Методы количественного определения пенициллинов. Испытания на чистоту

Глава 7. Анализ производных β-лактамидов и аминогликозидов 

Поскольку пенициллины являются гетерогенными соединения­ми, по НД требуется найти сумму пенициллинов и определяемого пенициллина. Сумму пенициллинов в солях бензилпенициллина и феноксиметилпенициллине определяют йодометрическим методом.

Натриевую и калиевую соли бензилпенициллина растворяют в воде, а феноксиметилпенициллин — в фосфатном буфере с pH 7,0. Затем добавляют раствор гидроксида натрия и оставляют на 20 мин. После щелочного гидролиза к смеси прибавляют соляную кислоту, раствор ацетатного буфера (pH 4,5 + 0,05) и избыток 0,01 н. раство­ра йода. Оставляют на 20 мин в темном месте и титруют избыток 0,01 я. раствора йода 0,01 и. раствором натрия тиосульфата. Парал­лельно проводят контрольный опыт с таким же количеством пре­парата, но без щелочного гидролиза.

При щелочном гидролизе происходит раскрытие β-лактамного кольца с образованием пенициллоиновой кислоты в открытой ти­ольной форме.

Пенициллоиновая кислота при pH 4,5 гидролизуется в присут­ствии окислителя (йод) до пенальдиновой кислоты и пеницилламина, которые окисляются раствором йода соответственно до дегидропенальдиновой и пеницилламиновой (диметилцистеиновой») кислоты:

Избыток йода оттитровывают раствором натрия тиосульфата. На окисление расходуется 8 эквивалентов йода.

Разность в объемах между титрованиями соответствует содержа­нию суммы пенициллинов в препарате.

Содержание суммы пенициллинов в процентах (X) вычисляют по формуле:

где V — разность в объектах 0,01 н. раствора йода между опытным и контрольным титрованием (или разность в объемах 0,01 н. раство­ра натрия тиосульфата между контрольным и опытным титровани­ем), мл;

К — поправка 0,01 н. растворе натрия тиосульфата;

Э — величина эквивалента 1 мл 0,01 н. раствора йода в граммах стандартного образца натриевой соли бензилпенициллина или в граммах стандартного образца феноксиметилпенициллина (с пере­счетом на химически чистое вещество);

С — коэффициент пересчета стандартного образца натриевой соли бензилпенициллина на исследуемый пенициллин, указанный в соответствующей статье;

а — навеска препарата, г.

Таким образом, йодометрический метол количественного определения суммы пенициллинов состоит из нескольких стадий.

• Получение пенициллоиновой кислоты (щелочной гидролиз или действие пенициллиназы).
• Превращение певициллоиновой кислоты в пенальдиновую и пе­ницилламин (рН4,5 в присутствии йода),
• Окисление йодом пеницилламина и пенальдиновой кислоты до пеницилламиновой и дегидропенальдиновой кислоты соответ­ственно.
• Титрование избытка йода раствором натрия тиосульфата.

Аналогичным образом проводят количественное определение полусинтетических цефалоспоринов — цефалексина и цефалотина.

При йодометрическом определении [β-лактамидов (пеницилли­нов и цефалоспоринов.) используют стандартные образцы, так как реакция взаимодействия йода с продуктами щелочного разруше­ния пенициллинов не протекает строго стехиометрически. Этим же целям стандартизации служит поддержание определенного значе­ния pH среды и времени анализа.

Определение бензилпенициллина в его солях проводится грави­метрическим методом, основанным на образовании N-этилпипе­ридиновой соли бензилпенициллина, которая нерастворима в сме­си амилацетата и ацетона. Соли других пенициллинов растворимы в этой смеси и осадка не образуют:

Феноксиметилпениниллин определяют методом УФ-спектро­фотометрии в 5% растворе гидрокарбоната натрия яри длине вол­ны 268 нм.

Количественное определение суммы пенициллинов в бензатина бензилпенициллине проводится йодометрическим методом.

Количественное определение дибензилэтилендиамина в бензатинабензилпенициллине проводится методом кислотно-основно­го титрования в неводной среде после экстрагирования эфиром из щелочного раствора препарата.

Эфирный слой выпаривают до ма­лого объема, добавляют 2 мл безводного этанола и выпаривают до­суха. К остатку добавляют ледяной уксусной кислоты и титруют хлорной кислотой:

В литературе описан метод кислотно-основного титрования феноксиметилпенициллина в неводной среде за счет кислотных свойств.

Препарат растворяют в диметилформамиде и титруют ра­створом метоксида натрия (лития, калия):

Количественное определение природных и полусинтетических пенициллинов спектрофотометрическим методом.

Методы основаны на образовании комплексных соединений пеницилленовой кислоты с солями ртути (II) или меди (II) λ_maxсоответственно 325 и 320 нм). По международной и некоторым за­рубежным фармакопеям для количественного определения пени­циллинов спектрофотометрическим методом применяется реакция с раствором имидазола ртути (II) хлоридом, которая протекает сле­дующим образом. Имидазол атакует β-лактамное кольцо с образо­ванием промежуточного продукта N-пенициллоидимидазола (I), на атом серы которого действует ртути (II) хлорид, образуя устойчи­вый комплекс ртути (II) пеницилленовой кислоты (II):

Этот продукт довольно устойчив и имеет максимум поглощения при 325 нм. Если соединение имеет первичную аминогруппу в α-положении к карбонильной группе амида (например, ампицил­лин), то при взаимодействии с имидазолом и ртутью (II) образуют­ся менее устойчивые продукты с максимумом поглощения при длине волны 311 нм.

Влияние аминогруппы устраняется ее анелидирова­нием: в этом случае образуется продукт с максимумом поглощения при 325 нм. Методика количественного определения бензилпени­циллина калия с имидазолом и ртути (II) хлоридом приведена в МФ III, г. II.

Для ампициллина применяется метод УФ-спектрофотометрии, основанный на образовании комплекса пеницилленовой кислоты с медью (II) в буферном растворе при длине волны 320 нм.

Ампициллин определяют методом кислотно-основного титрова­ния в неводной среде по основному центру ~ алифатической ами­ногруппе. Препарат растворяют в ледяной уксусной кислоте и тит­руют хлорной кислотой:

Сумма пенициллинов в полусинтетических пенициллинах по ГФ и другим НД определяется методом нейтрализации после щелоч­ного гидролиза препаратов избытком титрованного раствора гид­роксида натрия при нагревании. Титрование проводят по фенол­фталеину, поэтому воду для растворения препарата, а также ра­створ препарата в воде до гидролиза нейтрализуют 0,01 и. раствором гидроксида натрия до розового окрашивания.

При охлаждении раствора его предохраняют от поглощения углекислого газа из воздуха (натронной известью). Избыток щело­чи после охлаждения раствора титруют 0,1 н. раствором соляной кислоты:

По Европейской фармакопее пенициллины определяют мето­дом жидкостной хроматографии.

Испытания на чистоту

Пенициллины могут легко изменяться под влиянием внешних воз­действий, поэтому для них обязательным является испытание на прозрачность и цветность. Растворы натриевых и калиевых солей бензилпенициллина должны быть бесцветными и прозрачными.

Все препараты оптически активны (правовращающие); в ЯД представлены значения удельного вращения.

УФ-спектрофотометрия используется для определения посторон­них примесей. Поглощение при 320 нм обусловлено образованием тиольной формы пенициллоиновой кислоты. В ФС регламентируется значение pH растворов (или суспензий) препаратов данной группы.

В табл. 18 представлены значения pH водных растворов (или водных суспензий) некоторых пенициллинов.

Из табл. 18 следует, что нейтральные соли пенициллина устой­чивы в нейтральной и слабокислой средах; феноксиметилпенициллин как кислота устойчив в слабокислой среде. Динатриевая соль карбенициллмна устойчива в слабощелочной среде; ампициллин — амфолит, его натриевая соль устойчива в слабощелочной среде. Все пенициллины в щелочной среде гидролизуются, а в кислой — гид­ролизуются и подвергаются изомеризации с потерей активности.

В препаратах пенициллина регламентируется содержание воды. Определение проводится путем высушивания в сушильном шкафу (для некоторых препаратов — в вакуум-сушильном) либо титрова­нием по методу К.Фишера. Допустимое содержание воды в некото­рых пенициллинах представлено в табл. 19.

Определение йодсорбирующих примесей основано на том, что сами пенициллины йодом не окисляются. Окисление йодом пени­циллинов проводится только после щелочного гидролиза и добав­ления ацетатного буфера при pH 4,5. Если же окисление йодом проводить в тех же условиях, но без предвари тельного щелочного гидролиза, то окисляться будут только возможные продукты рас­щепления (йодсорбирующие примеси).

Методика определения йодсорбирующих примесей в ампицил­лине. Около 0,25 г испытуемого препарата (точная навеска) раство­ряют в 50 мл 1/15 М фосфатного буфера (pH 7,0) в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (раствор А).

10 мл раствора А вносят в коническую колбу с притертой проб­кой вместимостью 250 мл, прибавляют 20 мл 0,8 М раствора аце­татного буфера (pH 4,7 + 0,05), 25 мл 0,01н. раствора йода с калия йодидом, перемешивают и оставляют на 20 мин в темном месте.

Избыток йода оттитровывают 0,01 н. раствором натрия тиосуль­фата до слабо-желтого окрашивания, затем прибавляют 0,2 мл ра­створа крахмала и титруют до обесцвечивания.

Параллельно проводят контрольный опыт. Содержание йодсор­бирующих примесей в процентах (X), в пересчете на сухое вещество, вычисляют по формуле:

где V — разность в объемах 0,01 н, раствора натрия тиосульфата между контрольным и основным титрованием, мл;

К — поправочный коэффициент к тигру 0,01 н. раствора натрия тиосульфата;

а — навеска препарата в пересчете на сухое вещество, г;

Э — количество С₁₆Н₁₉N₃S (ампициллина), эквивалентное 1 мл 0,01 н. раствора йода, г (Э — 0,0004359).

Содержание йодсорбируюших примесей в препарате, в пересче­те на сухое вещество, должно быть не более 3,5%.

Все препараты пенициллина испытываются на токсичность био­логическим методом.

Возможность наличия токсичных примесей обусловлена мето­дом получения пенициллинов (микробиологический синтез при­родных пенициллинов, а также микробиологический синтез 6-АПК или ферментативный гидролиз бензилпенициллина амидазой для получения 6-АПК — исходного вещества для полусинтетических пенициллинов).

В НД регламентируется количество посторонних пенициллинов в каждом из препаратов. Так, содержание бензилпенициллина в калиевой и натриевой солях должно быть не менее 90,0%, а сумма пенициллинов — не менее 96,0%. Таким образом, в препаратах до­пускается содержание 6,0% других пенициллинов. Препараты пе­нициллина для парентерального введения испытываются на пиро­генность и стерильность.