24

Генетическая инженерия. Основы, история, биотехнология

Генетическая инженерия. Основы, история, биотехнология

5.1. История развития генетической инженерии

5.2. Биотехнология рекомбинантных ДНК

5.3. Конструирование рекомбинантной ДНК

5.4. Экспрессия чужеродных генов

5.5. Клонирование и экспрессия генов в различных организмах

5.6. Использование генетической инженерии в животноводстве

5.7. Получение инсулина на основе методов генетической инженерии

5.8. Синтез соматотропина

5.9. Получение интерферонов

5.10. Генная инженерия растений

 

5.1. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Генетическая инженерия — ветвь молекулярной генетики, ис­следующая возможности и способы создания лабораторным пу­тем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введени­ем в живой организм. Обычно употребляют два названия данного научного направления — генетическая инженерия и генная инже­нерия, являющиеся как бы синонимами. Однако их смысловое со­держание неодинаково: генетическую инженерию связывают с ге­нетикой, а генная имеет отношение только к генам. Кроме того, генетическая инженерия точнее раскрывает содержание дисцип­лины — создание генетических программ, основная задача кото­рых — создание in vitro молекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях чаще не со­четаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чу­жеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя гене­тические элементы. Согласно определению национальных институ­тов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке». Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, биохимии нуклеиновых кислот и др. Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П. Бергом с сотр.) и была со­ставлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бакте­риофага X dvgal с галактозным опероном Е. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

Генетическая инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала с самых первых своих шагов. Начало этим событиям положило послание участни­ков Гордоновской конференции (1973) президиуму АН США, в котором говорилось о возможной опасности технологий рекомбинантных ДНК для здоровья человека. Возможные блага генети­ческой инженерии признавались с самого начала, но разногла­сия по данной проблеме не затихли и сейчас. В табл. 5.1 перечисле­ны основные этапы становления и развития генетической инже­нерии.

Таблица 5.1 Основные этапы развития генетической инженерии

5.4. ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ

Эффективность функционирования бактериальных генов не одинакова, что обусловливает вариабельность концентрации от­дельных белков в зависимости от их функций. Такие вариаций белков, например у Е. coli, обусловлены системой контроля ген ной экспрессии, осуществляемой в основном на уровне транскрипции ДНК, и зависят от количества синтезируемой на данном гене мРНК и активности фермента РНК-полимеразы. Порядок чередовании нуклеотидных последовательностей в промоторном участке структурного гена определяет степень активности РНК- полимеразы и инициацию процесса транскрипции. Бактериальные гены, включенные в геном, как правило, экспрессируются достаточно легко, давая мРНК и белок в силу того, что в сигнальных последовательностях, управляющих процессами транскрипции и трансляции у различных прокариотических организмов, много общих черт. Что касается экспрессии генов эукариот бактериях, то она происходит крайне редко, если не создавать специальные условия, поскольку регуляторные участки эукариот отличны от таковых у бактерий. Регуляторные (сигнальные) участки не узнаются бактериальными РНК-полимеразами, что привода к замедлению транскрипции. При клонировании геномной ДНК, эукариотической клетки экспрессия генов не происходит из отсутствия у бактерий системы сплайсинга. Следовательно, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот необходимо, чтобы данные гены находились под контролем прокаритических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществления экспрессии эукариотического гена соответствующая кДНК (или синтетическая ДНК), содержащая кодирующую последовтельность, в составе векторной молекулы (например, плазмида присоединяется к регуляторным элементам бактерии – промотор оператору и рибосом-связывающему участку.

Таким образом, в сконструированных промежуточных рекомбинантных ДНК эукариотический ген будет находиться под контролем бактериальных регуляторных элементов. Целесообразй встраивать ген в подходящий вектор для экспрессии, который fсодержит регуляторные элементы, способствующие активной экс­прессии встроенного гена после введения рекомбинантной плаз­миды в бактериальную клетку. Например, к таким эффективным регуляторным участкам принадлежит промотор гена р-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину, входящий в состав плазмиды pBR). Промотор гена Р-лактамазы нерегулируемый, а исполь­зование таких промоторов не всегда удобно, так как синтезиро­ванные белки в большом количестве могут блокировать рост бак­терий. В связи с этим целесообразнее использовать регулируемые сильные промоторы, включить которые для синтеза чужеродного белка можно и в том случае, когда получена большая бактериальная масса. В частности, к числу регулируемых сильных промоторов сле­дует отнести термочувствительный промотор pL, который ответ­ствен за экспрессию нескольких генов бактериофага. Белок-репрессор, блокирующий данный промотор, активен при 31 С, но неактивен при 38 С, следовательно, при инкубировании бакте­рий при 31 °С чужеродный ген не экспрессируется и, наоборот, повышение температуры вызывает инактивацию репрессора и вы­сокий уровень синтеза нужного белка.

Последовательность оснований длиной 6 — 8 нуклеотидов, рас­положенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУТ у Е. coli, определяет эффективность процесса трансляции. Эта пос­ледовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой, и его сдвиг в ту или иную сторону способен умень­шать эффективность трансляции мРНК. По имени исследовате­лей, идентифицировавших этот участок, он был назван последо­вательностью Шайн-Дальгарно. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодо­ном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-концевых аминокислотных остатков происходят от источника регуляторных элементов и инициирующего кодона прокариотического гена. Та­кие гибридные белки часто более стабильны; обработка их хими­ческим или ферментативным способом приводит к выделению эукариотической части белка.

Суммарная активность экспрессируемого гена возрастает с ро­стом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Ис­пользуя многокопийные плазмиды, можно получить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до 1 — 2 тыс. ко­пий на клетку без нарушения жизненно важных функций бакте­рий. Обычно же используемые плазмидные векторы поддержива­лся в клетке в количестве 20 — 50 копий. Получение бактериаль­ных штаммов-сверхпродуцентов плазмидных генов — одна из важ­нейших задач современной биотехнологии в экономическом, ме­дицинском и социальном аспектах.

5.5. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНИЗМАХ

В настоящее время разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы В настоящее время разработаны системы клонирования в бак­териях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы

клонирования генов в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических со­единений. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками Bacillus subtilis, стрептомицетами и Saccharomyces cerevisiae.

Векторы для клонирования в таких системах представляют со­бой двойные репликоны, способные существовать ив£. coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой це­лью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой- либо из плазмид Е. coli и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим от­бором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем вы­деленные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хозяину легко тестируемый признак.

В. subtilis — непатогенный почвенный микроорганизм. Кле­точная стенка бактерии имеет простую структуру, позволяющую секретировать многие белки в культуральную жидкость. В част­ности, 20 различных видов бактерий синтезируют более 40 фер­ментов с внеклеточной локализацией. В этих бациллах обнаруже­ны плазмиды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клони­рование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках несколь­ких хозяев: В. subtilis, Е. coli, Staphylococcus aureus. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид St. aureus, Е. coli и хромосомных фрагментов В. subtilis. Полученные рекомби­нантные штаммы несут признаки устойчивости к антибиотикам.

Стрептомицеты широко применяют в биотехнологии в каче­стве продуцентов антибиотиков. Конструирование векторов для клонирования в них началось с выделения плазмиды Scp2 из Streptomyces coelicolor. На основе этой плазмиды были сконстру­ированы векторы, придающие стрептомицетам устойчивость к антибиотикам, например к метиленомицину А.

Клонирование в дрожжах. Среди дрожжей наиболее полно изучен вид S. cerevisiae. У этого вида в гаплоидных клетках со­держится 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколь­ко сотен генов. Большинство штаммов дрожжей содержат авто­номно реплицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм. Плаз­мида Scpl S. cerevisiae содержит около 6300 пар оснований и имеет 50— 100 копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обыч­но и используют в качестве векторов. Работа с дрожжами облег­чается тем, что подобно бактериям они могут расти в жидкой сре­де и давать колонии на твердой среде, а также имеют сравнитель­но короткое время регенерации (несколько часов) вследствие ма­лого размера генома.

Процедура выделения ДНК в клетки дрожжей довольно про­ста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкуби­руют с ДНК в присутствии СаС12и полиэтиленгликоля. Мембра­на при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая ин­кубация сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточ­ную стенку’. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, основана на применении в каче­стве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный ком­понент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попа­дании в клетку-хозяина придают ей этот недостающий признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать ко­лонии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные ис­пользовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки по­добно В. subtilis секретируют большое количество белка во вне­клеточную среду, что используется также для секреции чужерод­ных белков, например интерферона человека.

Клонирование в клетках животных. Проблема введения ге­нов в клетки млекопитающих очень важна для исследования фун­кционирования генов высших эукариот.

Предварительно клонированные гены вводят в клетку жи­вотных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с од­ним из генов, для которых осуществляется селекция.

Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший на­звание метода маркера. Примером может служить метод получе­ния клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК -клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК+ -клетка­ми. Клетки ТК+ легко отличаются от клеток ТК, поскольку способны расти на средах с аминоптерином (ингибитор, блоки­рующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных были использованы гиб­риды бактериальных плазмид с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентифика­цию генов в клетках Е. coli и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК-клетки. Анализ методом блот-гибридизации подтвердил, что выжившие клетки содержали интегри­рованный в геном ТК-ген вируса герпеса.

Селективные маркеры дают возможность вводить в клетки мле­копитающих любой ген, заранее лигированный с клонирован­ным селективным маркером.

В последние годы сконструировано большое количество так называемых челночных векторов и их рекомбинантных производ­ных, способных к репликации в животной и бактериальной клет­ках, экспрессирующие клонируемый ген в животной клетке. К числу таких векторов можно отнести векторы из плазмиды pBR322 и интактного района транскрипции ДНК SW-40. Геном SW-40 представляет собой циклическую ДНК длиной 5243 п.о. Однако в вирусах животных размеры несущественных областей малы и в них нельзя внедрить большие фрагменты чужеродной ДНК, на­пример ген дигидрофолатредуктазы мыши размером 42 kb. В боль­шинстве случаев чужеродная ДНК замещает существенные гены, в результате чего рекомбинантные вирусы утрачивают способность к репликации. Для ее функционирования используют «вирусы- помощники», синтезирующие продукты недостающих генов, за счет которых и существует рекомбинантный вирус. Обычно опу­холевые вирусы (в том числе SV-40) внедряют свою ДНК в хро­мосому клетки-хозяина и тем самым убивают ее при своем раз­множении. Обычно вирус бычьей папилломы в трансформиро­ванных клетках существует в виде эписомы (=100 копий на клет­ку) и используется в качестве основы для конструирования эписомных векторов. Одна из важнейших задач генной инженерии — разработка технологий по созданию векторов, подобных плазмидам, не убивающим клетку-хозяина и эффективно экспрессирующим клонируемый ген в животной клетке.

Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК не­посредственно в ядро клетки. Так, плазмиды, содержащие фраг­мент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался.

Трансформация соматических клеток млекопитающих открывает возможность для изучения механизмов регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, в том числе и человека. Культуры клеток млекопитаю­щих могут быть эффективным источником выделения ряда вирус­ных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека.

В настоящее время разработаны способы введения генов в эмб­риональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений с целью изменения свойств организма, таких, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Подобно­го рода работы были начаты с довольно крупными яйцами амфи­бий, а затем продолжены с яйцеклетками и эмбрионами мыши. Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в мат­ку. Таким образом были инъецированы гены интерферона и ин­сулина человека, ген глобина кролика, ген тимидинкиназного ви­руса герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Выживает обыч­но от 10 до 30 % яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из транс­формированных яйцеклеток, составляет от нескольких до 40 %.

Выяснено, что уровень экспрессии чужеродного гена зависит от места интеграции ДНК с хромосомами, от дифференцировки тканей.

Несмотря на определенные успехи в области интеграции чужерод­ных генов в эмбриональные клетки животных, до сих пор не удалось встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы, вытес­нить ген и заменить его новой нуклеотидной последовательностью, подчинить новый ген системе регуляции организма. Преодоление этих трудностей позволит успешно осуществлять гемотерапию чело­века — лечение нескольких десятков генетических заболеваний, обусловленных отсутствием или дефектами генов.

5.6. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ

Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повыше­ние продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, не­сущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципи­ента, — трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансген­ным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возника­ют новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.

Получение трансгенных животных предусматривает ряд эта­пов: приготовление раствора ДНК для микроинъекции; извлече­ние эмбрионов из донорных организмов; микроинъекция ДНК и пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после культивирования в матку синхронизированных реципиентов. У родившихся потомков исследуют экспрессию трансгена на уровне транскрипции и трансляции. Трансгенное потомство получают путем использования традиционных методов разведения животных. Следует отметить, что от приготовления инъекционного раствора ДНК (его чистоты, концентрации) во многом зависит эффективность получения трансгенных животных. Обычно гены транспортируют на ранних стадиях развития животного (в боль­шинстве случаев на стадии зиготы и двухклеточных эмбрионов). Для трансформации генов в геном животного используют следу­ющие приемы: микроинъекцию ДНК в пронуклеус зигот или в каждый бластомер у двухклеточного эмбриона; введение ДНК с помощью ретровирусных векторов; получение трансгенных химер из генетически трансформированных клеток и эмбрионов. В на­стоящее время наиболее распространенный метод — микроинъ­екция ДНК. Ее осуществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр ее около 1 мкм), а количество инъецирован­ного раствора ДНК составляет 1 — 2 пкл. После инъекции ДНК эмбрионы культивируют до момента пересадки реципиентам. Следует отметить, что микроинъекция эмбрионов сельскохозяй­ственных животных значительно сложнее, чем микроинъекция эмбрионов мышей и кроликов.

После небольшого культивирования in vitro проинъецированные эмбрионы переносят в яйцеводы (хирургическим путем) ре­ципиентов. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи обыч­но пересаживают 20—30 инъецированных зигот, причем у свиней все эмбрионы трансплантируют в один яйцевод; у мышей и кро­ликов — раздельно по яйцеводам, а у овец, коз и крупного рога­того скота — по 2 —4 эмбриона каждому реципиенту. Используя методы блот-анализа, дот-блот-анализа и полимеразную цепную реакцию (ПЦР), можно получить вполне надежные доказательства интеграции и экспрессии ДНК у трансгенных животных. С этой целью используют ядросодержащие клетки тканей или внутренних жидкостей реципиента, из которых выделяют ДНК.

Для исследования у трансгенных животных выделяют РНК из тех тканей, в которых предполагается наиболее высокий уровень экспрессии. Качественный и количественный анализы экзоген­ных белков позволяют судить об уровне трансляции инъецированного генного материала.

Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъек­цию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появ­ляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные 1енотипы. Помимо клеточных линий, содержащих трансген, они имеют еще и нетрансгенные клеточные линии. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микро­инъекции ДНК, — мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных. Этим объясняется тот факт, что трансген не передается потомству с ожидаемой в соответствии с законами Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству.

Одна из важнейших задач сельскохозяйственной биотехноло­гии — выведение трансгенных животных с улучшенной продук­тивностью и более высоким качеством продукции, резистентнос­тью к болезням, а также создание так называемых животных-биореакторов — продуцентов ценных биологически активных веществ. Каковы же успехи биотехнологии в этом направлении? С генети­ческой точки зрения особый интерес представляют гены, коди­рующие белки каскада гормона роста: непосредственно гормон роста (ГР), рилизинг-фактор гормона роста (РФ) и инсулинподобный фактор ГР (ИФГР).

В конце 70-х годов XX в. на основе технологии рекомбинантной ДНК получили гормон роста микробного происхождения. Было показано, то ГР оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР. Гормон ро­ста, полученный с помощью методов генетической инженерии, при крупномасштабном применении вызывал увеличение удоев на 23 — 31 % при дозе 13 мг в день. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие использовать его один раз в две недели и даже в месяц. При ежедневной инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней и овец удалось увели­чить суточные привесы на 20 — 30% при значительном сокраще­нии расхода кормов на единицу прироста. У молодняка свиней с ускорением роста увеличивалось содержание белка и уменьша­лось содержание жира в тканях, что повышало качество мясопро­дуктов.

Первые трансгенные мыши с геном ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конеч­ной живой массы. Однако у трансгенных свиней с геном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось.

По данным Л. К.Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7 % выше по сравнению с контрольными животными. У потомства трансгенных свиней, получавших модифицирован­ный кормовой рацион с повышенным содержанием белка (18% сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина, от­мечались более высокие среднесуточные привесы (на 16,5 %).

У трансгенных овец с генами ГР и РФ ГР, несмотря на повы­шенный уровень ГР, скорость роста не увеличивалась. Вместе с тем, по данным большинства исследователей, у трансгенных сви­ней наряду с повышением содержания белка наблюдалось дву­кратное уменьшение толщины шпика (7 — 8 мм у трансгенных про­тив 18 —20 мм у контрольных животных); аналогичные показате­ли отмечены у трансгенных овец (25 — 30 % жира у контрольных животных против 5 —7% у трансгенных овец).

Рассматривается возможность уменьшения лактозы в молоке путем создания животных, у которых присутствует специфически для молочной железы промотор, соединенный с геном фермента бета-галактозидазы, катализирующей распад лактозы. Молоко таки животных, не содержащее лактозы, могут использовать люди, которых не синтезируется бета-галактозидаза. Ведутся работы по введению генных конструкций в организм трансгенных животных вырабатывающих антитела, предотвращающие маститы.

Другая важная задача — выведение трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызван­ные различными болезнями, достаточно велики, поэтому все бо­лее важное значение приобретает селекция животных по резистен­тности к болезням, вызываемых микроорганизмами, вирусами, паразитами и токсинами. Пока результаты селекции на устойчи­вость животных к различным заболеваниям невелики, но обнадеживающих. В частности, созданы популяции крупного рогатого ско­та с примесью крови зебу, устойчивые к некоторым кровепарази­тарным заболеваниям. Установлено, что защитные механизмы от инфекционных заболеваний обусловлены либо препятствием втор­жению возбудителя, либо изменением рецепторов. Вторжению воз­будителей, равно как и их размножению, препятствуют в основном иммунная система организма и экспрессия генов главного комп­лекса гистосовместимости. Одним из примеров гена резистентно­сти у мышей служит ген Мх. Этот ген, обнаруженный в модифи­цированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх+ мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Ген Мх+ был выделен, клонирован и использован для получения трансгенных свиней, эк­спрессирующих ген Мх на уровне РНК. Однако данные о транс­ляции Мх-протеина, обусловливающего устойчивость трансгенных свиней к вирусу гриппа А, пока не получены. Ведутся исследова­ния в целях получения трансгенных животных, резистентных к маститу за счет повышения содержания белка лактоферина в тка­нях молочной железы. На культуре клеток из почек трансгенных кроликов было показано, что клеточные линии, содержащие транс­генную антисмысловую РНК, имели резистентность против адено­вируса Н5 (Ads) более высокую на 90 —98 % по сравнению с конт­рольными линиями клеток. Л. К. Эрнст продемонстрировал также устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК к лейкозу крупного рогатого скота, к заражению вирусом лейкоза.

Показана возможность конструирования системы внутриклеточной иммунизации против инфекционных вирусов с участием мутационных форм эндогенных вирусных белков, защищающих от соответствующих вирусов. Так, получены трансгенные куры, устойчивые к лейкозу, у которых в клетках присутствовал белок вирусной оболочки.

Одна из важнейших задач стратегии использования трансгенных животных в медицине — получение биологически активных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызы­вающих у них синтез новых белков.

Трансгенные животные как продуценты ценных биологически активных белков и гормонов имеют ряд преимуществ перед мик­роорганизмами и клеточными системами. Важно, что новые бел­ки, получаемые в линиях клеток трансгенных животных, могут быть модифицированы, их активность сравнима с активностью протеинов. Для молочного производства представляет большой интерес получение целенаправленной трансгенной экспрессии в эпителиальные клетки молочной железы с целью выхода белков с молоком. Один из основных этапов получения трансгенных жи­вотных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, — иден­тификация промотора, направляющего экспрессию структурных генов в секреторный эпителий молочной железы.

В настоящее время выделены гены и промоторы aS1-казеина, бета-казеина, a-лактоальбумина, бета-лактоглобулина и сывороточно­го кислого протеина (WAP). Молочная железа — великолепный продуцент чужеродных белков, которые можно получать из моло­ка и использовать в фармацевтической промышленности. Из мо­лока трансгенных животных извлекают следующие рекомбинан­тные белки: человеческий белок С, антигемофильный фактор IX, a-1-антитрипсин, тканевой плазменный активатор, лактоферин, сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназу и химозин. В большинстве проектов, за исключением a-1-антитрипсина и химозина, эти исследования пока еще на стадии разработки и ве­дутся в основном на трансгенных мышах, поэтому оценивать их с точки зрения коммерческого интереса еще рано.

Вышесказанное можно проиллюстрировать следующими при­мерами. В США осуществлен метод микроинъекции ДНК, отве­чающий за экспрессию бета-лактоглобулина, который способен продуцироваться только в молочных железах животных. В Эдинбур­ге в 1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном a-1-антитрипсина человека и бета-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уров­не продукции белка может быть получено около 10 кг трансген­ного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 па­циентов при лечении эмфиземы легких. Обычно выход рекомби­нантных белков в системах с использованием культуры клеток со­ставляет около 200 мг/л, а у трансгенных животных он может по­вышаться до 1 л. Следует заметить, что создание клеточных куль­тур и их выращивание в промышленных реакторах, а также вы­ведение трансгенных животных и их обслуживание — дорогие и сложные процедуры. Однако трансгенные животные легко раз­множаются, содержание их сравнительно дешево, что делает этих животных хорошими продуцентами разнообразных белков с низ­кой стоимостью. В России группой ученых под руководством Л. К. Эрнста получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200 — 300 мг химозина — основного компонента для производства сыра. Стоимость его будет в не­сколько раз ниже продукта, получаемого традиционным способом из сычугов молочных телят и ягнят. Приведены данные, свиде­тельствующие о высокой эффективности производства сыра с использованием химозина молока трансгенных овец. Так, из 3 л молока трансгенной овцы можно получить достаточное количе­ство химозина для производства 1 т сыра из коровьего молока.

А Вам помог наш сайт? Мы будем рады если Вы оставите несколько хороших слов о нас.
Категории
Рекомендации
Можно выбрать
Интересное
А знаете ли вы, что нажав сочетание клавиш Ctrl+F - можно воспользоваться поиском по сайту?
X
Copyrights © 2015: FARMF.RU - тесты, лекции, обзоры
Яндекс.Метрика
Рейтинг@Mail.ru

Пожалуйста поддержите наш сайт.

Скроее всего Вы знаете, что Google приостановил монетизацию сайтов в РФ. Для поддержки нашего сайта пожалуйста используйте VPN соединение из любой страны кроме РФ. Нам важна Ваша помощь для продолжения публикации новых лекций и статей.