Глава 6. Лекарственные средства, полученные на основе рекомбинантных микроорганизмов

6.1. Моноклональные антитела как лекарственные средства
6.2. Тромболитики и антикоагулянты
6.3. Аминокислоты
6.4. Синтез L-аскорбиновой кислоты
6.5. Гормональные препараты
6.5.1. Инсулин
6.5.2 Соматотпропный гормон (СТГ) или гормон роста человека
6.5.3. Эритропоэтин
6.6. Вакцины
6.7. Цитокины

В настоящее время с помощью рекомбинантных ДНК клонировано более 400 генов (в основном в виде кДНК) различных белков человека, которые являются или могут стать ЛС. По подсчетам специалистов ВОЗ, ежегодный объем мирового рынка ЛП на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет.

Развитие технологии рекомбинантных ДНК, разработка способов получения моноклональных антител, установление структуры и функции иммуноглобулинов привело к использованию специфических антител для лечения различных заболеваний. Работа с генами антител облегчатся тем, что отдельные молекулы антитела выполняют разные функции. Привлекательность применения в качестве терапевтических средств специфических антител объясняется тем, что их можно исполь­зовать для нейтрализации токсинов; борьбы с бактериями, вирусами, для лечения онкологических заболеваний. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая или нейтрализует «нарушителя» — чужеродного агента, или, если она оснащена «боеголовкой», разрушает клетку-мишень.

6.1. Моноклональные антитела как лекарственные средства

Молекула антитела (иммуноглобулина) состоит из двух «легких» (L) и двух «тяжелых» (Н) белковых цепей, которые соединены водо­родными связями и дисульфидными мостиками, расположенными в строго определенных местах. N-концевые участки L- и Н-цепей обра­зуют антигенсвязывающий сайт, отдельные области (домены) молекулы антитела выполняют разные функции. Антигенсвязывающие сайты состоят из трех участков, определяющих комплементарность антител к антигену (CDR) и образующих вариабельные области (V_H и V₁) на N-концах Н- и L-цепей. Кроме вариабельных (V_H и V₁) каждая L-цепь содержит одну константную область или домен (С₁), каждая Н-цепь три константных области или домена (С_Н1, С _Н2, С _Н3). При обработке антитела протеолитическим ферментом — папаином — образуются три фрагмента: два идентичных (Fab), каждый из которых содержит интактную L-цепь, связанную дисульфидным мостиком с V_H и С_Н1 — до­менами Н-цепи, и один Fс фрагмент, состоящий из двух соединенной дисульфидной связью с С _Н2 и С — доменов Н-цепи. Fab-фрагмент, точнее его N-концевая часть, называемая Fv-фрагментом, обладает атигенсвязывающей активностью, присущей интактной молекуле антитела.

После связывания антигена с интактным антителом запускаются реакции иммунного ответа:

1. Активируется система комплемента; компоненты этой системы разрушают клеточные мембраны, активируют фагоциты и генерируют сигналы, мобилизующие другие компоненты системы иммунного ответа
2. В результате связывания Fc-участка антитела с Fc — рецептором эффекторной клетки, запускается реакция опосредованной антителами клеточной цитотоксичности. Активированная эффекторная клетка высвобождает вещества, лизирующие чужерод­ную клетку, с которой связан Fab-участок молекулы антитела.
3. После связывания Fab-участка с растворимым антигеном, Fc — участок антитела может присоединиться к рецепторам фагоци­тов, которые захватывают и разрушают комплекс антиген — антитело.

Для облегчения доставки лекарственного вещества (ЛВ) к месту его действия используют несколько приемов:
— Заключают в липосомы, липидная оболочка которых имеет высо­кое сродство к клеткам нужных органов.
— Встраивают гены специфических токсинов в инфильтрующие опухоль лимфоциты, которые высвобождают эти токсины непо­средственно в опухоли.
— Присоединяют молекулы ЛB к моноклональным антителам или их Fv-фрагментам, специфичным по отношению к белкам, нахо­дящимся на поверхности строго определенных клеток, например, опухолевых (рис. 13, А).
— Используют ЛВ в неактивной форме, переводя их в активное со­стояние при помощи ферментов. Чтобы такое превращение про­исходило только вблизи клетки-мишени, фермент присоединяют к моноклональному антителу, специфичному к поверхностному антигену этой клетки (рис. 13, Б).

В обоих случаях моноклональное антитело связывается с одним специфическим белком на поверхности клетки-мишени.

6.2. Тромболитики и антикоагулянты

Система свертывания крови состоит из тромбоцитов и содержащихся в них пластиночных факторов (аденозиндифосфата), тканевого тромбопластика, серотонина, антиплазмина, фибронектина, тромбоспондина и др.), плазменных белков, синтезирующихся в клетках печени (протромбина, проконвертина, антигемофильных глобулинов, тромботропина, фибриногена и др.).

Антисвертывающая система представлена плазмином (фибринолизином) — протеолитическим ферментом, находящимся в крови в неактивном состоянии (плазминоген), белками плазмы крови (протеинами С, S, антитромбином III, тормозящими процесс образования фибрина, а также веществами, продуцируемыми (простациклин, тромбомодулин и др.) или фиксированными на эндотелиальных клетках (гепарин). При нарушении равновесия между этими двумя системами может возникать повышенная кровоточивость, тромбообразование или сочетание того и другого.

Наиболее частой причиной смерти являются тромбоэмболия мозговых или сердечных артерий. Известно, что тромб состоит из молекул фибрина, фактора свертывающей систему крови, образующего сеть в ответ на повреждение сосудистой стенки. В норме молекулы фибрина в образовавшемся тромбе расщепляются ферментом, способствующим растворению фибрина in vivo – сериновой протеиназы плазмина, который образуется из плазминогена под действием активатора (рис. 14).

Нередко эта биологическая система работает недостаточно эффек­тивно, что приводит к закупорке артерий. В таких ситуациях для повы­шения уровня плазмина в крови было предложено использовать актива­тор плазминогена (АПг) в качестве терапевтического средства. Однако плазмин способен разрушать и предшественник, фибрина — фибриноген (рис. 15), и если уровень фибриногена в результате терапии с использованием АПг значительно снизится, могут произойти обширные внут­ренние кровотечения.

К моноклональному антителу, специфичному к фибрину, присоеди­нен AПг. Этот комплекс связывается с фибрином, находящимся в тром­бе, АПг вызывает скопление плазмина вблизи тромба, и плазмин лизирует тромб.

Тромболитическая терапия, осуществляемая активаторами плазминогена тканевого типа (ТАПг), широко используется при лечении острого инфаркта миокарда, закупорки мозговых и коронарных арте­рий, эмболии легких.

Плазминоген человека представляет собой одноцепочечный глико­протеин м.м. 90000; его содержание в плазме составляет примерно 2 мкмоля/л. Плазминоген обладает способностью превращаться в плазмин с помощью природных, активаторов плазминогена, находящихся в небольшом количестве в органах и тканях, либо с помощью бактери­альной стрептокиназы. Одно из основных свойств АПг — способность участвовать в процессе фибринолиза. Эти ферменты, представляющие робой естественные тромболитические агенты, имеют огромное значе­ние в борьбе с коронарными и церебральными тромбозами и тромбоза­ми сосудов легких.

Активирование плазминогена стептокиназой заключается в образо­вании на начальной стадии комплекса плазминоген — стрептокиназа, обладающего способностью активировать молекулу плазминогена; этот комплекс затем с помощью ферментативного механизма обеспечивает превращение плазминогена в плазмин.

Плазмин (фибринолизин) является эндопептидазой широкого спек­тра действия. Как плазминоген, так и плазмин содержат по пять дисульфидных мостиков, за счет которых формируются специфические домены. Препарат является протеолитическим ферментом, образую­щимся при активации трипсином содержащегося в крови человека плазминогена. Он вызывает только наружный лизис тромба (преимуще­ственно в венах), так как быстро нейтрализуется антиплазмином, в из­бытке циркулирующим в крови.

Плазмин обладает свойствами активатора, переводящего эндоген­ный плазминоген в плазмин. Продукты деградации фибрина, образую­щиеся при его разрушении, препятствуют полимеризации мономеров фибрина и образованию тромбопластина.

Однако плазмин может вызвать активацию свертывающей системы крови и повысить антифибринолитические свойства крови, поэтому его вводят с гепарином.

Генерируемый активатором плазминогена плазмин кроме растворе­ния тромбов способен стимулировать деление клеток, видоизменять клеточные поверхности, активировать специфические протеазы, пре­вращать проинсулин и проадренокортикотропин в инсулин и АКТГ со­ответственно.

С учетом молекулярной массы, энзиматических и серологических свойств, способности связывать фибрин плазмы крови АПг принято делить на актива­торы тканевого и урокиназного типов.

Активаторы плазминогена тканевого типа. Содержание ТАПг широко варьирует в различных органах: тканей: препарат, полученный из ткани матки человека, характеризуется м.м. 69000 и состоит из двух полипептидных цепей с м.м. 31000 и 38000; фермент, экстрагированный из клеток сосудов трупа человека, имеет м.м. 60000 и состоит из двух близких по размеру полипептидов. Природный ТАПг может существо­вать как в виде протеолитически деградируемой двухцепочечной, так и одноцепочечной формы.

Получают природный ТАПг методом культивирования клеток. Ос­новной источник получения препарата — линия клеток меланомы чело­века; такой фермент — мТАПг характеризуется м.м. 72000 и, в зависимости от условий культивирования и очистки, может быть получен в одно- и двухцепочечной форме. Для очистки ТАПг, полученного из клеток меланомы, применяют аффинную хроматографию с использованием пяти аффинных сорбентов: конканавалина А, n — аминобензамидина, имидинодиуксусной кислоты, борной кислоты, лизина — все марки 5PW.

Метод получения рекомбинантного ТАПг (рТАПг) разработан в 80-х гг.. 20 в. Ген ТАПг расположен у человека в хромосоме 8. Тех­нологи клонирования и экспрессии рТАПг в клетках Е. coli, S. cerevisiae и клетках животных позволили получать ТАПг в промышленных мас­штабах, провести широкое клиническое изучение и выйти на мировой рынок тромболитиков.

Сравнительное изучение мТАПг и рТАПг в отношении тромболизиса при инфаркте миокарда и других типов тромбозов показало полную идентичность их биологических и тромболитических свойств. Лидерами в области разработки рТАПг (альтеплазы) являются фирмы «Genentech» и «Boehringer Ingelheim», выпускающие альтеплазу под торговыми на­званиями activase и actilyse.

Активаторы плазминогена урокиназного типа. Урокиназа — ак­тиватор плазминогена, содержащийся в моче человека, состоит из двух полипептидных цепей (А и В), соединенных между собой дисульфидным мостиком, встречается в высоко- и низкомолекулярной формах (м.м. соответственно 55000 и 34000).

Препарат получают из культуры клеток эмбриона почки человека. Урокиназа активирует плазминоген, превращая его в плазмин. Фибринолитический эффект наступает быстрее, чем от стрептокиназы. Препа­рат способен активировать фибринолиз внутри тромба (эндотромболиз) и на его поверхности (экзотромболизис). По клинико-фармакологичес­кой характеристике урокиназа близка к стрептокиназе. Урокиназа не обладает выраженными антигенными свойствами, поэтому при ее использовании меньшая опасность возникновения аллергических реакций и ее назначают повторно.

Одноцепочечная форма урокиназы получила название проурокиназы. Проурокиназа является проферментом урокиназы, содержится в различных органах и тканях, включая плазму крови. Проурокиназа — одноцепочечный гликопротеин, состоящий из 411 аминокислот. Гидро­лиз одной из пептидных связей плазмином способствует ее трансфор­мации в урокиназу.

Большое значение имеет получение активаторов плазминогена уро­киназного типа методом генной инженерии. Ген урокиназы/проурокиназы локализуется у человека в хромосоме 10; продукт экспрессии гена урокиназы, клонированного в Е. coli, содержит одну или две цепи в зависимости от присутствия ингибиторов протеаз в процессе очистки фермента. Оценка биологических и фибринолитических свойств реком­бинантной урокиназы (р-урокиназы), рекомбинантной проурокиназы (р-проурокиназы) и природной урокиназы, выделенной из мочи, пока­зала, что рекомбинантные урокиназа и проурокиназа обладают лучшей тромбоселективностью и вызывают меньшее число побочных явлений, чем урокиназа.

Стрептокиназа — тромболитик прямого действия, является актива­тором плазминогена, относится к тромболитикам 1 поколения. В очи­щенном виде стрептокиназа представляет собой пористую массу белого цвета без запаха, легко растворимую в воде, м.м. 40000-50000.

Препарат получают из β-гемолитического стрептококка группы С — это непрямой фибринолитик. Стрептокиназа стимулирует перевод циркулирующего в крови проактиватора в активатор, трансформирующий плазминоген в плазмин. Препарат способен проникать внутрь тромба и активировать в нем фибринолиз, чем выгодно отличается от плазмина. Продукты распада тромба, циркулирующие в крови, вызывают гипокоа­гуляцию, блокируют агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, снижают вязкость крови.

Среди тромболитических препаратов стрептокиназа занимает проч­ную позицию, что обусловлено доступностью получения ее из микроб­ного сырья и относительно невысокой реактогенностью (антитела к стрептокиназе исчезают в течение 6 месяцев, иммунологическая реактогенность этого белка обычно проявляется лишь у лиц с отягощенным анамнезом, например, перенесших стрептококковую инфекцию).

На мировом рынке медикаментов лидируют препараты стрептокиназы из микробного сырья: кабиказа (фирма «Kabi Vitrum»), стрептаза (фирма «Hoechst»), стрептокиназа (фирма «Smith Kline»).

Фирма «Phillips Petrolium» (США) запатентовала метод экспрессии стрептокиназы в S. cerevisiae. Экспрессируемый в дрожжах белок по м.м. и активности идентичен стрептокиназе, полученной из Streptococ­cus equisimilis. Метод рекомбинантных ДНК позволил получить высо­кий выход искомого продукта — 1г/1л среды.

Методом рекомбинантных ДНК получен вектор, несущий ген стрептокиназы, адаптированный для трансформации в бактериальный геном (патент США).

Запатентован метод (Германия) ферментационного получения стрептокиназы, генноинженерным способом пущена плазмида, содержащая ген стрептокиназы. Экспрессия стрептокиназы получена трансформацией этой плазмиды в клетки Streptococcus. После фермен­тации таких клеток из культуральной жидкости выделена и очищена стрептокиназа м.м. 42000.

Стрептодеказа — пролонгированный препарат стрептокиназы, от­носящийся к группе иммобилизованных ферментов, нанесенных на во­дорастворимую матрицу полисахаридной природы. Однократное введе­ние средней терапевтической дозы обеспечивает повышение фибринолитической активности крови в течение 48-72 ч.

Рекомбинантный тканевой активатор плазминогена (актилизе) является гликопротеином (полным аналогом эндогенного вещества, вырабатываемого эндотелием), который после системного введения находится в плазме в неактивной форме до момента связывания с фибрином. После активации препарата он способствует переходу плазминогена в плазмин и ведет к растворению фибринового сгустка, повышая фибринолиз только в ткани тромба.

Ацилированный комплекс стрептокиназы и плазминогена (тор­говое название «Эминаза») — тромболитик 2-го поколения, разработан и запатентован английской фирмой «Beecham». Ацильная группа, входя­щая в состав комплекса, защищает тромболитик от инактивации при­родным ингибитором L₂-антиплазмином. По мере поступления «Эминазы» в кровяное русло начинается быстрое гидролитическое отщепление ацильной группы, высвобождение активированного комплекса проис­ходит с постоянной скоростью. Комплекс действует почти исключи­тельно на фибрин кровяного сгустка, не затрагивая фибриноген. Наибо­лее грозное побочное действие тромболитиков — возникновение внезап­ных кровотечений — проявляется при применении «Эминазы» весьма редко. Успех международных клинических испытаний «Эминазы» обеспечил при­знание этого тромболитического средства на мировом рынке.

В качестве тромболитиков предложены химерные (гибридные) мо­лекулы, содержащие домены ТАПг и урокиназы; эти гибридные моле­кулы характеризуются таким же сродством к фибрину и способностью к лизису тромбов, как и рТАПг. Химерные молекулы получают мето­дом слияния концевой кДНК, кодирующей концевой аминосодержащий фрагмент ТАПг, ответственный за специфичность в отношении фибри­на, с кДНК, кодирующей концевой карбоксисодержащий фрагмент проурониказы, ответственный за ферментативные свойства молекулы. Это соединение обладает специфичностью к фибрину, характерной для обеих молекул; лечебная доза этого препарата может быть в 4 раза меньшей, чем доза ТАПг и урокиназы, вводимых отдельно; прямым следствием снижения дозы является уменьшение вероятности возник­новения побочного действия.

Сконструированы химерные молекулы, содержащие фрагменты ТАПг, урокиназы и проурокиназы, клонированные в животных клетках (фирма «Ciba-Geigy», Швейцария).

Разработаны генно-инженерные системы доставки тромболитиков (США). Описано строение моноклонального антитела, способного дос­тавить тромболитический белок к месту образования тромба. Гены, от­ветственные за образование β-цепи ТАПг, были внедрены в гибридомы, продуцирующие антитела, которые экспрессировали белок, способный избирательно доставляться к месту скопления фибрина, кроме того, та­кой активированный белок способен активировать плазминоген (фирма «Genentech»).

Антикоагулянты. Гепарин и его производные принадлежат к числу наиболее безопасных препаратов. Гепарин относится к гуморальным факторам регуляции жидкого состояния крови и обладает высокой свя­зующей способностью практически ко всем факторам системы коагуля­ции. Гепарин нейтрализует действие сериновых протеиназ и фибрино­вых систем за счет образования комплекса антитромбин III-гепарин (АТ-III-гепарин). Препараты гепарина гетерогенны и содержат фракции с высоким и низким средством связывания с AT-III (AT-III является ин­гибитором активаторов плазминогена).

В медицинской практике используются препараты низкомолекуляр­ного или фракционного гепарина — логипарин, фраксипарин, далтепарин, кливарин. Их относят к гепаринам II поколения. Получают низко­молекулярные гепарины методом ферментативной деполимеризации высокомолекулярного гепарина с помощью бактериальной гепариназы. Гепарин повышает активность фибринолитической системы за счет об­разования комплекса с антиплазмином. Гепарин накапливается на по­верхности эндотелиальных клеток и клеток крови, создавая на их мем­бранах концентрацию в 100 раз большую, чем в плазме крови. Этим он придает поверхности эндотелия и тромбоцитов отрицательный заряд, препятствуя их адгезии и агрегации, а также высвобождению из них агрегирующих факторов.

Низкомолекулярные гепарины не влияют на коагуляцию, т.е. они не изменяют время свертывания крови, но их терапевтический эффект больше, чем у высокомолекулярных форм. Это свидетельство того, что основное в действии гепарина — ограничение агрегации и адгезии тром­боцитов. Подтверждением данного механизма является отсутствие корреляции между клинической эффективностью гепарина и увеличе­нием времени свертывания крови.

Антикоагулянт фрагмин (фирма «Kabi Vitrum», Швеция) получают из стандартного гепарина, извлекая из него составную часть, обладаю­щую наибольшей антикоагулянтной активностью. Fragmin имеет доста­точно длительный период полураспада, что позволяет применять его в виде однократной подкожной инъекции. Кроме антикоагулянтного и тромболитического действий отмечено его благоприятное влияние на снижение уровня триглицеридов в крови. ВОЗ рекомендовала исполь­зовать фрагмин в качестве международного стандарта при оценке ле­чебного эффекта и безопасности антикоагулянтов нового поколения.

Методом органического синтеза (фирмы «Organon», Нидерланды и «Choy», Франция) получен гепариноид — аналог гепарина; активное на­чало этого препарата составляют сульфатированные олигосахариды.

Гирудин — антикоагулянт прямого быстрого действия, это белок, вырабатываемый слюнными железами медицинской пиявки (Hirudo medicinalis), которая в течение ряда лет использовалась для предотвра­щения тромбоэмболий мелких сосудов. Гирудин является сильным и специфичным ингибитором тромбина и относится к группе противосвертывающих препаратов прямого быстрого действия, препятствую­щих образованию и отложению нитей фибрина. Он инактивирует свя­занный с фибрином тромбин в тромбах. Существует несколько близкородственных вариантов гирудина (HV₁, HV₂, HV₃). Наиболее изучен HV₁, представляющий белок с м.м. около 7000, состоящий из 65 амино­кислотных остатков. Гирудин ингибирует только тромбин и неактивен в отношении трипсина и плазмина. Введение гирудина не влияет на рабо­ту сердца, органов дыхания, иммунной системы.

В настоящее время гирудин получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Ген гирудина экспрессирован в S. cerevisiae (фирмы «Francgene», «Sanofi», Франция); для очистки препарата ис­пользована ВЭЖХ.

Фирмой «Ciba Geigy» разработан метод экспрессии частично десульфатированного варианта гирудина (десульфатогирудина) в S. cerevisiae. Рекомбинантный гирудин с одной отсутствующей сульфо-группой по антикоагулянтной активности превосходит гепарин.

Белки С и S являются важными факторами антикоагулянтной сис­темы. Белок С был впервые описан в 1960 г. как аутопротромбин II-а и лишь в 1976 г. выделен в чистом виде. Белок С-гликопротеин м.м. 62000 состоит из двух субъединиц, связанных дисульфидным мос­тиком, содержит около 10 аминокислотных остатков γ-карбоксиглютаминовой кислоты.

Белок С является витамин-К-зависимым ингибитором свертываю­щей системы. Имеются данные, что снижение уровня белка С в крови связано с риском возникновения тромбозов, причем дефицит этого бел­ка бывает наследственным и приобретенным; так, при недостатке белка С может развиться тромбофлебит. Дефицит белка С наблюдается при заболеваниях печени (возможно, синтез белка С происходит в этом ор­гане).

Белок S является кофактором белка С и образует с последним акти­вированный комплекс на поверхности фосфолипидных мембран тром­боцитов, эндотелиальных и других клеток; в результате каталитическая способность белка С возрастает. Белок S также является витамин-К- зависимым и имеет высокое средство к отрицательно заряженным фос­фолипидам. Белок S — гликопротеид с м.м. 69000.

Разработана технология получения рекомбинантного белка С (фир­ма «Eli Lilly») в культуре клеток почек, трансформированной аденови­русом. Очищенный белок на 90% представлен двухпептидным компо­нентом и на 10% однопептидным, по активности не уступает белку С, который находится в плазме крови человека. Генноинженерный препарат белка С предложен для лечения последствий ортопедической и абдоми­нальный хирургии, легочной эмболии.

Два рекомбинантных гибрида белка С (антикоагулянтной и фибринолитической активности) (фирма «Hoechst Japan»), не уступающие белку С из крови человека, предупреждают острый инфаркт миокарда и послеоперационные тромбозы.

В 1982 г. выделен и охарактеризован еще один кофактор активации белка С — тромбомодулин, локализованный в мембране эндотелиальных клеток и являющийся кальций-зависимым ингибитором коагуляции и агглютинации тромбоцитов. Тромбомодулин — неразветвленный глико­протеин с м.м. 68000-77000, содержит 117 аминокислотных остатков. Выделен структурный ген тромбомодулина, ген клонирован с после­дующей экспрессией в клетках почек обезьяны (фирма «Asahi Chemical», Япония).

6.3. Аминокислоты

Аминокислоты широко применяют в медицине для терапии после­операционных больных, при лечении заболеваний ЦНС, язвенной бо­лезни желудка и двенадцатиперстной кишки, печени (серотонин, аспа­рагин, валин, гистидин, глицин, глутамин и глутаминовая кислота, изо­лейцин, лейцин, метионин, пролин, тирозин, триптофан, фенилаланин, цистеин). В пищевой промышленности в качестве усилителей вкуса и аромата, антиоксидантов и пищевых добавок (аланин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, лизин, цистеин); в сельском хозяйстве — в качестве кормовых добавок (лизин, треонин); в химиче­ской промышленности — как исходные вещества при синтезе полимеров и производстве косметических средств.

Ежегодно в мире производится более 800000 тонн аминокислот стоимо­стью более 5 млрд. долларов; при этом больше половины общего объема производства приходится на долю L-глутаминовой кислоты, которую используют для получения широко известного усилителя вкуса и аро­мата — натрия глутамата.

В промышленном масштабе аминокислоты получают, в основном, экстракцией из белковых гидролизатов или очисткой продуктов мета­болизма двух неспорулирующих грамположительных почвенных бакте­рий — Corynebacterium или Brevi bacterium spp. Обычно для повышения продуктивности этих микроорганизмов используют мутагенез с после­дующим отбором штаммов — сверхпродуцентов определенных амино­кислот, но такой способ получения штаммов требует много времени и эффективность его невелика. Альтернативные подходы — выделение и изменение специфических генов, кодирующих ключевые ферменты определенных биохимических реакций. Например, генноинженерный спо­соб получения аминокислоты триптофана, синтезируемой C. glutamicum, одного из видов Corynebacterium. Для этого в клетки С. glutamicum дикого типа введена копия гена, кодирующего антранилатсинтазу, фер­мента, лимитирующего синтез триптофана.

Высокий уровень биосинтеза триптофана достигают введением в клетки С. glutamicum модифицированных генов трех ключевых фер­ментов: 3-дезокси-Д-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазы, антранилатсинтазы и антранилатфосфорибозилтрансферазы. В качестве альтернативы для синтеза аминокислот можно использовать Е. coli.

Известно, что важным регулятором функций клеток, тканей и орга­нов, осуществляемых через жидкие, среды организма, является α₂ — макроглобулин (МГ). Этот белок способен ингибировать активность протеолитеческих ферментов, транспортировать цитокины, регулиро­вать процессы эндоцитоза, кооперации различных клеток крови, презентировать микроорганизмы и гены. Из плазмы крови человека очисткой α₂ — макроглобулина, сочетающей дробное осаждение полиэтиленгликолем, анио­нообменной и металхелатной аффинной хроматографией, получен нативный белок, имеющий уникальные регуляторные свойства — высокую ингибирующую активность в отношении протеиназ, препарат (НПО «Вектор», Новокузнецкий ГИУВ) показан при воспалительных процессах, передозировках протеиназ, септических состояниях, вызван­ных микроорганизмами. На основе нативного α₂ – макроглобулина получены стабиль­ные комплексы, имеющие полную биологическую совместимость с плазмином и интерфероном α-ИФ₂. Доставка комплекса α₂-МГ- ИФ₂ непосредственно в опухоль весьма перспективна в онкологии.

Природные пептиды любого происхождения универсальны, они оказывают защитное действие на организм, стимулируя работу иммунной системы. Ценным сырьем для получения полипептидов являются гидробионты. Первым препаратом гидробионтов был ганглин, полученный в 1981 г.г. НПО «Биомед» из ганглиев тихоокеанских кальмаров методом ультрафильтрационной очистки и выделения пептидов. Ганглин содержит 45 пептидных фрак­ций. Иммуномодулирующие свойства ганглина определили его приме­нение для устранения любых вторичных иммунодефицитов. Препарат оказывает регулирующее влияние на реакции клеточного и гуморально­го звеньев иммунитета и неспецифическую резистентность организма, усиливает функциональную активность ПМЯЛ и макрофагов, стимули­рует образование, дифференцировку и функциональную активность Т-лимфоцитов, синтез специфических антител в сыворотке крови, уменьшает развитие аутоиммунных процессов, обладает антигистаминными, антисеротониновыми, противовоспалительными свойствами.

Ганглин зарегистрирован в качестве пищевой добавки для ветери­нарии, корригирующей иммунодефициты и оказывающей положитель­ное влияние на гомопоэз.

Препарат гидробионтов – молокин — получен из молок лососевых рыб; наряду с иммунорегулирующей активностью обладает гонадо­тропными свойствами.

Препарат вермин (НПО «Биомед») представляет собой очищенную, стерильную, лиофильно высушенную смесь белков и пептидов, экстра­гированных из гомогената червей Eisenia foetida; препарат нетоксичен, не проявляет мутагенной активности, обладает ферментативной актив­ностью оксидоредуктаз, трансфераз и гидролаз, оказывает иммуномо­дулирующее действие. Мазь на основе вермина предложена для лече­ния длительно незаживающих гнойных ран.

6.4. Синтез L-аскорбиновой кислоты

В настоящее время для крупномасштабного производства L-аскорбиновой кислоты (витамина С) используют преимущественно трудоемкий процесс, включающий одну микробиологическую стадию и не­сколько химических. Исходным субстратом для него является D-глюкоза (рис. 16). На последнем этапе этого процесса 2-кето-L-гулоновая кислота (2- KLG) превращается в кислых условиях L-аскорбиновую кислоту.

Биохимические исследования метаболизма различных микроорга­низмов показали, что 2-KLG можно получить, включая совместное культивирование микроорганизмов Corynebacterium и Erwinica herbicola для превращения глюкозы в 2-KLG. Однако условия культивирования, оптимальные для одного организма, неприемлемы для другого, что вле­чет спонтанное «вымывание» из среды одного из них. В подобных случаях можно культивировать микроорганизмы последовательно, но та­кой процесс трудно сделать непрерывным, так как для роста микроор­ганизмов необходимы существенно разные среды (рис. 17).

Наиболее простой способ — создание одного микроорганизма, способного превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в выделении гена 2,5-DKG-редуктазы Corynebacterium и введении его в Erwinica herbicola (рис. 18).

Трансформированные клетки Erwinica herbicola активно превраща­ют D-глюкозу непосредственно в 2-KLG. При этом собственные фер­менты Erwinica herbicola, локализованные во внутренней мембране бак­териальной клетки, преобразуют глюкозу в 2,5-DKG (2,5-дикетоглюкановая кислота), а 2,5- DKG -редуктаза, локализованная в цитоплазме, катализирует процесс превращения 2,5-DKG в 2-KLG.

Следовательно, с помощью генетических манипуляций удалось в одном организме осуществить метаболические реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный продукт комбинированного метаболического пути. Такой организм используется как фабрика для производства 2-KLG, заменяющая три стадии в том процессе получения L-аскор­биновой кислоты, который доминирует и в настоящее время.

6.5. Гормональные препараты

6.5.1. Инсулин

Инсулин синтезируется β-клетками островков Лангерганса подже­лудочной железы; 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно этот белок.

Человеческий инсулин — полипептид с м.м. 5808, состоящий из 51-й аминокислоты, которые образуют две соединенные дисульфидными мостиками полипептидные цепи (одна цепь состоит из 21 аминокисло­ты, так называемая цепь А; другая — из 30 аминокислотных остатков, так называемая цепь В). Аминокислотный состав цепей видоспецифи­чен. Предшественник инсулина продуцируется внутри β-клеток посред­ством ДНК- и РНК — управляемого синтеза. Длинная цепь проинсулина в аппарате Гольджи упаковывается в гранулы, где в результате гидролиза удаляются четыре аминокислоты (обозначенные пунктом на рис. 19) с образованием инсулина и связывающего пигмента, называемого С-пептидом. Инсулин и С-пептид в эквивалентных концентрациях секре­тируются в ответ на все стимуляторы секреции инсулина (глюкозу, маннозу и некоторые аминокислоты – лейцин, аргинин). Выделяется также небольшое количество нативного или частично гидролизованного проинсулина, который оказывает некоторое гипогликемическое дейст­вие. В гранулах β-клеток инсулин депонируется в виде кристаллов, состоящих из двух атомов цинка и шести молекул инсулина. В целом, че­ловеческая поджелудочная железа содержит до 8 мг инсулина, что со­ставляет приблизительно 200 биологических «единиц» (количество единиц определяют по массе препарата; существующий инсулиновый стандарт, используемый в аналитических целях, составляет 28 ЕД/мг).

Инсулин обладает мощным действием, охватывающим биосинтез нуклеиновых кислот, белков, обмен, углеводов, липидов, продукцию высокоэнергетических соединений. Инсулин регулирует углеводный обмен, усиливает усвоение тканями глюкозы и способствует превраще­нию ее в гликоген, облегчает проникновение глюкозы в клетки тканей. Будучи специфическим средством терапии сахарного диабета, инсулин снижает гипергликемию и глюкозурию, пополняет депо гликогена в мышцах и печени, уменьшает образование глюкозы, снимает диабети­ческую липемию, улучшает общее состояние больного. Единственное отличие больного человека от здорового в том, что здоровые получают этот гормон благодаря собственной поджелудочной железе, больные — из рук государства.

Сахарный диабетом I типа — инсулинзависимым диабетом (ИЗСД) — официально больны свыше 3 млн. российских граждан, «неофициально» — до 10 млн. Известно, что ИЗСД (тяжелая форма, при отсутствии лече­ния приводящая к кетозу), наряду с сердечно-сосудистыми и онкологи­ческими заболеваниями занимает одно из ведущих мест по медико-социальной значимости и является причиной ранней инвалидности и высокой смертности. Диабет II типа — инсулиннезависимый (ИНЗСД) включает более легкие формы диабета. Диабетом этого типа чаще бо­леют тучные люди.

История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 в.), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы.

В 1922 г. инсулин, выделенный из поджелудочной железы животно­го, впервые введён 10-летнему мальчику (Торонто), больному диа­бетом. Результат превзошёл все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина. Поджелудочная железа крупного рогатого скота (КРС) и свиней постав­ляется бойням, где опытный персонал по разработанной методике из­влекает железы из туш, их быстро замораживают (оптимальная темпе­ратура — 70 °С) и в вагонах-рефрежераторах направляют на фармацевтические предприятия, где экстрагируют гормон. Масса поджелудочной железы КРС составляет в среднем 200-250 г, для получения 100 г кри­сталлического инсулина требуется 1000 — 1200 кг исходного сырья. Бычий (говяжий) гормон, в отличие от свиного, обладает несколько боль­шей антигенностью для человека. После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько лет пройден огром­ный путь его выделения и очистки, в результате гормон стал доступен для лечения больных сахарным диабетом I типа. Для адекватного кон­троля уровня глюкозы в крови инсулин нужно было вводить подкожно 4 раза в сутки.

В 1935 г. датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат — протамин-цинк-инсулин (вводили один раз в сутки).

Первые кристаллы инсулинабыли получены в 1952 г.; развитие ме­тодов очистки гормона (иммуноэлектрофорез, ВЭЖХ) от других гормо­нальных веществ (глюкагона — антагониста инсулина и соматостатина, последний подавляет выделение инсулина и глюкагона) и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, назы­ваемый однокомпонентным.

В 1954 г. английский биохимик Г. Сенджер получил Нобелевскую премию за расшифровку структуры инсулина.

Синтез обеих цепей инсулина и соединение их дисульфидными свя­зями был проведён в 1963-1965 гг. В начале 70-х гг. советскими учёны­ми А. Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина. Осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоя­щий и сложный синтез полипептидного гормона, состоящего из десятков аминокислотных остатков нерентабельно, в том числе и по причине малого выхода.

В 70-е гг. 20 века шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшило проблемы, обусловленные инсулиновой аллергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и  иммун­ной резистентностью к инсулину. Со времени открытия и до начала 80-х гг. использовали инсулин, получаемый из поджелудочной железы КРС и свиней. Инсулин КРС отличается тремя аминокислотами, свиной — одной аминокислотой от инсулина человека. Наиболее эффективный, гормон для заместительной терапии при сахарном диабете — гомоло­гичный инсулин, т.е. инсулин человека.

В 1980 г. Датская фармацевтическая компания «Novo» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментатив­ным замещением аланина, последний является 30-й аминокислотой в цепи В, на остаток треонина с последующей хроматографической очисткой продукта, в результате чего получен однокомпонентный инсулин человека 99% чистоты.

Достижения молекулярной биологии позволили установить, что биосинтез инсулина в β-клетках островковой ткани происходит по сле­дующим основным этапам:

— закодированная информация о структуре гормона содержится в инсулиновом гене (участок ДНК) 11-й хромосомы;

— в результате стимулирующего действия, прежде всего глюкозы и некоторых других веществ, эта информация списывается РНК-полимеразой с инсулинового гена в виде мРНК на рибосо­мах, в которых осуществляется соединение аминокислот с обра­зованием белков. На рибосомах происходит сборка полипептидной цепи из 109 аминокислот с образованием препроинсулина под влиянием рестриктаз, в результате образуются фраг­менты от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов; при синтезе препроинсулина в β-клетках поджелудочной желе­зы первые 23 аминокислоты «проводят» молекулу через мем­брану клетки. Эти аминокислоты отщепляются рестриктазами и образуется пептид проинсулин, состоящий из 86 аминокислот. Молекула проинсулина сворачивается таким образом, что на­чальный и конечный её сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется под влиянием ферментов рестрикции; роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсулина.

В Великобритании с помощью Е. coli синтезированы обе цепи чело­веческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биоло­гически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синте­зировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, т.е. ввести ему ген гормона. Химическим спо­собом (операцию проводят специалисты биохимики) получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина. Следующий этап — включение гена предшественника инсулина (или гены цепей инсулина порознь) в геном Е. coli — особого штамма кишеч­ной палочки, выращенного в лабораторных условиях; эту задачу вы­полняет генная инженерия. Из Е. coli вычленяют плазмиду соответст­вующей рестриктазой. Синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы Е. coli). В результате Е. coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путём, затем проводят их очистку. В бактериях синтезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

Природа гормонального вещества, продуцируемого Е. coli, обуслов­лена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рест­риктазами для отщепления препептида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин. Для полу­чения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гиб­ридный белок подвергают химико-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фронтальной, гельпроникающей, анионообменной).

В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинант­ный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов Е. coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содер­жащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществ­ляется в той же последовательности, что и in vivo — отщепляется лиди­рующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановитель­ным замыканием трёх дисульфидных связей и ферментативным вычле­нением связывающего С-пептида. После ряда хроматографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают челове­ческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

Использование аффинной хроматографии значительно снизило со­держание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщеп­ленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител. Стандартизация инсулина по загрязнению классифицирует препараты на обычные —  содержащие проинсулина бо­лее 1%, монопиковые — менее 0,3%, улучшенные монопиковые — ме­нее 0,005% и монокомпонентные, содержащие менее 0,001% проинсу­лина.

Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Наиболее частые осложнения инсулиновой терапии — гипогликемические состоя­ния, основными признаками избытка инсулина являются нарушения функции ЦНС (спутанность сознания, странное поведение, кома).

Компания «Eli Lilly» в массовом производстве человеческого инсу­лина использует технологию рекомбинантных ДНК, помещая кДНК гена человеческого проинсулина в Е. coli или S. serevisae и гидролизуя наработанный проинсулин до молекулы инсулина. Человеческие инсулины этой фирмы носят название «Хумулин». В медицинской практике используют рекомбинатные человеческие инсулины из серии Хумулин («Eli Lilly») — регулярный, НПХ, ленте, ультраленте и их комбиниро­ванные составы. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и неза­висимо от формы препарата имеет более короткую длительность дейст­вия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногенны, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.

В молекуле инсулина обнаружены области, играющие повышенную роль в его физико-химических и биологических свойствах. При внесе­нии мутационных изменений в аминокислотную последовательность этих областей, существенным образом изменяются свойства молекулы в целом. Удалось получить аналоги с модификацией В-цепи, что привело к значительному увеличению гормональной активности по сравнению с природным инсулином.

Контроль качества генноинженерного инсулина предполагает кон­троль дополнительных показателей, характеризующих стабильность рекомбинантного штамма и плазмиды, отсутствие постороннего гене­тического материала в препарате, идентичность экспрессируемого гена и др. (всего 22 показателя).

В настоящее время в медицинской практике используют инсулины трех типов:
— короткодействующие с быстрым началом эффекта;
— средней продолжительности действия;
— длительного действия с медленным проявлением эффекта.

Инсулин короткого действия — регулярный инсулин — представляет собой короткодействующий растворимый при нейтральном значении pH кристаллический цинк-инсулин, эффект которого развивается в те­чение 15 мин после подкожного введения и продолжается 5-7 ч.

С целью увеличения длительности действия все другие препараты инсулина модифицированы и при растворении в нейтральной среде об­разуют суспензию. Они содержат протамин в фосфатном буфере — протамин-цинк-инсулин и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) — НПХ-инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере — инсулины ультраленте, ленте, семиленте.

Препараты инсулина средней длительности действия содержат про­тамин, представляющий белок средней м.м. 4400, богатый аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1:10. После подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин, позволяя инсулину всасываться.

НПХ-инсулин не изменяет фармакокинетический профиль смеши­ваемого с ним регулярного инсулина. НПХ-инсулин предпочтительнее инсулина ленте в качестве компонента средней длительности действия в терапевтических смесях, содержащих регулярный инсулин.

В фосфатном буфере все инсулины (свиной, бычий, человеческий) легко образуют кристаллы с цинком, но только кристаллы бычьего ин­сулина обладают достаточной гидрофобностью, чтобы обеспечить за­медленное и стабильное высвобождение инсулина, характерного для ультраленте. Цинковые кристаллы свиного инсулина растворяются бы­стрее, эффект, наступает раньше, длительность действия короче. Поэто­му не существует препарата ультраленте, содержащего только свиной инсулин. Монокомпонентный свиной инсулин выпускают под названи­ем инсулин-суспензия, инсулан-нейтрал, инсулин-изофан, инсулин-аминохинурид.

Инсулин ленте — это смесь 30% инсулина семиленте (аморфный преципитат инсулина с ионами цинка в ацетатном буфере, эффект кото­рого развеивается относительно быстро) с 70% инсулина ультраленте (плохо растворимый кристаллический цинк-инсулин, имеющий замед­ленное начало и пролонгированное действие). Эти два компонента обеспечивают комбинацию с относительно быстрой абсорбцией и ста­бильным длительным действием, делая инсулин-ленте удобным тера­певтическим средством.

При введении инсулина в виде аэрозоля на слизистую оболочку но­са эффективный уровень препарата в плазме достигается быстро, одна­ко, длительное интраназальное введение инсулина оказывает токсиче­ское действие на слизистую оболочку.

6.5.2 Соматотпропный гормон (СТГ) или гормон роста человека

СТГ — пептидный гормон, состоящий из 191 аминокислоты, секретируется передней долей гипофиза. Впервые гормон был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза, полученного из трупного материала. Де­фицит этого гормона приводит к гипофизарной карликовости, частота встречаемости которой оценивается от 7 до 10 случаев на миллион че­ловек (среди детей западных стран она составляет 1 на 5000 человек). Гормон видоспецифичен и является единственным средством лечения детей, страдающих от его недостатка; внутримышечное введение СТГ 10 мг/кт в течение года по три инъекции в неделю увеличивает рост я течение первого года лечения более чем на 6 см. Для достижения более ощутимых результатов введение гормона необходимо продолжать от возраста 4-5 лет до половой зрелости и даже далее. Из одного трупа удается получить 4-6 мг соматотропина в пересчете на конечный фар­мацевтический препарат.

Общего количества фармацевтического препарата, выпускаемого компаниями крупных производителей СТГ, хватало для лечения лишь одной трети случаев гипофизарной карликовости в развитых странах; недостаток соматотропина оказался ещё более острым с учетом других случаев его применения (незаживающие переломы, ожоги, язвы, нару­шение гемопоэза).

К тому же возникли проблемы, связанные с гетерогенностью гор­мона, выделяемого из трупного материала. Несмотря на совершенство­вание выделения и очистки гормона, у 5% больных, получавших препарат, вырабатывались антитела, которые сводили на нет его биологиче­скую активность. Кроме того, гипофизарный материал заражён нейротоксическим вирусом с необычайно длительным инкубационным пе­риодом, поэтому дети, получавшие СТГ, нуждались в многолетнем ме­дицинском наблюдении. Вирус, содержавшийся в препаратах СТГ, не­редко приводил к летальному исходу. С 1985 г. ВОЗ запрещено применение гормона, выделяемого из человеческих гипофизов.

Рекомбинантный соматотропин, получивший название соматрем, стал вторым (после человеческого инсулина) биосинтетическим фарма­цевтическим препаратом. СТГ, биологически чистый и свободный от вирусных загрязнений, впервые был получен в 1980 г. фирмой «Genentech». Гормон, синтезированный в генетически сконструированных клетках кишечной палочки, отличается от гормона, выделенного из ги­пофиза, дополнительным остатком метионина на NH₂-конце молекулы (гормон обладает биологической активностью нативного гормона и даже большим эффектом, чем гормон роста из гипофиза, по-видимому, по причине большей чистоты). У детей, страдающих гипофизарной карликовостью, зарегистрирован прирост на 8 – 18 см в год, что несколько боль­ше эффекта гормона, полученного из гипофиза. На первом этапе клони­ровали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикцион­ными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединяли, затем «подстроили» к паре промоторов (промотор — спе­цифическая последовательность в ДНК, необходимая для инициации транскрипции РНК-полимеразы) и участку связывания рибосом. Коненчный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры Е. coli (100000 молекул гормона на клетку). СТГ, синтезированный в бактериях, обладал нужной м.м. и не был связан с каким-либо бактериальным белком, от которого его необходимо было бы отщеплять.

Изменяя аминокислотную последовательность СТГ, т.е. его первичную структуру посредством модификации кодирующего его гена, в бактериальных клетках можно синтезировать аналоги гормона, очень важные для изучения активных участков молекулы (например, участ­ков, которые стимулируют рост или оказывают действие на неоглюко­генез) и этиологии карликовости на молекулярном уровне.

Используя методы рекомбинантных ДНК, можно синтезировать и другие факторы роста и факторы дифференцировки тканей, выделив вначале их мРНК, затем получив соответствующие гены. Это относится к соматомедину А, стимулирующему фиксацию серы в хряще, образо­вание которого индуцируется соматотропином.

В 1982 г. выделен и синтезирован полипептид, состоящий из 44 аминокислотных остатков, обладающий полной биологической ак­тивностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ- РФ). Введение СТГ-РФ способно компенсировать недостаток соматотропина. Применение СТГ-РФ возможно не только для лечения гипофизарной карликовости, но и при некоторых формах диабета и для ус­корения регенерации тканей у людей, получивших сильные ожоги.

6.5.3. Эритропоэтин

Эритропоэтин (греч. eritrhros — красный + poietikos — создающий, производящий) — гормон гликопротеиновой природы, стимулирующий пролиферацию и диффенренцировку эритропоэтин-чувствительных клеток в морфологически распознаваемые эритробласты. Это полипептид, состоящий из 165 ами­нокислот с м.м. 30400. Эритропоэтин стимулирует пролиферацию и дифференцировку клеток эритроидного ростка, действует на специфиче­ские рецепторы эритропоэтина, которые имеются на предшественниках эритроцитов в костном мозге. Эндогенный эритропоэтин выделяется в почках в ответ на тканевую гипоксию. При анемии индукция эритропо­этина повышена, что стимулирует образование эритроцитов в красном мозге и приводит к коррекции анемии. Эритропоэтин показан больным с почечной недостаточностью и выраженной анемией. Он повышает уровень гемоглобина и обычно снимает необходимость переливания крови у этих пациентов; эритропоэтин полезен при СПИДе и раке.

Эритропоэтин выделен первым из всех гемопоэтических факторов (впервые получен из мочи больных тяжелой анемией). Получение зна­чимых количеств эритропоэтина человека из природных источников практически невозможно из-за низкого его содержания в сырье. С ис­пользованием генноинженерной технологии в культуре клеток млеко­питающих (штамм СНО) получают рекомбинантный человеческий эритропоэтин. Производство препарата основано на комбинации иммуноаффинной и ионно-обменной хроматография и позволяет получать практически гомогенный, мономерный, полностью активный белок, не содержащий значимых примесей. Уже много лет, получаемый по новой технологии, эритролоэтин является, ведущим продуктом предприятия Amgen — Калифорния (США). Годовой оборот от его производства со­ставляет более 3 млрд. долларов.

Эритропоэтин принадлежит к четырем генно-инжёнерным препара­там, производимым в России. В частности, НПО «Микроген» выпускает «Эритростим», представляющий высокоочищенный (99,5 %) рекомби­нантный эритропоэтин человека с сывороточным альбумином в виде раствора на изотоническом нитратном буфере.

6.6. Вакцины

Вирусы — облигатные (безусловные) внутриклеточные паразиты, чья репликация полностью зависит от процессов синтеза ДНК, РНК и белков в клетке хозяина.

Репликация вирусов включает несколько этапов:
— адсорбция и проникновение в клетку;
— синтез ранних, неструктурных белков, например, полимераз, нуклеиновых кислот;
— синтез РНК или ДНК;
— синтез конечных структурных белков;
— сборка (созревание) вирусных частиц и их выход из клетки.

При многих вирусных инфекциях репликация вируса достигает максимума во времени появления первых клинических признаков заболевания или даже ранее. Формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам способствует вакцинация. Антитела, выраба­тываемые в ответ на введение вакцины в организм, запускают иммун­ный ответ — вырабатываются антитела, которые при последующей ин­фекции блокируют пролиферацию патогенного микроорганизма и не позволяют развиться заболеванию.

Эффект вакцинации был открыт более 200 лет назад (1796 г.) вра­чом Эдвардом Дженнером, доказавшим, что человек, перенесший коро­вью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, стано­вится невосприимчив к оспе натуральной. Натуральная оспа — высоко­контагиозное (заразное) заболевание, с высокой смертностью. Даже, если больной не погибает, у него нередко возникают различные уродст­ва, психические расстройства, слепота. Э. Дженнер публично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из пустулы больной коровьей оспой, а затем, через определенное время, дважды инфицировал ребенка гноем из пус­тулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограни­чились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней.

Начиная с первой вакцины, созданной Э. Дженнером, большинство человеческих противовирусных вакцин созданы на основе убитых (инактивированных) патогенных микроорганизмов или живых, но не вирулентных (аттенуированных) штаммов. Этот подход достаточно эф­фективен и предотвращает распространение многих вирусных инфек­ций, однако его применение ограничено рядом причин:
— невозможностью культивирования всех патогенных микроорга­низмов;
— потенциальной опасностью в работе с патогенными микроорга­низмами и вирусами;
— возможностью возвращаться к исходному вирулектному штамму аттенуированных штаммов (инактивация часто бывает неполной);
— высокой стоимостью производства традиционных вакцин (титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их размножения, как правило, невысоки).

Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать новое поко­ление вакцин более безопасных и эффективных, менее дорогих, не имеющих ограничений в применении.

При этом используют разные подходы:

1. Патогенный микроорганизм модифицируют, убирая гены, ответственные за вирулентность, при этом сохраняется способность штамма вызывать иммунный ответ. Получаются жи­вые вакцины, содержащие непатогенные микроорганизмы, кото­рые не могут ревертировать и становиться патогенными.

2. Гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты (белки) патогенных микроорганизмов, экспрессиру­ют в альтернативном хозяине, например Е. coli, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакци­ну. Такие вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют субъединичными вакцина­ми. Достоинства субъединичных вакцин состоят в том, что пре­парат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могут быть причиной нежелательных побочных эффектов в организме-хозяине. Недостатки субъединичных вакцин — очистка специ­фического белка высока по стоимости, его конформация после выделения может отличаться от той, которую он имеет в составе вирусного капсида или оболочки, что может повлечь изменение его антигенных свойств.

3. Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детер­минанты патогенного организма, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают живую безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Жи­вые вакцины, как правило, более эффективны, чем неживые или субъединичные.

Одним из новых направлений создания рекомбинантных вакцин яв­ляется разработка ДНК-вакцин (так называемых генных, полинуклеотидных вакцин, вакцин из нуклеиновых кислот). Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят моле­кулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного организма и генетические элементы, которые необходимы для экспрессии этого гена в клетках эукариотов (человека). В качестве продуцентов таких генов используют бактериальные клетки, содержащие рекомбинантные плазмиды с соотвествующими генами. После получе­ния достаточной биомассы (количества копий) плазмидную ДНК выде­ляют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Полу­ченную ДНК-вакцину вводят парентерально, при этом большая ее часть поступает в межклеточное пространство, после чего включается в клетки.

Противогерпетические вакцины. Вирус простого герпеса (HSV — Herpes simplex virus) вызывает инфекционное заболевание генерализо­ванного или местного характера (характеризуется преимущественно поражением кожи, слизистых оболочек, нервной системы и хрониче­ским рецидивирующим течением, урогенитальными инфекциями, тяже­лым поражением глаз, энцефалитом и т.д.). Кроме того, он является онкогенным, поэтому вакцинация убитым или аттенуированным вирусом сопряжена с определенным риском развития рака. Для защиты от HSV- инфекции используют неонкогенную субъединенную вакцину.

Для создания любой субъединенной вакцины, прежде всего, идентифицируют те компоненты патогенного микроорганизма, которые инду­цируют выработку антител. В случае HSV-типа таким компонентом является гликопротеин Д-оболочки (gД). В ответ на введение этого гли­копротеина мышам у них вырабатываются антитела, нейтрализующие интактный HSV. Ген gД HSV-1 был изолирован, клонирован в одном из экспрессирующих векторов в клетках млекопитающих и введен в яйце­клетки китайского хомячка (СНО), в которых, в отличие от Е. coli, про­исходит гликолизирование чужеродных белков. Полноразмерный ген gД кодирует белок, в норме называющийся с мембраной клетки млекопитающего. Затем модифицированным геном трансформировали СНО-клетки, которые гликозилировали белковый продукт и секретировали его во внешнюю среду, так как он не мог встраиваться в клеточ­ную мембрану. Антитела, вырабатываемые в ответ на введение модифицированного белка gД, эффективны в отношении вируса простого герпеса.

Противосальмонеллезные вакцины. Разные штаммы Salmonella вызывают острые кишечные инфекции, постнатальную (послеродовую) инфекцию, брюшной тиф, пищевую токсикоинфекцию. Для профилак­тики всех этих заболеваний у овец, КРС, цыплят и человека эффектив­ные пероральные вакцины созданы методом двойной делеции.

Такой способ получения непатогенных штаммов, пригодных для создания на их основе живых вакцин, состоит в удалении из генома па­тогенных бактерий хромосомных областей, отвечающих за независи­мые жизненноважные функции. Лучше делетировать по крайней мере две такие области, так как вероятность их одновременного восстанов­ления очень мала. Штамм с двойной делецией обладает ограниченной пролиферативной способностью и сниженной патогенностью, но обес­печивает выработку иммунного ответа. Штаммы Salmonella с двойной делецией вызывают легкую форму инфекции и обладают в 100000 раз меньшей вирулентностью.

6.7. Цитокины

Цитокины — большая гетерогенная группа белков с различными функциями, синтезируемая лимфоретикулярными клетками. Цитокины участвуют во многих видах взаимодействий, обеспечивающих функ­ционирование иммунной системы и контроль гемопоэза. Первая группа цитокинов была представлена интерферонами (ИФН), часть цитокинов была классифицирована как интерлейкины (ИЛ), пронумерованные в порядке их обнаружения.

ИФН — это группа эндогенных гликопротеидов с м.м. около 3000, которые оказывают неспецифическое противовирусное действие, влияя на клеточные метаболические процессы синтеза РНК и белка. Первона­чально было установлено, что ИФН вырабатывают клетки, инфициро­ванные вирусами (тип I); в дальнейшем — что ИФН вырабатывают так­же лимфоциты в ходе иммунной реакции (тип II).

Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка.

Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК  интерферонов состоит в следующем:
— Из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.
— Полученным продуктом трансформируют Е. coli, образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.
— Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН — мРНК.
— Из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и кРНК, выде­ляют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка.
— Определяют интерферонную противовирусную активность каж­дой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, про­явившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН — мРНК; повторно идентифици­руют клон, содержащий полноразмерную ИФН — кДНК че­ловека.

ИФН проявляют некоторые виды активности как лимфокины и им­муномодуляторы. ИФН I типа, действующие преимущественно как ин­гибиторы репликации вирусов в клетке, реализуют свой эффект, стиму­лируя выработку рибосомами клеток хозяина клеточных ферментов, которые тормозят продукцию вирусов, нарушая трансляцию вирусной мРНК и синтез вирусных белков.

ИФН вырабатывают большинство видов животных, но проявление их активности видоспецифично, т.е. они действуют только у того вида животных, в которых вырабатываются.

Описаны три основных человеческих ИФН:
— ИФН — α, представляющий собой фибробластный ИФН типа I;
— ИФН — β — человеческий фибробластный ИФН типа I;
— ИФН — γ — человеческий иммунный ИФН типа II.

ИФН, вырабатываемые клетками любого типа, различают по хими­ческому строению и виду активности (табл. 2). ИФН являются одним из основных эндогенных факторов, препятствующих поражению организ­ма вирусной инфекцией.

ИФН вызывают индукцию трех ферментов:
— протеинкиназы, нарушающей начальный этап построения пеп­тидной цепи;
— олигоизоаденилатсинтетазы, активирующей РНК-азу, которая разрушает вирусную РНК;
— фосфодиэстеразы, разрушающей конечные нуклеотиды тРНК, что приводит к нарушению элонгации пептида.

С учетом антивирусного и иммуномоделирующего эффектов ИФН в НПО «Биомед» предложены и успешно апробированы суппозитории с ИФН-α и пробиотиками при терапии дисбактериозов вирусной и бак­териальной этиологии, кандидозов; в гинекологической практике для лечения эндометритов, кольпитов, вагинитов и гинекологического гер­песа.

Побочные эффекты ИФН включают лихорадку, утомляемость, го­ловные боли, слабость, миалгии, анемии, желудочно-кишечные и сердечнососудистые нарушения.

Развитие методов клонирования генов в значительной мере облег­чило продукцию высокоочищенных цитокинов всех типов и идентифи­кацию большинства интерлейкинов (ИЛ).

Специфический ген человеческого ИЛ с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид (участок гибридной белковой молекулы, облегчающий идентификацию и очистку белка), переносят в микробные клетки-продуценты, где экспрессируется хи­мерный белок (продукт клонированного гена, защищенный одной или несколькими аминокислотами от расщепления протеиназами клетки- хозяина). Конструирование рекомбинантных молекул ИЛ осуществля­ется набором специфичных ферментов. Маркерный пептид, входящий в состав химерного белка, очищают иммуноафинной хроматографией.

Название препарата	Подтип ИФН	Способ получения	Фармакологическое действие	Показания к применению
Интерферон	α	Биосинтез в культуре лейкоцитов донорской крови под воздействием вирусов	Антивирусное, иммуномодулирующее, антипроли­феративное	Вирусные заболевания, лейкоз, злокачественная меланома, рак почек, карциноидный синдром
Интерлок	α	Биосинтез в культуре лейкоцитов донорской крови под воздействием парами­ковирусов	Подавляет жизнедеятель­ность ряда вирусов	Вирусные заболевания глаз, гепатиты
Интерферон  альфа-2	α2	Рекомбинантный	Антивирусное, иммуномодулирующее, ингибирует пролиферацию большого спектра опухолевых	Эпителиальная форма ост­рой и рецидивирующей вирусной инфекции глаз, онкологические заболевания
Интерферон  альфа-2а	α2а	Рекомбинантный. Белок, содержащий 165 аминокислот	Противовирусная, проти­воопухолевая активность	Лейкемический ретикулоэндотелиоз, саркома Капоши, рак почки, мочевого пузыря, меланома, опоясывающий лишай
Реаферон	α2	Рекомбинантный ИФН, продуцируемый бактериальным штаммом псевдомонады, в генетический аппарат который встроен ген человеческого лейкоцитарного ИФНα2. Идентичен человеческому лейкоцитарному ИФНα2.	Противовирусная, иммуномодулирующая, противоопухолевая активность	Вирусные, опухолевые заболевания
Интерферон  альфа-n1	αn1	Высокоочищенный человеческий ИФН	Противовирусная	Хронический активный инфекционный гепатит В
Интерферон  бета	β	Суперпродукция фибробластов человека стимулятором в присутствии ингибиторов обменных процессов	Противовирусная, иммуномодулирующая, противоопухолевая активность	Хронические вирусные инфекции в офтальмологии, гинекологии и урологии, дерматологии, онкологии
Интерферон  гамма	γ	Рекомбинантный	Противовирусная, иммуномодулирующая, противоопухолевая активность	Хронические гранулематозные заболевания

Главным из цитокинов являются ИФН-γ и ИЛ-2. ИФН-γ — ключевой медиатор активации системы естественной цитотоксичности, регулиру­ет процесс дифференцировки естественных киллерных клеток и их цитотоксическое взаимодействие с клетками-мишенями, стимулирует цитотоксические и регуляторные функции макрофагов, активирует цитотоксические лимфоциты. Под действием ИФН-γ повышается продукция цитокинов, таких, как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИФН-β, и фактора некроза опухолей-α. ИЛ реализуют эффект через рецепторы на поверхности со­ответствующих клеток-мишеней.

Многие ИЛ проходят стадию клинического изучения, другие — на­шли разнообразное применение в лечении инфекций, воспалительных, аутоиммунных и неопластических расстройств. Так, ИЛ-1 показан для лечения воспалений и септического шока, ИЛ-2 включен в схемы лече­ния имуногенных опухолей (меланомы, почечноклеточного рака, рака мочевого пузыря).