70%), аутоиммунном гепатите (50%), первичном склерозирующем холангите (40%), гораздо реже – при болезни Крона (10%), первичном билиарном циррозе (5%) и васкулитах при ревматоидном артрите (5–10%).
При решении вопроса об отнесении в группу (цАНЦА, пАНЦА или аАНЦА) на основании визуального анализа результатов иммунофлюоресцентного анализа могут возникать трудности, поэтому рекомендуется для уточнения и дифференциального диагноза дополнительно использовать ИФА с очищенными антигенами протеиназы-3 (PR3) и миелопероксидазы. Отсутствие аутоантител к МРО и PR3 при наличии антинуклеарных антител может использоваться для дифференциальной диагностики АНЦА-ассоциированных васкулитов и васкулитов при СКВ. Кроме того, уровни анти-PR3 и анти-МРО антител коррелируют с клиническим статусом – они высоки в активную стадию заболеваний, уменьшаются и становятся ниже чувствительности метода определения во время ремиссии, что может использоваться для оценки эффективности проводимой терапии.
В дифференциальной диагностике воспалительных заболеваний кишечника кроме определения антител к цитоплазме нейтрофилов (АНЦА) важным является определение антител к дрожжам Saccharomyces cerevisiae (ASCA). Неспецифический язвенный колит в отличие от болезни Крона близок по патогенезу к гранулематозным васкулитам, что позволяет использовать выявление АНЦА в качестве основного иммунологического метода диагностики НЯК. Основным лабораторным маркером болезни Крона являются ASCA. Специфичность теста – 95–100%. Диагностическая чувствительность ASCA для болезни Крона составляет 60–70%, тогда как для НЯК – 5–10%.
Учитывая близость симптоматики воспалительных заболеваний кишечника, целесообразно использовать оба серологических маркера совместно, что обеспечивает специфичность, достигающую 95–98% в дифференциальной диагностике этих заболеваний. Так, при выявлении только АНЦА следует думать о НЯК; в случае, когда определяются только ASCA, – о болезни Крона. При выявлении обоих разновидностей антител (АНЦА и ASCA) правомочен диагноз «недифференцированный колит», возможно требующий дополнительных диагностических мероприятий. При наличии соответствующей клинической картины и отсутствии ASCA и АНЦА вероятна инфекционная, токсическая, метаболическая или онкологическая причина колита или это является признаком ремиссии воспалительного заболевания кишечника.
Несмотря на высокую вероятность определения АНЦА при синдроме Гудпасчера, основным методом лабораторной диагностики этого заболевания является определение методом иммунофлюоресцентного анализа антител к базальной мембране капилляров клубочков почек и альвеол. Васкулиты средних и крупных сосудов не имеют специфических серологических маркеров, в отличие от гранулематозных васкулитов мелких сосудов (АНЦА-ассоциированных васкулитов). Одной из причин воспаления стенки крупных и средних сосудов является индукция антител к эндотелию. Антиэндотелиальные антитела (АЭА), например, отмечаются у 90% пациентов с болезнью Кавасаки, у 70–80% пациентов – при аортоартериите Такаясу, причем их содержание коррелирует с активностью васкулитов. Антитела к эндотелию также могут определяться у лиц с активной формой АНЦА-ассоциированных васкулитов, у детей с пурпурой Шенлейна – Геноха и при некоторых других васкулитах. Таким образом, выявление АЭА неспецифично для определенной формы васкулита и рассматривается в качестве общего диагностического маркера этих заболеваний. Концентрация АЭА напрямую связана с активностью воспалительного процесса, поэтому определение этих антител можно использовать для мониторинга терапии системных васкулитов.
Антифосфолипидные антитела. Антифосфолипидный синдром (АФС), связанный с появлением антифосфолипидных антител, представляет собой наиболее частое иммуноопосредованное нарушение коагуляции, которое проявляется рецидивирующими артериальными и (или) венозными тромбозами, акушерской патологией (чаще всего хроническим невынашиванием беременности) и тромбоцитопенией. АФС является моделью аутоиммунного тромбоза и относится к приобретенным тромбофилиям. Вторичный АФС чаще всего ассоциирован с СКВ.
К антифосфолипидным антителам относят антитела к кардиолипину, антитела к β 2 -гликопротеину и волчаночный антикоагулянт. Основной мишенью антикардиолипиновых антител (IgG и IgM) является неоантиген, образующийся при взаимодействии кардиолипина (фосфолипида) и сывороточного белка β 2 -гликопротеина, который является естественным антикоагулянтом. Волчаночный антикоагулянт представляет собой IgG к фосфолипидам, которые играют большую роль в тромбообразовании. Выявление волчаночного антикоагулянта служит коагулологическим тестом.
Наличие антител к β 2 -гликопротеину и кардиолипину является международным лабораторным диагностическим критерием АФС (2006), а совместно с антителами к двуспиральной ДНК и Sm-антигену – критерием СКВ. IgG и (или) IgM к кардиолипину выявляются у 20–50% пациентов с СКВ и 3–20% лиц с другими системными АИЗ.
Аутоантитела к компонентам клеток определенных тканей и органов. При диагностике ряда органоспецифических заболеваний играет роль обнаружение аутоантител к компонентам некоторых тканей и органов:
- при первичной надпочечниковой недостаточности – антител к клеткам коры надпочечников;
- первичном биллиарном циррозе – антител к митохондриям;
- хроническом активном гепатите – антител к гладкомышечным клеткам;
- СКВ с поражением ЦНС – антител к нейронам и P-белку рибосом;
- аутоиммунном гастрите – антител к обкладочным клеткам;
- диффузном токсическом зобе и хроническом лимфоцитарном тиреоидите – антител к микросомальным антигенам щитовидной железы;
- целиакии – антител к тканевой трансглутаминазе, эндомизию и ретикулину.
Наилучшие клинико-лабораторные характеристики имеет тест выявления антител к эндомизию класса IgA, которые отмечаются у 95% пациентов с целиакией. В заключение следует отметить, что высокий титр аутоантител важный, но не обладающий 100% диагностической надежностью признак аутоиммунного заболевания.
Другие тесты, используемые при диагностике аутоиммунных заболеваний
При АИЗ могут определяться самые разнообразные изменения лабораторных показателей. Их спектр и направленность в первую очередь зависит от органов и систем, вовлеченных в патологический процесс. Анализ этих изменений помогает в проведении дифференциальной диагностики конкретных заболеваний. Кроме определения аутоантител при проведении лабораторной диагностики аутоиммунного заболевания могут быть полезны оценка состояния системы комплемента, обследование на наличие криоглобулинов, HLA-типирование.
Система комплемента. Система комплемента практически всегда вовлекается в иммунный ответ, поэтому оценка ее состояния помогает уточнить стадию и этиологию заболевания. С этой целью можно использовать определение гемолитической активности комплемента (CH50). Снижение CH50 свидетельствует:
- об активации комплемента на момент проведения исследования либо произошедшей не ранее чем за двое суток до исследования;
- системном аутоиммунном заболевании в активном периоде, сопровождающемся системным васкулитом;
- наследственной недостаточности комплемента.
Наследственный дефицит С1-, С2- и С4- компонентов комплемента, участвующих в активации СК по классическому пути, приводит к нарушению клиренса апоптотических клеток и иммунных комплексов и ассоциирован с развитием и более тяжелым течением СКВ. CH50 может возрастать при псориатическом артрите, анкилозирующем спондилите, синдроме Рейтера, артритах, сопровождающих хронические воспалительные заболевания кишечника.
Криоглобулины. Криоглобулины представляют собой свободные или входящие в состав иммунных комплексов иммуноглобулины, которые при снижении температуры ниже 37 °С преципитируют.
Смешанная криоглобулинемия характерна для васкулитов. Чаще всего определяется при изолированном поражении мелких сосудов кожи конечностей, подверженных действию холода. При низкой температуре утратившие растворимость иммунные комплексы оседают на эндотелии и активируют комплемент, что приводит к развитию васкулита.
Кроме того, уровень поликлональных криоглобулинов может быть повышенным при аутоиммунных заболеваниях (СКВ, узелковом периартериите, синдроме Шегрена и болезни Кавасаки), гепатитах A, B, C, гемобластозах, хронических инфекциях и саркоидозе. В этих случаях провоцируемые холодом проявления васкулита сопутствуют симптомам основного заболевания.
Моноклональная криоглобулинемия (наличие криоглобулинов одинаковой специфичности – моноклональных антител) развивается на фоне множественной миеломы и ее разновидностей, в частности макроглобулинемии Вальденстрема, связанной с избыточным синтезом моноклонального криоглобулина класса IgM.
Антигены системы HLA. В настоящее время HLA-типирование становится рутинным методом, однако для диагностики АИЗ в клинической практике реальную значимость имеет только определение экспрессии HLA-В27. В европейской популяции частота встречаемости этого антигена составляет 5–7%. У пациентов с анкилозирующим спондилитом HLA-B27 определяется в 95–100% случаев, при синдроме Рейтера – в 40%, при хроническом переднем увеите – в 25%, при псориатическом артрите с поражением позвоночника – в 11%. Относительный риск развития заболевания в зависимости от экспрессируемых антигенов системы HLA представлен в табл. 18.
Таблица 18. Ассоциации некоторых заболеваний с системой HLA
В некоторых частных случаях при проведении дифференциальной диагностики может быть полезным определение DQ2 и DQ8. Выявление у пациента гаплотипа HLA-DQ2/DQ8 в сочетании с антителами к тканевой трансглутаминазе позволяет с чувствительностью 98,8% и специфичностью 96,2% установить диагноз целиакии.