Биотехнология и конструирование рекомбинантных ДНК

5.2. Биотехнология рекомбинантных ДНК

5.3. Конструирование рекомбинантной ДНК

Биотехнология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК включает набор как новых методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширя­ют возможности генетических исследований. Используя техноло­гию рекомбинантных ДНК, получают даже минорные клеточные белки в больших количествах и проводят тонкие биохимические исследования структуры и функций белков, а также осуществля­ют детальный химический анализ генетического материала. К наи­более важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК сле­дует отнести следующие:

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различиных генов и манипуляции с ними.
2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида;
3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания.
4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.
5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки или организмы.

Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное все действие на всю клеточную биологию, позволяя решать такие задачи, как определение строения и функций не только белков, но и индивидуальных доменов, а также расшифровывать механизмы регуляции экспрессии генов, получать многие белки, участвую­щие в регуляции обменных процессов, клеточной пролиферации и развитии организма.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных пос­ледовательностей осуществляется особыми ферментами — рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужерод­ную ДНК. Все ферменты условно можно разделить на следующие группы:

• 1. используемые для получения фрагментов ДНК;
  2. синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК;
  3. соединяющие фрагменты ДНК;
  4. позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК;
  5. применяемые для приготовления гибридизационных проб.

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4 —6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме бакте­рий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз.

Согласно номенклатуре, предло­женной Х.Смитом и Д.Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает ро­довое название, две последующие — первые буквы вида. Например, фер­мент из Е. coli обозначают как Есо или из Haemophilus influenzae — Hin и т.д. Типовая или штаммовая иденти­фикация следует за родовидовой, на­пример, EcoRI или Hindll и т.д. В на­стоящее время различные фирмы вы­пускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молеку­лы ДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых рестрикций ДНК тремя рестриктазами (или рестриктами с тупыми либо липкими концами (рис. 5.1).

Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагменте коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (лип­кие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любых, фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК (любо­го происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазмиды или бактериального вируса.

Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соот­ветствующего участка генома набором рестриктаз позволяет по­строить рестрикционную карту, отражающую расположение оп­ределенной последовательности нуклеотидов в данном участке Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии междотдельными генами (участками) без определения их нуклеотид ной последовательности. Рестрикционные карты важны для кло­нирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических за­дач.

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определить последовательность нуклеотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее время объем информации о последовательностях ДНК столь велик, что для хранения и анализа данных о фрагментах, целых геномах необходимы новые технологии и компьютерная техника.

В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и фермен­тативный. Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполне­нии й результативны. Результаты секвенирования позволяют так­же на основе генетического кода определить аминокислотную пос­ледовательность белка в соответствии с нуклеотидной последо­вательностью в соответствующем гене.

На рис. 5.2 представлена схема химического метода секвенирования ДНК. Исходный фраг­мент ДНК, меченный 32Р по 5′-концу, подвергается специфи­ческому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются радиоактивные фрагменты раз­ной длины, которые разделяются по размерам при гель-электро­форезе, а радиоактивные из них выявляются с помощью радиоавто­графии.

Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняет­ся одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использо­ванием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А). Полученные образцы подвергают элек­трофорезу на параллельных дорожках одного геля, и по его ре­зультатам можно определить нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 5.3).

Ферментативный метод секвенирования основан на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь (рис. 5.4). В этом случае обычно используют дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-3′-ОН, представ­ленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифици­рованный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК- полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез in vitro молекулы ДНК в присутствии затравки (праймера) и небольшого количества одного из таких модифицирован­ных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде «лесенки». Если для получения таких фрагментов применять мече­ную ДНК (обычно проводят четыре реакции синтеза с использо­ванием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электрофоретический анализ проводить на четырех дорожках геля, то мож­но определить последовательность нуклеотидов. В настоящее вре­мя используют модифицированный метод, сводящийся к флуо­ресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе дви­жения по одной дорожке геля.

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 °С в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары основа­ний разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдер­живание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»). Это свойство ДНК широко используют в химической систематике, а также для ре­шения эволюционных и филогенетических проблем.

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали за­висит от вероятности столкновения двух комплементарных нуклеотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определе­ния концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо хими­ческим путем, метят по 32Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочечную молекулу ДНК, используемую в данном методе в качестве меченого индикатора, называют ДНК-зондом. Разме­ры его варьируют от нескольких десятков до нескольких сотен и тысяч нуклеотидов. Реакция гибридизации с использованием ДНК-зондов позволяет идентифицировать нуклеотидные после­довательности в очень низкой концентрации и тем самым определять, какое ко­личество копий последовательности ДНК, комплементарной ДНК- зонду, присутствует в геноме клетки.

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов; в реакциях гибридизации с РНК — для выявления экспрессии дан­ного гена в различных клетках. Для выявления молекул нуклеино­вых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК- зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позво­ляет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, спо­собных автоматически синтезировать любые нуклеотидные пос­ледовательности за короткий промежуток времени, дало возмож­ность перестраивать гены, что представляет собой один из важ­ных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. coli. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющей­ся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два боль­ших класса: общую рекомбинацию и сайт-специфическую реком­бинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными после­довательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скре­щивании и перегруппировке генов у бактерий.

В процессе сайт-специфической рекомбинации в обмен вступа­ют короткие специфические нуклеотидные последовательности одной и той же или обеих спиралей ДНК, распознаваемые осо­бым сайт-специфическим ферментом, что приводит к трансфор­мации распределения нуклеотидных последовательностей в гено­ме. Любые комплементарные взаимодействия между двумя гомо­логичными спиралями ДНК возможны лишь тогда, когда в одной из двух цепей происходит разрыв. К числу факторов, вызывающих такие одноцепочечные разрывы, относят: химические агенты, не­которые виды излучения, специфические белки. Например, у Е. coli обнаружен белок rec BCD, который вызывает в молекулах ДНК одноцепочечные разрывы. Белок rec BCD представляет собой ДНК- зависимую АТРазу, которая действует как ДНК-хеликаза, пере­мещающаяся по спирали ДНК и вызывающая ее расплетение. Под влиянием этого белка, обладающего нуклеазной и хеликазной ак­тивностью, на двойной спирали ДНК возникает разрыв с образо­ванием одноцепочечного участка «ус» (whisker) (рис. 5.5).

Белок rec BCD присоединяется к двойной спирали ДНК с од­ного конца (5′) и со скоростью около 300 нуклеотидов в секунду движется вдоль спирали ДНК за счет гидролиза АТР. Одновремен­но с белком движется и возникшая петля ДНК. Когда петля на спирали достигает участка, называемого сайтом узнавания (recogni­tion site), одна из цепей разрывается с освобождением небольшо­го одноцепочечного участка «ус». Возникший «ус» инициирует даль­нейшую генетическую рекомбинацию.

В процессе общей генетической рекомбинации центральная роль отводится комплементарным взаимодействиям нуклеотидных последовательностей. Кроме того, этот процесс требует уча­стия особого белка гесА с Mr, равной 38 кДа. Белок гесА прочно связывается в виде крупных кластеров с одиночными цепями ДНК, одновременно удерживая и двойную спираль. За счет двух сайтов данный белок имеет еще один участок — для связывания и гидролиза АТР, т.е. он представляет собой ДНК-зависимую АТРазу. Благодаря особенностям белка гесА осуществляются одноцепочечный обмен между двумя двойными спиралями (рис. 5.6) с удалением некоторого количества нуклеотидов и локальный ресинтез ДНК.

Разрыв в одной из цепей ДНК высвобождает эту цепь, и он внедряется во вторую спираль, образуя короткий спаренный участок. После начального обмена гомологичные нуклеотидные последовательности двух взаимодействующих спиралей устанавливаются в строго соответствии одна с другой, в связи, с чем происходит расширение области спаривания и быстрый обмен между спиралями. Для этого процесса, разные организмы используют неодинаковые механизмы, большинство из которых включает в качестве промежуточного этапа обмен с перекрещиванием цепей между двумя спиралями ДНК (рис. 5.7).

Структура, образующаяся при обмене с перекрещиванием цепей, содержит две перекрещенные и две неперекрещенные цепи. Она способна существовать в различных изомерных формах. Изомеризация меняет положение двух пар цепей: две ранее прекрещивающиеся цепи становятся неперекрещивающимися и наоборот.

Для того чтобы восстановили две отдельные спирали ДНК и тем самым прекратился процесс спаривания, в каждой из двух перекрещённых цепей должен произойти разрыв (рис. 5.8). В случае изомеризации одной из цепей (поворота на 180°) раз­рыв перекрещенных цепей дает две кроссоверные хромосомы (рис. 5.9).

5.3. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК

Сущность генетической инженерии сводится к целенаправ­ленному конструированию генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом ре­комбинантные ДНК становятся составной частью генетическо­го аппарата реципиентного организма и, кроме того, они при­вносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. К числу таких свойств можно отнести синтез аминокислот и белков, гормонов, ферментов, ви­таминов и др.

Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены осуществляют двумя основными методами:
а) по «липким» концам;
б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов

Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «липким» концам, т.е. взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4—6 пар нуклетидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лигазой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи межсоседними нуклеотидами:

При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшива­емых фрагментов их достраивают, т. е. синтезируют искусствен­но ферментативным путем. Для этой цели применяют так назы­ваемые линкеры (или «переходники») — короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы:

Линкерные фрагменты не татько обеспечивают объединение ге­нов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем часто в середину линкера помешают какой-либо регуляторный генетиче­ский элемент, например промотор, или участок связывания с ри­босомой.

Возможно сшивание фрагментов и по тупым концам, когда концы фрагментов двунитевые:

В этом случае реакция лигирования имеет биохимические особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по «лип­ким» концам.

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в жи­вые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведе­нию, ее разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического ап­парата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные ак­цептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны об­ладать следующими особенностями:

1. иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции;
2. иметь свойства репликона;
3. содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, сви­детельствующий о присутствии вектора.

В частности, для бактериальных векторов в качестве маркер­ных генов чаще всего используются гены, вызывающие устойчи­вость клеток к некоторым антибиотикам.

Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроенных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клет­ки и т.д. Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов исполь­зуют плазмиды. Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), стабильно насле­дуемые. Они представляют собой двуцепочечные кольцевые моле­кулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. По разме­ру они соответствуют 1 — 3 % генома бактериальной клетки. Так, молекулярная масса одной из самых мелких плазмид, найденных у Е. coli, составляет 1,5 МДа, а клетки псевдомонад содержат плаз­миды с Mr около 300 МДа, что составляет 15 % от Mr хромосом этих бактерий. Плазмиды разделяют на конъюгативные, способ­ные сами перенестись в реципиентные клетки с помощью конъю­гации, и не конъюгативные, не обладающие этим свойством. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плаз­миды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. coli. Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis. F- плазмида Е. coli или FP-плазмиды псевдомонад являются поло­выми факторами. Плазмида pS 101 с Mr 5,8 МДа несет ген устой­чивости к тетрациклину (селективный маркер). У различных мик­роорганизмов — Е. coli, Salmonella, Bacillus, Saccharomyces обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез разных колицинов — высокоспецифических антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов микроорганизмов того же вида или родственных видов. Количество плазмид в клетке может коле­баться от одной до более ста. В целом, чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке.

Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. coli R6_5 с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, от­носящаяся к группе колициногенных плазмид Е. coli. Col El реп­лицируется независимо от хромосомы и присутствует в количе­стве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благо­даря селективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. coli.

Плазмида ColEl(Mr4,2 МДа) применяется для клонирова­ния EcoRl-фрагментов. При этом интеграция чужеродного фраг­мента в участок узнавания EcoRIведет к фенотипическому изме­нению клетки, прекращению синтеза колицина с сохранением иммунности к нему. Этот признак используют при отборе реком­бинантных трансформантов.

Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз: EcoRI, Hindlll, BamHI, Sail, Xmal и Hpal. Конструируя рекомбинантную ДНК, в эти участки можно встра­ивать фрагменты чужеродной ДНК, полученные с помощью со­ответствующих рестриктаз. На рис. 5.10 изображена схема распо­ложения генов в плазмиде pBR322. Плазмида pBR322 содержит два гена, программирующих устойчивость к двум различным ан­тибиотикам — тетрациклину (ген tet) и ампициллину (ген blа). В гене tet находятся уникальные участки расщепления рестриктазами Hindlll, BamHI и SalI, а в гене bla — участок расщепления PstI. Если разрезать плазмиду любой из рестриктаз, участок расщепле­ния которой находится в гене tet, и соединить ее методом «лип­ких» концов с чужеродным фрагментом ДНК, то в полученной рекомбинантной молекуле останется нетронутым только ген bla, а ген tet утрачивает свою активность, так как его целостность на­рушается вставкой. Напротив, при разрезании плазмиды рестриктазой Pstl и внедрении в этот участок фрагмента ДНК инактивируется ген blа, тогда как ген tet продолжает кодировать белок, обеспечивающий устойчивость Е. coli к тетрациклину. Плазмидные векторы в настоящее время чрезвычайно разнообразны за счет следующих свойств:

• уменьшения размеров плазмиды вследствие изъятия участков, не обязательных для репликации (чем больше плазмида содержит уникальных участков узнавания для рестриктаз, тем она универ­сальнее);
• гибридизации векторов одного рода с другими векторами или природными плазмидами (например, получены гибридные векторы комбинацией плазмиды и фага X (при этом вновь сконструиро­ванная рекомбинантная ДНК должна сохранить репликационные свойства исходной плазмиды);
• использования новых плазмид;
• применения транспозонов;
• создания векторов с генетическими маркерами, позволяющи­ми вести отбор рекомбинантных клонов.

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное при­менение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы — дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, напри­мер бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве век­торов применяют сконструированные производные фага лямбда и фа­гов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага лямбда используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке. Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага лямбда в качестве вектора.

Фаг М13 — это одноцепочечная циклическая ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одноцепочечная ДНК фага превращается в двуцепочечную репликативную форму (RF), которая подобна плазмиде. Фаговая ДНК содержит, кроме того, короткий участок из 500 нуклеотидов, на­званный как МП (межгенная последовательность), не существен­ный для ее жизнедеятельности. Именно в этот участок МП репликативной формы ДНК после расщепления ее с помощью лигазы вставляют чужеродную ДНК. Введение рекомбинантной двуцепочечной молекулы в клетку Е. coli приводит к ее репликации, син­тезу (+) цепи, упаковке последней в белковый чехол и выделе­нию фага в среду. Инфицированная нитевидным фагом клетка про­должает делиться, выделяя в окружающую среду большое коли­чество фага. Этот фаг содержит в вирионе одноцепочечную циклическую ДНК, в которую встроена одна из цепей чужеродной ДНК.

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (или химернымиi); плазмидами (или фагами).

Одним из типов гибридных векторов служат космиды (Cos- сайт), которые, используя плазмидный тип репликации, облада­ют способностью упаковываться in vitro в оболочки частиц фага. Космида содержит принадлежащие плазмидной ДНК уникальные эндонуклеазные сайты и селективные маркеры, объединенные с сегментом ДНК фага за счет «липких» концов. Примером может служить космида, сконструированная на основе фага X и плазми­ды EcoRI. Cos-сегменты фага X получают путем расщепления конкатемерной ДНК фага (конкатемер — предшественник упаковки вирусной ДНК в зрелые фаговые частицы) соответствующими эндонуклеазами. Эти сегменты включают в плазмидный вектор. Большинство космидных векторов для клонирования способны включать вставки ДНК размером до 45 тыс. п.н. Реципиентные клетки-хозяева более эффективно инфицируются космидами, чем при использовании плазмидной ДНК. На 1 мкгДНК с Cos-сай­тами можно получить от 1 • 10⁴ до 5 • 10⁵ колоний трансформиро­ванных клеток. В клетке-хозяине старая ДНК трансформируется и сохраняется в виде плазмиды.

Другой представитель гибридных векторов — фазмиды. Это дуплексные молекулы ДНК, у которых концы представляют собой сайты фага Х_у содержащие гены, необходимые для осуществ­ления лизиса клетки, а средняя часть является линеаризованной плазмидой. В фазмидах полностью сохранены функции реплика­ции как фага, так и плазмиды. Фазмида содержит несколько тан­демных повторов сегмента плазмиды для обеспечивания успеш­ной упаковки ДНК и замены в ней вставок в процессе конструи­рования рек-молекул. Фазмидные ДНК упаковываются in vitro перед инфекцией. В клетке-хозяине фазмида реплицируется как фаговая ДНК. При наличии в векторной молекуле гена, кодиру­ющего репрессор фага X, фазмида реплицируется как плазмида. Примечательно, если ген кодирует мутантный белок cl, инакти­вирующийся при повышенной температуре, то фазмида способ­на реплицироваться как плазмида при низкой температуре и как фаг при повышении температуры до 42 °С.

Векторы на основе плазмид и фагов способны реплицировать­ся в клетках разных хозяев в отличие от обычных плазмид и бак­териофагов, эволюционирующих синхронно с природными «хо­зяевами». Реплицирование с использованием гибридного векто­ра осуществить значительно проще в клетках как природного, так и альтернативного хозяина. Челночные векторы содержат две области ДНК, соответствующие каждому из двух видов хозяев, а также гены, необходимые для репликации и не поставляемые клетками хозяина. Число векторов, сконструированных с помо­щью технологии рекомбинантных ДНК, довольно велико. Одни из таких векторов способны действовать попеременно в клетках двух разных видов прокариот, другие — как в прокариотической (чаще E.coli), так и в эукариотической клетке (дрожжевых, рас­тительных, животных).

После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную o6paботку клеток соединениями, обусловливающими проникновении ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком.

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий СаС12 их мем­брана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэто­му среди бактерий, подвергшихся трансформации, только неболь­шая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от об­щей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клони­рования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бакте­рий на 1 см2 поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой коло­нии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки кото­рого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бак­терий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тет­рациклин в зависимости от того, какой из генов (blа или tet) ос­тался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой сре­де клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона пере­носят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген ус­тойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, кото­рые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчиво­сти к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии.

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Но чаще приходится идентифици­ровать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации. С этой целью бактериальные колонии вы­ращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чаш­ку Петри с питательной средой. Далее приготовляют реплики: к Фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцеллюлозный фильтр, который затем переносят на чашку Петри с плотной питательной средой, где образуются колонии, идентичные первым.

Затем фильтр-реплику подвергают щелочной обработке, при этом клетки в колониях лизируют и денатурированная ДНК из клеток связывается с нитроцеллюлозой в том участке, где былс. расположена соответствующая колония. При радиоактивной ДНК или РНК (меченной 32Р или 125J) выдерживание фильтра в растворе, содержащем радиоактивный полинуклеотид, приводит гибридизации с комплементарными последовательностями. В ито­ге те участки фильтра, в которых находились рекомбинантны клоны с требуемой вставкой, оказываются радиоактивными и идентифицируются радиоавтографически.