Анализ производных β-лактамидов и аминогликозидов. Глава 7. 

Фармацевтическая химия — Арзамасцев А. П. — 2004

• β-лактамиды (Пенициллины)
  • Химические строение, физические и физико-химические свойства
  • Химические свойства и реакции подлинности
  • Методы количественного определения. Испытания на чистоту
• Цефалоспорины
• Аминогликозиды

β-Лактамиды и аминогликозиды относятся к антибиотикам — большой группе органических соединений с различной химичес­кой структурой, обладающих выраженной биологической направ­ленной активностью. Все изучаемые ЛС — полифункциональные соединения сложной химической структуры. Изучение их физи­ческих, физико-химических и химических свойств, выявление об­щих и частных признаков основываются на знании общих законо­мерностей, приобретенных ранее и курсах теоретических химических и биологических дисциплин, ранее изученных тем курса фарма­цевтической химии и других специальных дисциплин.

Антибиотики — это химиотерапевтические вещества, образуе­мые микроорганизмами или полученные из других природных ис­точников, а также их производные и синтетические продукты, об­ладающие способностью избирательно подавлять в организме больного возбудителей заболевания или задерживать развитие зло­качественных новообразований.

Антибиотики отличаются от других ЛС гетерогенностью, т.е. многокомпонентностью состава. Например, аминогликозид гента­мицин состоит из 3 компонентов; в солях бензилпенициллина сум­ма пенициллинов должна быть не менее 96,0%, а содержание бен­зилпенициллина — не менее 90,0%.

Для антибиотиков характерно отношение к действию опреде­ленных ферментных систем. Для каждого антибиотика существует фермент, который его инактивирует. Например, пенициллиназа инактивирует природные и некоторые полусинтетические пеницил­лины.

Оценка качества природных и полусинтетических антибиотиков проводится по дополнительным показателям — токсичности и для некоторых веществ (например, для стрептомицина сульфата) — ги­стаминоподобного действия. Эти показатели определяются биоло­гическими методами на животных.

Значительную часть антибиотиков выпускают в виде гермети­чески укупоренных сухих рассыпок вследствие их нестабильности в водных растворах.

Антибиотики занимают первое место среди препаратов, вызываю­щих побочные реакции: это прямая токсичность, дисбактериозы, нефро- и ототоксичность (стрептомицин), аллергические реакции (пенициллин).

Поскольку антибиотики в большинстве случаев являются сме­сями веществ, их активность определяется в единицах действия (ЕД).

Биологическую активность природных антибиотиков определяют методом диффузии в агар. Метод основан на сравнении угнетения роста тест-микроорганизма определенными концентрациями испы­туемого препарата с угнетением роста известными концентрация­ми стандартного препарата антибиотика.

Для бензилпенициллина 1 ЕД соответствует 0,5988 мкг химичес­ки чистой натриевой соли бензилпенициллина. 1 мкг химически чистого стрептомицина основания соответствует специфической активности, равной 1 ЕД.

На этикетках большинства антибиотиков, являющихся раствори­мыми солями или другими растворимыми производными, как пра­вило, указывают содержание биологического вещества, чаще в пере­счете на основание или кислоту: например, «Оксациллин 1,0 г».

 β-ЛАКТАМИДЫ

К β-лактамным антибиотикам относятся пенициллины и це­фалоспорины. Они имеют сходную химическую структуру: содержат β-лактамное кольцо и являются N-ацильными производными соответствующих аминокислот — 6-аминопениниллановой (пеницил­лины) и 7-аминоцефалоспорановой или 7-аминодезацетокси- цефалоспорановой (цефалоспорины).

Пенициллины

Бензилпенициллин открыт А. Флемингом (1929) и до сих пор широко используется в медицине.

Русские исследователи и врачи задолго до выделения Флемин­гом пенициллина наблюдли антибиотическое действие зеленой пле­сени (В. А. Маяассеин и др.), а А, Г. Полотебнов и М. Г. Тарковский применяли зеленую плесень в лечебных целях. Но в то время (XIX век) эти замечательные открытия наших ученых не получили ши­рокой известности.

Заслуга создания советского пенициллина, разработка способа его получения из отечественных штаммов плесени принадлежит З. В. Ермольевой.

Во Всесоюзном НИИ антибиотиков (в настоящее время — Государственный научный центр по антибиотикам) получены по- лусинтетические пенициллины — метициллин, оксациллин, ампи­циллин, карбенициллин и др., а также полусинтетические цефа­лоспорины и ряд других антибиотиков (С.М, Папашин и др.).

Большой вклад в развитие исследований антмбиоткои внесли со­ветские ученые М.М. Шемякин, А.С. Хохлов, а в изучение молеку­лярных механизмов действия антибиотиков — академики Ю.А. Ов­чинников, В-А. Энгельгардт, А.С. Спирин,

Для промышленного производства препаратов антибиотиков наибольшее значение имеют Penicillium notatum и Penicillium chrysogenum.

К природным пенициллинам относят бензилпенициллин и феноксиметилпенициллин. Бензилпенициллин является довольно сильной кислотой, гигроскопичен, быстро инактивируется и поэто­му его применяют в виде солей с неорганическими и органическими основаниями (натриевой, калиевой, новокаиновой, N,N’-дибензил~ этиленлиаминовой и др.).

Феноксиметилпенициллин обладает боль­шей устойчивостью, применяется в виде кислоты, а за рубежом — и в виде калиевой соли.

Соли бензилпенициллина и феноксиметилпенициллина актив­ны в отношении грамположительных микроорганизмов (относи­тельно узкий спектр действия), неустойчивы к действию кислот (кроме феноксиметилпенициллина) и пенициллиназы.

Эти недостатки природных пенициллинов стимулировали по­иск новых антибиотиков. В конце 50-х гг. XX столетия начались работы по созданию активных полусинтетических антибиотиков на основе 6-аминопениниллановой кислоты (6-АПК), которая была выделена в качестве продукта, биосинтеза пенициллина в 1959 г. 6-АПК может быть получена и ферментативным гидролизом бен­зилпенициллина. Ацилирование 6-АПК хлорангидридами различ­ных кислот позволило получить ряд полусинтетических пеницил­линов, устойчивых к кислотам (могут применяться внутрь), пени­циллиназе и имеющих более широкий спектр действия.

Химические строение, физические и физико-химические свойства

В основе строения пенициллинов лежит 6-АПК, которая пред­ставляет собой гетероциклическую систему, состоящую из 2 кон­денсированных колец:

четырехчленного — р-лактамного (В) и пя­тичленного — тиазолидинового (А).

6-АПК является дипептидом, состоящим из Е-цистеина и Е-валина.

L-цистеин (β-меркаптоаланин):

L-валин (L-α-аминоизовалериановая кислота):

Общая формула пенициллинов:

Пенициллины отличаются друг от друга строением ацильного остатка в аминогруппе 6-АПК.

Наряду с природными пенициллинами (бензилпенициллин в виде солей и феноксиметилпенициллин) в медицине применяются полусиятетические пенициллины (оксациллин, ампициллин, амок­сициллин, карбенициллин и др.). Структура ацильных радикалов и соответствующих пенициллинов представлена в табл. 15.

Химическое строение, описание, растворимость и применение некоторых пенициллинов представлены в табл. 16.

Пенициллины представляют собой белые или почти белые кри­сталлические порошки. Пенициллины со свободной карбоксиль­ной труппой в 3-м положении (например, феноксимегилпенициллин, ампициллин, амоксициллин) мало растворимы в воде. Соли щелочных металлов (натриевая и калиевая соли бензилпеницилли­на, натриевые соли оксациллина, ампициллина, дннатрневая соль карбенициллина) легко растворимы в воде; соли органических ос­нований (новокаиновая и N,N’-дибензилэтилеядиаминовая соли бензилпенициллина) мало растворимы в воде.

Соли бензилпенициллина неустойчивы в растворах и разруша­ются при приеме внутрь (в кислой среде), поэтому их выпускают в виде герметически укупоренных сухих рассыпок для парентераль­ного введения.

Феноксиметилпенициллин более устойчив в кис­лой среде и может применяться внутрь в виде таблеток.

Зависимость между химическим строением и биологическим действием пенициллинов представлена на схеме.

Схема 1. Зависимость между химическим строением и биологическим действием пенициллинов.

1. — характер радикала определяет степень связывания пеницил­лина белками;
2. — заместитель в о-положении фенильного радикала влияет на устойчивость к пенициллиназе;
3. — характер связи фенильного радикала с метиленовой группой определяет кислотоусгойчивость пенициллинов;
4. — заместитель атома водорода в метиленовой группе определя­ет спектр действия пенициллина;
5. — расщепление β-лактамной связи приводит к исчезновению свойств антибиотика и появлению аллергического действия;
6. — заместитель в карбоксильной группе дает возможность получе­ния солевых форм пенициллинов; П — пенициллиназа расщепляет беталактамное ядро; А — амидаза расщепляет амидную связь.

Поскольку в молекулах пенициллинов содержатся асиммет­рические атомы углерода (С₃ С₅ и С₆), растворы пенициллинов являются оптически активными и вращают плоскость поляризации вправо, что используется для характеристики их качества (опреде­ления удельного вращения).

β-Лактамиды поглощают свет в ИК-области спектра. При нали­чии стандартных образцов это отличный способ идентификации препаратов, который используется по НД главным образом для полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов. Определение проводят в дисках с бромидом калия либо в насте с вазелиновым маслом. Полученный ИК-спектр испытуемого препарата сравни­вают с ИК-спектром стандартного образца.

Для удобства оценки полос поглощения рекомендуется весь спектр разделить условно на 3 области; от 4000 до 3000, от 1800 до 1500 и от 1500 до 650 см ^-1.

Общие характеристические полосы поглощения пенициллинов находятся в области 1800-1500 см^-1 на которую приходится ин­тенсивная полоса поглощения при 1775—1755 см^-1, соответствую­щая (β-лактамному кольцу, сопряженному с тиазолидиновым цик­лом.

Амидная группа пенициллинов обусловливает 1-ю и 2-ю амид­ные полосы вторичного нециклического амида соответственно в областях 1690—1645 см^-1, вызванные валентными колебаниями кар­бонильной группы, и 1585-1550 см^-1, соответствующие деформа­ционным колебаниям группы NH.

Большинство пенициллинов являются солями, поэтому в пре­паратах карбоксильные группы ионизированы, что подтверждается наличием полосы при 1615—1600 см^-1.

Наличие полос поглощения в области 3500—3200 см^-1 иногда обусловлено валентными колебаниями свободной гидроксильной группы, на характер которой могут влиять водородные связи, а так­же колебания вторичных амидов и аминов.

Для ИК-спектров оксациллина натриевой соли кристаллогидрата характерны четко выраженные полосы поглощения, соответствующие общим группировкам пенициллинов. Так, интенсивная полоса по­глощения при 1760 см^-1 обусловлена наличием р-лактамяой группи­ровки, полоса поглощения при 1645 см^-1 — амидной группы. После­дняя иногда обозначается как полоса амид-1. Полоса интенсивного поглощения при 1600 ем^-1 обусловлена валентными колебаниями иони­зированной карбоксильной группы. Для ИК-спектров пенициллинов характерно также в области 1600-1500 см^-1 наличие сильной полосы — около 1550 см^-1, соответствующей вторичной амидной группировке (полоса амид-2).

Кроме того, в области 4000-3000 см^-1 имеется ин­тенсивная полоса при 3410 см^-1, соответствующая валентным колеба­ниям группы NH- вторичного амида. Наличие 2-й амидной группи­ровки в оксациллине проявляется в виде дублета полос при 3210 и 3180 см^-1, которые относят к транс- и цис-изомерам. Полоса валент­ных колебаний группы NH около 3060 см^-1 очень слабо выражена. Эту полосу можно рассматривать как соотесгствующую обертону по­лосы амид-2. Полоса валентных колебаний группы ОН кристалло­гидрата проявляется в виде интенсивного поглощения при 3610 см^-1.

Натриевая соль оксациллина для инъекций, получаемая лиофиль­ной сушкой, имеет ИК-спектр, отличающийся от кристаллогидра­та. Широкая полоса поглощения при 3380-3400 см^-1 с максимумом ~ 3400 см^-1 указывает на наличие оксациллина, частично потеряв­шего при сушке воду. При дальнейшей перекристаллизации веще­ства получают спектр, присущий кристаллогидрату.

Метод ИК-спектроскопии позволил подтвердить структуру пенициллинов как р-лакгамидов по наличию указанной выше по­лосы поглощения при 1760 см^-1.

Пенициллины поглощают свет в УФ-области спектра за счет ароматического ацильного радикала в аминогруппе 6-АПК.

Сама 6-АПК не имеет максимума поглощения в УФ-области спектра. УФ-спектры поглощения бензилпенициллина, ампицил­лина, карбенициллина и других пенициллинов аналогичны спек­трам соответствующих кислот.

Бензилпенициллин и его соли имеют в УФ-области спектра 2 выраженных максимума — при 257 и 263 нм. которые обусловле­ны наличием бензильного радикала.

В процессе получения и хранения соли бензилпенициллина мо­гут подвергаться превращениям с образованием продуктов, характеризующихся наличием полос с λ_maх 280 нм.

В процессе получения бензилпенициллина посторонние пени­циллины могут достигать 10%, что определяется методом УФ-спектрофотометрии.

Данный показатель (280 нм) используется для нормирования содержания побочных продуктов в калиевой и натриевой солях бензилпенициллина. Оптическая плотность 0,18% растворов лекар­ственных веществ в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 280 нм не более 0,18. Разность между оптическими плотностями при длине волн 263 и 280 им не менее 0,72.

Феноксиметилпеиициллин имеет 2 полосы поглощения с интенсивными максимумами при 268 и 274 нм, обусловленными феноксигруппой, Значения отношений оптических плотностей при этих максимумах ГФ использует для определения чистоты препа­рата (А ₂₆₈/А₂₇₄ должно быть не менее 1,21 и не более 1,24).

Метод УФ-спектрофотометрии используется также для количественного определения фенокеиметилпениниллина в растворе гидрокарбоната натрия при длине волны 268 нм.

По МФ III УФ-спектрофотометрия используется для определе­ния подлинности (оптическая плотность раствора феноксиметил- пенициллина в 0,1 и. растворе гидроксида натрия должна быть не менее 0,56 и не более 0,60) и чистоты фенокеиметилпениниллина (примесь n-оксифеноксиметилпеиициллина определяют в раство­ре препарата в том же растворителе; при длине волны 306 нм опти­ческая плотность должна быть не более 0,36).

Светоноглощаюшие примеси в ампициллине натриевой соли определяют методом УФ-спектрофотометрии (оптическая плот­ность раствора препарата в воде при 325 нм должна быть не более 0,3).

Спектрофотометрический метод используется также для количественного определения некоторых полуситетических пени­циллинов.

Химические свойства и реакции подлинности пеннициллинов

Наиболее лабильной частью молекулы пенициллина является β-лактамиое кольцо, которое подвергается гидролитическому расщеплению под действием щелочей, кислот, фермента пеницил­линазы с потерей биологической активности.

Щелочи и пенициллиназа гидролизуют β-лактамное кольцо с образованием неактивной пенициллоиновой кислоты:

Легкий гидролиз β-лактамного никла пенициллинов по сравне­нию с другими р-лактамами объясняется влиянием соседнего серосодержащего тиазолидинового цикла.

Реакция щелочного гидролиза пенициллинов используется в гидроксамовой реакции, в количественном йодометрическом оп­ределении суммы пенициллинов в солях бензилпенициллина и феноксиметилпениниллине. в алкалиме трическом определении сум­мы пенициллинов в полусингетических пенициллинах.

Гидроксамовая реакция

Общегрупповой реакцией на β-лактамиды является гидроксамо­вая реакция. Она основана на наличии β-лактамного кольна в мо­лекуле пенициллина. При взаимодействии пенициллинов со ще­лочным раствором гидроксиламина гидрохлорида происходит реакция гидроксиламинолиза с образованием гидроксамовой кис­лоты, которая после подкисления образует окрашенные комплекс­ные соли с солями тяжелых металлов: с солями железа (III) фиоле­тового цвета раствор гидроксамата железа III и зеленого цвета осадок гидроксамата меди (II).

Вначале происходит щелочной гидролиз препарата с образова­нием пенициллоиновой кислоты; в момент гидролиза пенициллоиновая кислота реагирует с гидроксиламином, образуя гидрокса­мовую кислоту:

Реакции используются для идентификации и количественного спектрофотометрического в видимой области спектра или для ФЭК- определения (гидроксамат меди — после растворения в подходящем растворителе) пенициллинов.

Образование пенилловой и пеницилленовой кислот, их использование в анализе

Под действием кислот пенициллины инактивируются с образова­нием пенилловой и пеницилленовой кислот, которые являются продуктами изомеризации пенициллина. Пенилловая кислота об­разуется при рН~2,0, а пеницилленовая — при рН~5,0.

В обоих случаях на 1-м этапе расщепляется β-лактамный цикл с образованием пеницилленовой кислоты. Затем происходит кон­денсация карбоксильной группы (пеницилленовая кислота) или амидной группы (пенилловая кислота) с гидроксильной группой ацильного радикала.

Образование пенинилленовой и пенилловой кислот происходит следующим образом:

На образовании пенниловой кислоты основана одна из реакций подлинности на растворимые соли пенициллинов.

При взаимодействии растворимых солей пенициллина (натрие­вых, калиевых) с 25% хлороводородной кислотой выделяется бе­лый осадок кислотной формы пенициллина, который растворяется при добавлении избытка реактива.

Кислотная форма пенициллина при взаимодействии с избытком хлороводородной кислоты подвергается гидролитическому расщеплению и изомеризации до пенилловой кислоты, которая является амфолитом и за счет основных свойств атомов азота образует с хлороводородной кислотой растворимую соль — гидрохлорид:

Образование солей пеницилленовой кислоты с солями ртути (II) и меди (II) используется в спектрофотометрическом количествен­ном определении ряда пенициллинов (ампициллина натриевой соли, амоксициллина и др.).

Реакции на катионы солей пенициллинов

Реакция на калий: около 0,1 г препарата сжигают в тигле. Остаток дает характерную реакцию А на калий — с виннокаменной кислотой.

Реакция на натрий: препарат дает характерную реакцию Б на натрий — по окраске пламени.

Реакции на новокаин-основание в новокаиновой соли бензил­пенициллина:

Реакция образования азокрасителя на первичную аромати­ческую аминогруппу:

 

Реакции на азотистое основание.

Поскольку в молекуле новокаина содержится 2 основных цент­ра (более сильный — алифатическая диэтиламиногруппа и более слабый — первичная ароматическая аминогруппа), он дает осадки с обтнеадкалоидными осадительными реактивами. При добавлении к насыщенному раствору бензилпенициллина новокаиновой соли реактива Люголя выпадает бурый осадок, а с реактивом Майера образуется белый осадок.

Реакция на дибензилэтилендиамин в бензатине бензилпеницил­лина (бициллине- 1).

Из щелочного раствора препарата извлекают в эфир дибензил­этилендиамин. После выпаривания эфира остаток растворяют в этаноле и прибавляют раствор пикриновой кислоты. Образуется желтый осадок пикрата дибензилэтилендиамина. Реакция протека­ет за счет основных свойств дибснзилэтилендиамина. Осадок пере­кристаллизовывают после растворения в горячем этаноле. Т_пл, по­лученного пикрата ~ 214°С.

Реакция с хромотроповой кислотой

Международная фармакопея и некоторые зарубежные фармако­пеи для отличия пенициллинов друг от друга рекомендуют приме­нять реакцию с хромотроповой кислотой. Для этого пробирку с 2 мг препарата, 2 мг натриевой соли хромотроповой кислоты и 2 мл концентрированной серной кислоты помещают в баню с темпера­турой 150 °С (масляную или глицериновую) и отмечают секундоме­ром время погружения. Пробирку встряхивают каждые 30 с и отме­чают окраску (табл. 17)

Наиболее специфичной и самой изученной является реакция феноксиметилпенициллина с хромотроповой кислотой.

Феноксиметилпенициллия с концентрированной серной кисло­той образует феноксиуксусную кислоту. При дальнейшем гидроли­зе феноксиуксусная кислота образует фенол и гликолевую кислоту:

Гликолевая кислота окисляется до формальдегида:

Далее формальдегид с хромотроповой кислотой образует аури­новый краситель фиолетового цвета:

Реакция с реактивом Марки

Пенициллины с реактивом Марки (раствор формалина в кон­центрированной серной кислоте) образуют окрашенные продук­ты.

Наиболее характерной эта реакция является для феноксиметил- пенициллина (красное окрашивание при комнатной температуре и углубление окраски при нагревании). Реакция протекает за счет феноксиуксусной кислоты, которая образуется из феноксиметил- пенициллина при действии концентрированной серной кислоты.

Фенол (см. выше) с реактивом Марки образует ауриновый кра­ситель красного цвета.

Ампициллин и амоксициллин за счет остатка аминокислоты в ацильной части молекулы дают реакцию с нингидрином и солями меди (II) (с реактивом Фелинга или раствором меди сульфата).

Реакция образования азокрасителя на амоксициллин

Амоксициллин, в отличие от ампициллина, содержит в молеку­ле фенольный гидроксил и поэтому с солью диазония образует азо­краситель:

Реакции окисления

Пенициллины за счет гетероатома серы обладают восстанавливаю­щими свойствами и способны восстанавливать серебро из аммиач­ного раствора серебра нитрата, оксид меди (I) из реактива Фелинга, ртуть — из реактива Несслера, йод из калия йодата и др.

Действие окислителей приводит к образованию неактивных продуктов окисления; как правило, окислительный распад проте­кает с раскрытием тиазолидинового ядра и образованием сульфок­сида.