Глава 8. Ферменты. Иммобилизованные ферменты

Глава 8. Ферменты. Иммобилизованные ферменты.

8.1. Промышленное производство ферментов, получаемых биотехнологическими методами
8.1.1. Культивирование продуцентов ферментов
8.1.2. Переработка культуральной жидкости
8.2. Иммобилизация как путь повышения эффективности и стабильности

Ферменты (Ф) – белковые вещества, выполняющие функции катализаторов химических реакций и используемые в медицине, пищевой, фармацевтической и химической промышленности. Реакции, осуществляемые ферментами, не требуют экстремальных условий (температуры, кислотности среды к др.), оптимальное значений температуры для большинства Ф 20-40 °С, ее повышение до 40 °С и выше, как правило, влечёт снижение активности Ф или их полную денатурацию. Ферменты характеризуют высокая скорость, стереоспецифичность и незначительное количество образующихся побочных продуктов. Важное их свойство – эффективность катализа (ферменты увеличивают скорость в 1010 – 1012 раз) и избирательность действия (каждый фермент, как правило, катализирует одну химическую реакцию). Ферменты способны катализировать не только расщепление, но и образование химической связи.

Ферменты — высокомолекулярные соединения с м.м. от 10000 до 1000000. Ферментные белки малоустойчивы, весьма чувствительны к изменениям pH и температуры. Для каждого Ф существует оптимум значения pH, при котором скорость катализируемой реакции максимальна, отклонения значения pH в ту или иную сторону ведут к снижению скорости ферментативной реакции.

По экономическим и технологическим соображениям получать Ф с помощью микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников, микробные клетки содержат или продуцируют более двух тысяч Ф, которые катализируют биохимические реакций, связанные с ростом дыханием и образованием продуктов. Культуры микроорганизмов способны вырабатывать большое  количество Ф за короткое время с использованием дешёвых исходных веществ. Многие из этих Ф могут быть выделены и проявляют свою активность независимо от клетки.

К настоящему времени в научной литературе описано около 3000 Ф, примерно 100 из них применяют в промышленном производстве. Промышленность выпускает свыше 50 индивидуальных Ф и вдвое больше ферментных препаратов, последние представляют собой смеси, содержащие кроме целевого продукта – Ф – значительное количество близких по физико-химическим свойствам белков.

В биологических объектах Ф находятся в фиксированном состоянии на поверхности различных клеточных структур и сохраняют активность в течение длительного времени. Выделенные из органов и тканей или полученные из микробного сырья, особено в высокоочищенном состоянии, Ф быстро инактивируются.

8.1. Промышленное производство ферментов, получаемых биотехнологическими методами

Схема производства Ф микробиологического происхождения представлена на рис. 21

8.1.1. Культивирование продуцентов ферментов

Интенсивность биосинтеза любого фермента микроорганизмом, его продуктивноеть обусловлена генетическими свойствами продуцента. Функционирование биосинтетической системы регулируется составом питательной среды и динамикой изменения отдельных ее компонентов во время роста микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов – продуцентов ферментов целесообразно в средах строго детерминированного состава, обеспечивающих направленный биосинтез нужного Ф.

Синтез многих Ф репрессируется легкоусвояемыми источниками углерода (глюкозой, фруктозой, маннозой Ш др.); этот эффект носит название катаболитной репрессии (иногда глюкозным эффектом). Катаболитной репрессии подвержен биосинтез таких Ф, как α-амилаза, целлюлаза, глюкоамилаза, инвертаза, трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты.

Ферменты, катализирующие превращение азотсодержащих субстратов, также регулируются по механизму катаболитной репрессии, их биосинтез репрессируется ионами аммония или быстроусвояемыми аминокислотами. Аминокислоты в анаэробных условиях культивирования инициируют биосинтез соответствующих декарбоксилаз. При наличии в среде большой концентрации мочевины стимулируется биосинтез уреазы. Введение в среду культивирования аргинина индуцирует биосинтез аргиназы. Источниками органического азота могут служить пептон, триптон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина или любая их смесь.

Наличие в среде культивирования различных биополимеров обусловливает одновременное накопление комплекса протеаз, амилаз, нуклеаз, липаз.

На рост микроорганизмов и биосинтез Ф существенное влияние оказывают ионы кальция, марганца, цинка и др. Ионы железа и магния активируют и стабилизируют протеолитические ферменты. Присутствие ионов железа и меди в среде культивирования существенно для биосинтеза железо- и медьсодержащих Ф, участвующих, как правило, в окислительно-восстановительных реакциях (утилизации и превращения энергии). Отсутствие таких ионов может негативно отразиться на скорости многих метаболических процессов и на биосинтезе Ф, катализирующих эти процессы.

Продуценты Ф, относящиеся к строгим анаэробам, требуют полностью безкислородных условий культивирования и очень богатых, полнеценных сред. Процесс культивирования в этом случае можно проводить в более простых ферментерах, так как же нужна аэрация к перемешивание.

Оптимизация питательных сред и условий культивирования для обеспечения направленного биосинтеза продуцентом целевого продукта является важным этапом разработки биотехнологического процесса получения высокоочищенных ферментов. Преимущественный биосинтез культурой нужного продукта с минимальным содержанием посторонних белков позволяет в дальнейшем существенно упростить выделение и очистку Ф.

8.1.2. Переработка культуральной жидкости

Большинство Ф промышленного производства относится к внеклеточным, поэтому они находятся в культуральной жидкости. При выделении внутриклеточных Ф (изоферментов) основной задачей является сбор клеток, содержащих Ф.

Глубинная культура представляет собой суспензию, содержащую остатки питательных веществ, продукты метаболизма (в том числе внеклеточные Ф), взвешенные клетки продуцента. В период культивирования обычно происходит ограниченный лизис микробных клеток и в суспензии появляется неконтролируемое количество внутриклеточных метаболитов. Из этой достаточно сложной и многокомпонентной смеси приходится выделять и очищать один Ф.

Технологический процесс начинают с разделения растворимых и нерастворимых веществ, концентрирования и фракционирования, заканчивают разнообразными способами хроматографической очистки.

Фильтрация жидкости, содержащей мелкодисперсный клеточный материал, частично разрушенные клетки и внутриклеточные полимеры, сопряжена с определенными трудностями. Фильтруемый раствор вязок, склонен к гелеобразованию, осадок сжимается и закупоривает поры фильтра. Для избежания этого применяют крупнопористые фильтрующие материалы – диатомиты, кизельгур, бентонит, фильтроперлит и другие, они задерживают очень мелкие частицы, образуются несжимаемые слои фильтрующего материала и биомассы, которые же изменяют фильтрующих свойств и забивают фильтры. На фильтрующем материале может происходить сорбция или денатурация некоторых белков, а результате значительно снижается выход Ф. Обработка фильтроперлита раствором ЭДТА уменьшает потери на 2-6%.

Сепарацию клеточной массы и сопутствующих конгломератов осуществляют с помощью центрифуг (фирмы «Beckman», США, MSE, Англия, «Hitadi», Япония).

Дезинтеграция биомассы. Основное количество Ф обычно находится внутри клеток, где он образует комплексы с другими биополимерами. Клеточные структуры могут быть разрушены в результате прямого механического воздействия (баллистическими, УЗ-, экструзионными, ферментативными методами – см. гл. 5.7). После дезинтеграции биомассы продуцента фермента получается вязкая, опалесцирующая суспензия, содержащая фрагменты клеточных стенок, субклеточных структур и продукты их деградаций, а также самые разнообразные высоко- и низкомолекулярные органические вещества. Ферменты находятся в растворенном состоянии, поэтому на одной из первой стадий обработки клеточного гомогената должны быть удалены нерастворимые частицы. Для этого применяют скоростное центрифугирование. Образуется прозрачный клеточный экстракт, содержащий только растворенные биополимеры и низкомолекулярные компоненты. Среди нежелательных процессов, которые могут происходить в таком растворе – протеолиз собственными клеточными протеазами, что влечет потерю каталитической способности, изменение специфичности или стабильности выделяемого Ф. Этот процесс может протекать несмотря на поддержание низкой температуры, особенно при очистке Ф, так как после удаления сопутствующих белков Ф становится единственным субстратом протеазы.

Инактивацию протеаз осуществляют обработкой клеточного экстракта специфическими ингибиторами-комплексонами (ЭДТА, о-фенангролин, оксихинолин), солями ртути или серебра. Протеазы из клеточных экстрактов могут быть удалены сорбцией на аффинных сорбентах. Если протеазы термолабильны, а выделяемый Ф термостабилен, их можно денатурировать нагреванием клеточных экстрактов. Денатурацию нуклеиновых кислот в процессе очистки Ф обусловливает низкая ионная сила или основность среды. Можно использовать специальные осадители, образующие с нуклеиновыми кислотами нерастворимые комплексы. С этой целью применяю бромистый цетилтриметиламмоний, стрептомицинсульфат, протаминосульфат, полиэтиленимин. Полнота удаления нуклеиновых кислот зависит от pH и ионной силы раствора, концентрации осадителя и белка. Чтобы белки остались в растворенном состоянии, повышают ионную силу растворов. По эффективности осаждающего действия на нуклеиновые кислоты в экстрактах Е. coli осадители располагаются в следующем порядке: полилизин > полиэтиленимин > бромистый цетиолтриметиламмоний > стрептомицинсульфат > протаминсульфат > магния хлорид.

Другой способ удаления нуклеиновых кислот из клеточных экстрактов – их гидролиз под действием нуклеаз, для этого применяют панкреатические ДНК-азу и РНК-азу. Значительную часть биополимеров можно удалить термообработкой клеточных растворов, если Ф термостабилен. Далее проводят хроматографическую очистку, в том числе аффинную.

В качестве сорбентов применяют различные гели – фосфатов кальция, гидроксида алюминия, реже – древесный уголь или гель гидрооксида цинка. Сорбцию на гелях проводят в слабокислых растворах (pH 5,0-6,0); важны оптимальные соотношения между количеством геля и белкового раствора. Гель, содержащий сорбированный Ф, отделяют центрифугированием.

Для ультрафильтрации используют мембранные фильтры, селективность и скорость работы которых зависят от давления, гидродинамических условий, температуры, состава фракционируемой смеси и ее концентрации.

Для фракционирования белковых растворов используют нейтральные соли. Известно, что растворимость белков зависит от величины молекул белка, степени их гидратации и ионной силы солевых растворов. Растворяясь, соль связывает воду и, таким образом, изменяет степень гидратации молекул белка, что приводит к их агрегации и образованию осадка. С этой целью применяют аммония сульфат, который обладает стабилизирующим эффектом по отношению ко многим Ф. Обычно выход Ф при фракционировании аммония сульфатом достигает 100%.

Фракционирование белков растворителями. При смешивании органических растворителей с водой изменяется ее диэлектрическая константа и соответственно степень гидратации молекул, вплоть до замены молекул воды молекулами органического растворителя. Все это ускоряет образование нерастворимых агрегатов белковых молекул. Обычно для фракционирования растворов Ф применяют этанол и ацетон. При повышенной температуре (более 4 °С) в водно-органических смесях Ф денатурируют, поэтому работы с органическими растворителями проводят при низких температурах. Органический растворитель охлаждают до (-30) – (-40 °С) сухим льдом или жидким азотом; температура смеси поддерживается при этом на уровне от -10 до -20 °С. Осадок центрифугируют, затем растворяют в небольшом объеме буферного раствора, удаляя следы органических растворителей диализом или ультрафильтрацией через гель.

Для хроматографического фракционирования применяют ионнообменную, аффинную хррмагографию и гель-фильтрацию. Наиболее эффективная очистка Ф достигается ионно-обменной хроматографией с использованием сорбентов на основе сополимеров метакриловой кислоты и различных гидрофобных мономеров. В препаративной знзимологии применяют иониты на основе натуральных или полусинтетических полисахаридных матриц (ионно-обменные целлюлозы). Среди многих производных целлюлозы чаще используют ДЭАЭ-, ТЭАЭ-, КМ- и фосфоцеллюлозы (первые два – аниониты, последние – катиониты). Предпочтительна гранулированная целлюлоза, гидродинамические свойства которой позволяют проводить хроматографический процесс с большой скоростью.

После элюирования из колонки функционально адащщх белков сорбент подлежит регенерации. Для удаления неактивных белков, ферментов и др. сорбированных соединений колонку промывают щелочами, водой, кислотами и вновь водой. Иногда для полного удаления пигментов используют органические растворители йлй детергенты. Процесс регенерации колонки завершается обработкой стандартным буферным раствором.

Фракционирование смесей Ф, имеющих различный размер молекул, проводят гель-фильтрацией на разных типах сефадексов – модифицированных производных линейного полисахарида полидекстрана. Для фракционирования крупномолекулярных смесей применяют поперечносшитые акриламиды под названием ультрагелей (фирма LKB, Швеция) и агарозу в поперечносшитом состоянии (сефарозы CL 2В, 4В и 6В). В поперечно-сшитых агарозах хроматографический процесс можно осуществить в широком интервале pH и температуры, использовать буферные растворы, содержащие органические растворители, соли. Аналогичными свойствами обладают декстраны, поперечно-сшитые акриламидом сефакрилы: на них можно фракционировать смеси белков с м.м. от 105 до 107.

Наряду с натуральными и полусинтетичеекими полисахаридными матрицами для гель-фильтрации используют синтетические поликриламидиые гели (биогельР, акрилекс фирм «Bio Rad Laboratories» – США и «Reanal» – Венгрия). Большое количество аминогрупп в их структуре придает полимеру гидрофобные свойства, хорошую набухаемость в воде с образовании пористой структуры геля. К синтетическим гелям относят также оксиакрилметакрилатные гели-сфероны (фирма «Lachema», Чехия).

Для гель-хроматографии, в отличие от других методов хроматографического разделения белков, не требуется обессоливать пробу, корректировать pH, не нужны специальные элюирующие буферы. Смесь белков, продвигаясь по сорбенту, освобождаетея от солей и распределяется в порядке уменьшения м.м. Белки и другие компоненты смеси с сорбентом не взаимодействуют, из колонки вначале выходят самые крупные молекулы, затем – меньшими м.м., затем соли. В большинстве случаев после того, как из сорбента вышли белки и все низкомолекулярные компоненты, колонка пригодна для применения в следующем хроматографическом цикле.

Аффинная хроматография характеризуется высокими выходом и степенью очистки выделяемого белка. Основа этого биоспецифическото метода состоит в том, что в многокомпонентной смеси между одним или несколькими белками-ферментами и полимерными сорбентами образуется стабильная связь, в результате чего эти белки из раствора переходят на нерастворимый сорбент. Чем меньше белков связывает сорбент, тем выше его селективность (идеальная селективность – связывание одного Ф). Центром связывания служат субстраты, их аналоги, обратимые ингибиторы, коферменты, антитела и другие вещества, называемые лигандами, присоединенные к матрицам. Лиганды специфически взаимодействуют с активными центрами выделяемого Ф. В качестве лигандов используют синтетические аналоги субстратов или коферментов.

Матрицей сорбента, к которой присоединен лиганд, может быть любой полимер, обладающий:
крупнопористой гелевой структурой, позволяющей крупным молекулам Ф проникать внутрь структуры и взаимодействовать с центрами связывания;
– гидрофильностью структуры, обеспечивающей взаимодействие с водой и отсутствие неспецифичеекого связывания белков по гидрофобным центрам;
– отсутствием в структуре заряженных групп, исключающих образование неспецифичных электростатических связей;
– способностью полимера легко активироваться определенными химическими агентами, позволяющими за счет несложных процессов присоединять большое количество лиганда;
– достаточной химической, механической, микробиологической стойкостью, обеспечивающей стабильность во время работы сорбентов.

Указанным требованиям наиболее полно отвечают различным образом модифицированные агарозы; недостаток агароз – нестойкость к воздействию микроорганизмов, малая механическая прочность, высокая стоимость.

Строгая специфичность аффинного сорбента к выделяемому Ф значительно улучшает сам хроматографический процесс, состоящий из последовательно сменяющихся этапов сорбции, удаления несорбированных белков и элюирования сорбированного Ф. Условия сорбции подбираются таким образом, чтобы выделяемый Ф сорбировался наиболее полно, а сопутствующие белки не задерживались. Это зависит от pH, ионной силы, природы буферных растворов, температуры. После отмывки сорбента от несорбированных белков резко изменяется один или нескольких из указанных параметров, в результате разрушается комплекс фермента с сорбентом и Ф высвобождается. Элюирование Ф проводят, добавляя в элюент специфически взаимодействующие с ферментом вещества – субстраты, коферменты, растворимые ингибиторы. Как правило, это повышает эффективность очистки, так как специфические агенты не разрушают неспецифические комплексы между сорбентом и сопутствующими белками.

8.2. Иммобилизация как путь повышения эффективности и стабильности

Высокая лабильность Ф к различным факторам окружающей среды (значению pH, температуре), быстрая инактивация в организме и выделение из организма, наличие антигенных свойств чужеродных организму белков – в значительной мере могут быть устранены при использовании Ф в иммобилизованном виде.

Иммобилизация Ф – это повышение их стабильности. Существует несколько общепринятых методов иммобилизации Ф, которую проводят в строго асептических условиях, но ни один из существующих методов иммобилизации биологически активных молекул, таких, как Ф, антитела, антигены, не является универсальным.

Самый простой способ иммобилизации Ф – физический метод (адсорбция на нерастворимом носителе). В основе метода лежат действия электростатических сил и сил поверхностного натяжения. Процедура иммобилизации состоит в смешивании при соответствующих условиях Ф и носителя, инкубации и отделении нерастворимого компонента смеси от растворимого центрифугированием или фильтрованием. Недостаток этого метода – непрочная связь Ф с носителем. Например, адсорбция Ф на носителе ДЭАЭ — сефадекс (диэтиламиноэтил) осуществляется за счёт множественных солевых связей. На такого рода связи влияют даже незначительные изменения pH, ионной силы, температуры и природы растворителя, что может приводить к десорбции фермента с носителя, десорбцию Ф может вызвать даже субстрат. Кроме солевых связей во взаимодействии Ф с носителем могут участвовать и другие слабые силы, например, водородные или ван-дер-ваальсовые.

Материалы, используемые для адсорбции Ф: алюминия оксид, бентонит, кальция карбонат, гель кальция фосфата, активированный уголь, целлюлоза, глина белая, коллаген, ионно-обменные смолы, фенольные полимеры, силикагель.

Адсорбция – мягкий метод иммобилизации, который, как правило, слабо влияет на каталитическую активность Ф.

Иммобилизация ферментов с помощью ковалентного связывания считается мягким методом. Способ основан на образовании химической связи между молекулами Ф и носителя. При этом важно, чтобы аминокислоты, необходимые для проявления каталитической активности Ф, не участвовали в ковалентном связывании с носителем. Способ ковалентной иммобилизации может приводить к снижению ферментативной активности. Инактивацию можно предотвратить, проводя иммобилизацию в присутствии субстрата, защищающего активный центр. Типичные водонерастворимые носители, используемые для ковалентной иммобилизации — агароза (сефароза), целлюлоза, декстран (сефадекс), сополимеры полиакриламида, полиаминостирол.

Для ковалентного присоединения требуется предварительная активация носителя. Активированный носитель может реагировать с определёнными группами Ф: α- и ε-аминогруппами остатков лизина, функциональными группами остатков тирозина, гистидина, аргинина, цистеина. Например, носитель сефароза активирована бромцианом, что основано на реакции между бромцианом и гидроксильными группами сефарозы, образующиеся при этом имидокарбонатные группы могут реагировать со свободными аминогруппами Ф.

Для определения количества Ф, иммобилизованного на носителе, измеряют ферментативную активность исходного раствора, который инкубирован с носителем, и активность, остающуюся в растворе после завершения процесса иммобилизации. Разность между этими активностями соответствует теоретическому или максимальному количеству иммобилизованного Ф.

Иммобилизация ферментов металлохелатным методом. Для этой цели используют свойства переходных металлов образовывать комплексы. В качестве переходных металлов используют титана хлорид чистый иди в кислом растворе, гидроксиды титана, циркония, хрома (их оксиды не токсичны), железа, ванадия, олова. В качестве носителей – производные целлюлозы и силикагели (с соответстветствующим размером пop), глутаровый альдегид. Гелеобразные гидратированные оксиды металлов образуют с Ф нерастворимые комплексы, обладающие хорошей ферментативной активностью. На полисахаридных носителях, именно целлюлозе, получают препараты иммобилизованных Ф с наиболее высокой тивностью.

Например, хелатный комплекс титана хлорида и целлюлозы (D- глюкопиранозы); гидроксильные группы в положении 6 D-глюкопиранозы, взаимодействуя с ионами титана, образуют полимерный хелат. В нейтральном водном растворе между полимером, активированным титана хлоридом, и Ф образуется ковалентная связь, далее смесь должна быть полностью высушена. Температура высушивания избирательна, но она не должна превышать 50 °С, обычно активирование носителя проводят под вакуумом. Связывание Ф с титановыми комплексами полимеров происходит в молекуле Ф по свободным карбоксильным группам кислых аминокислот, фенольным гидроксилам остатков тирозина, спиртовым гидроксильным группам остатков серина и треонина, свободным сульфгидрильным группам остатков цистеина, ε-аминогруппам остатков лизина.

Иммобилизация клеток и ферментов с включением в гель относится к механическим методам. Гель, в который включают клетки, как правило, состоит из сферических частиц. Включение живых клеток и Ф требует мягких условий иммобилизации, ниситель должен представлять систему пор с хорошими условиями для газообмена.

Включение клеток в полиакриламидный гель. Полиакриламид (ПАА) – носитель, чаще других используемый для включения Ф, так как он не обладает ионно-обменными свойствами, поэтому при иммобилизации pH-профиль активности Ф практически не меняется. Для удерживания включённых белков с носителем требуется высокая степень сшивки носителя, т.е. полная полимеризация. Важным фактором при этом является удаление кислорода из раствора.

Включение клеток в гель кальция альгината. Альгинат – основной структурный полисахарид бурых морских водорослей. Моновалентные катионы полисахарида даже в низких концентрациях образуют вязкий раствор в присутствии двухвалентных катионов, особенно кальция, что способствовало широкому применению альгината для иммобилизации живых клеток. Ионы кальция можно заменить другими двухвалентными катионами, например бария. Важно отсутствие в системе хелатирующих агентов, таких, как фосфаты и цитраты, разрушающие структуру геля, связывая кальций.

Включение клеток в гели каррагенина. Каррагенины — гетероциклические полисахариды, содержащие эфиры α-D-галактопиранозил серной кислоты. В водном растворе каррагенин (гель) при добавлении ионов кальция образует нерастворимую фракцию.

Включение клеток в гели агара. Препараты клеток, включенных в агар, как и в каррагенин, получают в виде сферических частиц. Иммобилизацию проводят в растворе, нагретом до температуры, при которой агар остаётся жидким, затем добавляют клетки и смесь охлаждают до образования геля. Как и в случае с каррагенином, клетки должны быть устойчивы к нагреванию при 40 °С. Иммобилизацию проводят в реакторе при непрерывном режиме с перемешиванием или в реакторах, работающих в режиме псевдоожижения. В процессе полимеризации геля молекулы Ф связываются на небольших расстояниях и Ф оказывается заключённым внутри ячеек геля. Размеры пор геля должны быть меньше размера молекул Ф, но они не должны препятствовать доступу субстрата к Ф.

Иммобилизация ферментов микрокапсулированием. Основное при этом виде иммобилизации – удержание раствора, окружающего Ф. Иммобилизуется целиком исходный раствор, содержащий Ф, а не отдельные молекулы Ф. Преимущество микрокапсулирования – большая площадь поверхности, приходящаяся на единицу активности иммобилизованного Ф, позволяющая использовать высокие концентрации Ф в исходном растворе и достигать большей эффективности действия иммобилизованного Ф. Размер микрокапсул составляет десятки или сотни микрон.

Для предотвращения Ф от инактивации с органическими растворителями и мономерами перед микрокапсулированием Ф смешивают с полимерами, способствующими сохранению его активности – бычьим сывороточным альбумином, гемоглобином, ПВП, ПВС, ПЭГ в концентрации 1%. Гидрофобные участки полимеров экранируют молекулу Ф, защищая её в процессе микрокапсулирования.

Для образования микросфер в органическом растворителе используют эмульгатор (span-85 в концентрации 0,1%) для покрытия поверхностей капелек водной фазы, что предохраняет Ф от непосредственного контакта с органическим растворителем.

Физические и химические свойства микрокапсулированных Ф зависят от природы полимера, из которого формируется микрокапсула. Полимер должен обладать когезионными свойствами, обеспечивающими образование непрерывной плёнки, быть проницаем для субстрата, инертным по отношению к реакционной смеси. Для получения микрокапсул используют природные и синтетические полимеры – карбоксиметилцеллюлозу, ацетатфталат целлюлозу, нитрат целлюлозы, желатин, эпоксидные смолы, полиуретаны, стирол, полиамиды.

Для микрокапсулирования ферментных систем чаще всего используют коацервацию. Полимерами для коацервации являются – ацетат и нитрат целлюлозы, бутадиеновый каучук.

Микрокапсулирование включает следующие стадии:
1. Растворение Ф в буферном растворе, содержащем для защиты Ф от денатурации другие белки, например альбумин.
2. Приготовление органической фазы, содержащей эмульгирующий агент, например, span-85. Органическая фаза не должна смешиваться с водой; обычно это эфир, циклогексан, толуол.
3. Внесение водного раствора Ф в органическую фазу, перемешивание в течение заданного времени с определённой скоростью, от скорости перемешивания зависит размер микрокапсул.
4. Добавление к двухфазной смеси второго органического раствора, содержащего полимер и органический растворитель (перечисленные на второй стадии). При добавлении второго органического раствора происходит образование мелкого коллоида, обусловленное разбавлением органического растворителя.
5. Не прекращая перемешивания в условиях вакуума (до 25 мм рт. ст.), отгоняют органический растворитель, при этом происходит дальнейшее осаждение водных микросфер с плотной мембраной. Толщина мембраны зависит от количества полимера, добавленного к органической фазе и времени преципитации.
6. Выделение микрокапсул из органической фазы центрифугированием и промывка буферным раствором, содержащим твин-20.

Включение ферментов в липосомы. Известно, что липосомы – бислойные сферические образования с водной фазой внутри или полислойные образования, состоящие из нескольких концентрических бислоев с внутренней полостью и размером до 10 нм.

Для получения липосом Ф или другие БАВ в водных растворах подвергают УЗ-обработке в присутствии положительно или отрицательно заряженных фосфолипидов.

В зависимости от физических параметров фосфолипидов (заряда, жидкости, размера) липосомы проникают в клетку андоцитозом или за счет слияния о природными мембранами. При эндоцитозе  фосфолипидная оболочка липосом внутри клеток разрушается фосфолипазами и Ф высвобождаются в цитоплазму; при слиянии с клеточной мембраной фосфолипидный комплекс липосом входит в состав клеточных мембран, активная субстанция поступает в цитоплазму.

Направленность действия липосом может быть изменена за счет состава компонентов, образующих мембрану, сродство липосом к клеткам-мишеням усилено специфическими факторами (антителами и др.).

Таблетки и гранулы ферментных препаратов (трипсина, лизоцима, щелочной фосфотазы, каталазы и др.) получают в смеси с биосовместимыми полимерами (ПАВ, ПВП, ПВС и др.). Имплантированный в очаг поражения или поблизости от него Ф, находящийся в полимере, практически полностью защищён от воздействия агрессивной физиологической среды. Из полимера Ф выходит в нативном состоянии, скорость его последующей инактивации и выведения (как и вызываемые им токсические, аллергические и иммунные реакции) аналогична нативному Ф, применяемому традиционным способом.

Ферментсодержащие препараты с помощью катетеризации вводят непосредственно в мышечную ткань или в капиллярную сеть поражённого органа, иммобилизованные Ф поддерживают там высокую локальную концентрацию.

Иммобилизованные на водорастворимой полисахаридной матрице тромболитические Ф (стрептодеказа, стрептокиназа, целиаза), депонируемые в место расположения тромба методом катетеризации, эффективны в меньшей дозе.

Таблица 6. Ассортимент некоторых иммобилизованных ферментных препаратов

Наименование препарата Источник получения Форма выпуска, способ применения Фармакологическое

 

действие

Стрептодеказа Streptomyces naemoliticus Лиофилизированный порошок во флаконах, внутривенно Фибринолитик
Стрептокиназа Тромболитик
Целиаза Тромболитик
Рибонуклеаза Поджелудочная железа крупнорогатого скота. Лиофилизированный

 

порошок, внутримышечно,

Аэрозоль – местно

Антифлогистик при заболеваниях дыхательншх путей
Аспераза Aspergillus oryzae 2%-я мазь в тубах, местно Протеолитическое, лизирующее, при гнойно-некротических процессах
Террилитин Aspergillus terricola Лиофилизированный порошок во флаконах, местно, внутриполостно Протеолитическое, лизирующее, при гнойно-некротических процессах
Терридеказа Протеолитическое, противовоспалительное, ранозаживляющее
Профезим Bacillus subtilus 10%-я взвесь во флаконах, местно Протеолитическое,

 

некролйтическое,

противоотечное

Альфа-амилаза Таблетки во флаконах, перорально Регулирующее пищеварение
Ораза Aspergillus oryzae Гранулы во флаконах, перорально Протеолитическое, противовоспалительное, регулирующее пищеварение
Сомилаза Penicillium solitum, bacillus subtilis Таблетки во флаконах, перорально Липолитическое,

 

регулирующее пищеварение

Пенициллиназа Bacillus licheniformis Лиофилизированный порошок во флаконах, в/м Острые аллергич­ские реакции, анафилактический шок

Иммобилизованные растительные клетки

Известно широкое использование иммобилизованных Ф в качестве стабильных биокатализаторов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов способны относительно долго осуществлять характерные для них биохимические процессы. Иммобилизованные клетки бактерий, грибов способны синтезировать соответствующие антибиотики; главное – подбор метода иммобилизации клеток – продуцентов антибиотиков, позволяющего сохранить способность клеток синтезировать большое количество того или иного антибиотика длительное время.

Растительные клетки весьма чувствительны к изменениям окружающей среды, и для их иммобилизации могут быть использованы только наиболее мягкие методы; например, включение в гель кальция альгината. С помощью иммобилизации растительных клеток частично или полностью удаётся решить проблемы, связанные с использованием культур растительных тканей для получения сложных органических соединений. Например, иммобилизованные клетки Digitalis lanata способны осуществлять 1 -2-β-гидроксилирование производного дигоксина с образованием дигитоксина — единственного препарата наперстянки, который используется во всём мире.

Разработана технология получения биологически активных веществ из биомассы растительных клеток, культивируемых в ферментерах различной вместимости суспензионным способом. Созданы коммерческие препараты (женьшень, шиконин и др.) Получен патент на штамм женьшения ДАН-25.

Иммобилизованные клетки используют при трансформации стероидных соединений, так как некоторые стероидтрансформирующие Ф, особенно гидроксилазы и дегидрогеназы, — весьма лабильные белки. В качестве носителей используют ПАА, ПВС, каррагенины, агар, кальция альгинат.

Категории
Рекомендации
Подсказка
Нажмите Ctrl + F, чтобы найти фразу в тексте
Партнеры
А знаете ли вы, что нажав сочетание клавиш Ctrl+F - можно воспользоваться поиском по сайту?
X
Copyrights © 2015: FARMF.RU - тесты, лекции, обзоры
яндекс.ћетрика
Рейтинг@Mail.ru

У вас включен AdBlock!

Привет! Мы создали этот сайт с различными интересными статьями. Для нас очень важно, чтобы вы отключили AdBlock. Ведь именно за счет рекламы живет этот сайт. Огромное спасибо.

Уведомление для пользователей AdBlock

У вас включен AdBlock!

Привет! Нас зовут Дима и Аня. Мы создали этот сайт с различными интересными статьями. Для нас очень важно, чтобы вы отключили AdBlock. Ведь именно за счет рекламы живет этот сайт. Огромное спасибо.