Глава 5. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

5.1. Состав питательной среды
5.2. Приготовление посевного материала
5.3. Культивирование
5.4. Аппаратурное оформление биотехнологического процесса. Биореакторы.
5.5. Повышение эффективности ферментации
5.6. Методы контроля биомассы и количества клеток при культивировании. Апоптоз и некроз клеток
5.7. Выделение продуктов биосинтеза
5.8. Получение готовой продукции

Основу промышленного производства  продуктов биосинтеза составляет единая биотехнологическая система, которая включает основные компоненты, взаимодействующие между собой в определенном режиме посредством соответствующей аппаратуры (рис. 7).

Основные технологические стадии биотехнологического процесса включают:
1. Приготовление к стерилизации питательных сред;
2. Приготовление посевного материала;
3. Культивирование;
4. Обработку культуральной жидкости;
5. Выделение и очистку биопрепарата;
6. Получение готовой продукции

К определяющим факторам биотехнологического процесса относят:
— вид используемого биотехнологического процесса;
— субстрат с его биохимическими и биофизическими характеристиками;
— аппаратурное оформление, включая систему контроля управления;
— технологический режим;
— соответствие требованиям GMP.

Для получения коммерческих препаратов с помощью рекомбинантных микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов двух областей — молекулярных биологов и биотехнологов. Задача молекулярных биологов — идентификация, изучение свойств, модификация Нужных генов, создание эффективных систем их экспрессии в Клетках микроорганизмов, используемых для промышленного синтеза соответствующего продукта. Задача биотехнологов — обеспечить условия оптимального роста рекомбинантного микроорганизма с целью получения целевого продукта с наибольшим выходом.

5.1. Состав питательной среды

Состав питательной среды должен быть оптимальным, так как это определяет размножение, рост микроорганизмов и синтез различных БАВ. Питательные среды могут быть сложными, включающими до 50 компонентов и более, и достаточно простыми, содержащими не более 5 компонентов.

Назначение питательных сред:
— поддержание оптимальных для роста клеток физико-химических условий (pH, еН, рО₂, рСО₂, и т.д.);
— обеспечение клеток питательными веществами для синтеза биомассы и других продуктов жизнедеятельности,

Понятие «среда для культивирования» включает не только определенный качественный и количественный состав компонентов или отдельных элементов, необходимых для конструктивного и энергетического обмена организма (источники азота, углерода, фосфора, ряда микроэлементов, витамины, ростовые вещества), но и физикохимические к физиологические фактора (кислотность, окислительно — восстановительный потенциал, температура, аэрация и др.). Все эти факторы играют существенную роль в развитии микроорганизмов и в проявлении ими отдельных физиологических и биохимических функций. Обычно изменение одного из этих факторов среды ведет к изменению других. Значительного повышения выхода нужного продукта, образуемого микроорганизмами, достигают, используя методы математического расчета соотношения компонентов субстрата и их свойства.

Питательные среды принято делить на две группы:
1. Среды, требующие внесения 5-20%природных сывороток (из крови человека или эмбриональных экстрактов крупного рогатого скота);
2. Синтетические химические среды определённого состава.

Качественная характеристика компонентов питательной среды

Основу питательных сред составляют смеси аминокислот, пуринов, пиримидинов, участвующих в синтезе белков и нуклеиновых кислот.

Сыворотки (эмбриональная сыворотка крови, лошадиная сыворотка или очищенный экстракт куриных эмбрионов), их высокомолекулярные фракции (α-, β-глобулины) предохраняют клетки от повреждения и стимулируют синтез ДНК. Синтез последних индуцируют и ростовые факторы (митогены) — вещества пептидной природы. В качестве источника углерода и энергии используется глюкоза или ее комбинации с аспарагиновой или молочной кислотами. Для развития микроорганизмов необходимы витамины жирорастворимые и водорастворимые. Жизнедеятельность микроорганизмов невозможна без наличия в цитоплазме клеток и окружающей среде неорганических соединений, содержащих такие элементы, как фосфор, калий, кальций, магний, сера, железо, марганец, цинк, медь, молибден и др. Микро- и макроэлементы входят в состав ферментов, участвуют в поддержании необходимого осмотического давления и значения pH, буферной ёмкости (фосфатно- бикарбонатные буферы) или регулируют гидрофильность цитоплазмы клетки.

Фосфор входит в состав важнейших соединений клетки — нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот, полифосфатов, фосфолипидов.

Соединения серы участвую в энергетических процессах клетки, входят в состав многих физиологически активных соединений (белок и простатические группы (-SH) некоторых ферментов и коэнзима А). Без серы  невозможен полноценный синтез белка, нарушаются процессы обмена. Обычно источником серы служат неорганические сульфаты, поэтому для включения серы в состав белков или витаминов сульфат должен быть восстановлен с помощью ферментов (сульфитредуктазы, сульфурилазы, пирофосфатазы). Наиболее важным серосодержащим компонентом клетки является аминокислота цистеин.

Калий в организме выполняет, прежде всего, каталитическую роль, выступая в качестве активатора некоторых ферментов (амилазы, инвертазы), способствуя увеличению гидратации цитоплазмы клетки.

Ионы кальция регулируют активную кислотность (pH среды), выступают в качестве реагента, связывающего остатки фосфорной кислоты.

Основная функция магния — активация ферментов, необходимых для нормального обмена веществ и роста микроорганизмов.

Микроэлементы (железо, медь, цинк, марганец, молибден, кобальт и др.) входят в состав ферментов, участвующих в процессах метаболизма и внутриклеточного обмена. Каталитическая активность микроэлементов возрастает во много раз, когда ионы металлов соединяются с молекулами органических веществ и образуют органоминеральные комплексы (хелаты). Железо входит в состав ферментов-активаторов кислорода — системы цитохромов. Медь в сочетании со специфическими белками образует ряд ферментных систем (полифенолоксидазы, аскарбинооксидазы, нитратредуктазы, альдегидоксидазы и др.) Цинк участвует в построении фосфатаз, эналаз, полипептидаз, регулирующих углеводный, азотистый, фосфатный обмены ряда организмов, в окислительно-восстановительных процессах. Составной частью многих ферментных систем (карбоксилаз, протеиназ, фосфорилаз) является марганец, так фосфорилазы участвуют в переносе фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата. Определенное влияние на различные стороны метаболизма микроорганизмов и особенно антибиотиков оказывает кобальт.

Среда содержит также небольшие концентрации, антибиотиков для поддержания асептических условий.

Перечисленные компоненты достаточно дороги, поэтому при крупномасштабном производстве прежде всего углеводы заменяют более доступными по стоимости продуктами крахмалопаточного производства (мелассой, гидролом, кукурузным экстрактом, соевой мукой, свекловичным жомом).

Незаменимым, элементом питательных сред является вода, которая составляет единую систему с элементами клетки. Вода-растворитель способствует проникновению в клетку необходимых, веществ и выводу из нее продуктов обмена. В клетках вода находится и в виде соединений с углеводами, белками и другими веществами, тесно взаимодействуя с макромолекулами клетки. Гидратирование и дегидратирование органических молекул — важнейший этап в превращении химических компонентов цитоплазмы. Вода участвует в реакциях гидролиза и конденсации, поддерживает объёмную структуру клетки при наличии гидростатического давления.

Для питательных сред используют специально подготовленную воду.

Очистка воды проходит 4 стадий:
1. Удаление механических загрязнений не префильтре (пористое стекло, электрокоагуляция);
2. Очистка от органических загрязнений (активированный уголь);
3. Деионизация и использованием ионообменных смол (катиониты, аниониты);
4. Стерилизация на мембранных фильтрах с размером пор от 0,22 до 0,45 мкм.

Для стерилизации питательных сред используют термическую стерилизацию (пар под давлением) в стерилизующую фильтрацию. Цель стерилизации питательных сред — разрушение бактериальных спор. Многие компоненты питательных сред (витамины, гормоны и другие БАВ) крайне чувствительны к длительному температурному воздействию, поэтому установлены специальные режимы периодической и непрерывной термической стерилизации питательных сред. Стерилизующая фильтрация предполагает использование мембранных фильтрующих элементов.

5.2. Приготовление посевного материала

Штаммы микроорганизмов для производства биологических препаратов поступают в ампулах, где они законсервированы в виде чистых культур. Каждая культура имеет паспорт с описанием питательеных сред, морфологических, физиологических и других характеристик, условий для их поддержания, выращивания и срока хранения. Режим хранения культур предполагает охлаждение, замораживание или обезвоживание; во всех случаях должен быть резко сокращён или полностью прекращён картонный обмен веществ.

Культуры штаммов хранят:
— на косом агаре при температуре минус 1 — 5 °С;
— заморожены при температуре ниже — 20 °С (недопустимо повторное оттаивание и замораживание);
— лиофилизированными в ампулах, хранящимися в течение нескольких лет.

Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранить неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при температуре — 180 °С. Через определенное время, специфическое для каждого вида микроорганизмов и вида хранения, культуру пересеивают. Перед началом технологического процесса культуру размножают в стерильных условиях при оптимальном составе питательной среды и режиме выращивания, длительность стадии выращивания — 24 часа.

5.3. Культивирование

Стадия культивирования микроорганизмов является наиболее сложной и ответственной.

Рост и культивирование биомассы требуют следующих условий:
— жизнеспособности посевного материала;
— наличия источника энергии (тепла);
— достаточного количества соответствующей питательной среды;
— необходимых физико-химических условий для жизнедеятельности.

С начала 1950-х гг. вирус полиомиелита для производства вакцины выращивали в культуре клеток млекопитающих, в том числе фибробластов эмбриона человека. С тех пор фибринобласты эмбриона стали незаменимы для выделения и выращивания ряда других вирусов, при производстве высокоспецифичных белков (антител, интерферонов), в исследованиях рака и противовирусной химиотерапии.

Культуры, приготовленные непосредственно из тканей организма (эмбриональных иди тканей новорожденных), называют первичными культурами. В большинстве случаев клетки первичной культуры переносят из культуральной чашки и используют для получения большого количества вторичных культур, которые можно последовательно перевивать в течение недель или месяцев. Разные типы клеток нуждаются в различных питательных веществах, а также в одном или нескольких белковых факторах роста. Клеточные линии можно использовать для получения клонов, которые происходят из одной клетки-предшественника.

Биотехнология использует методы поверхностного и глубинного культивирования микроорганизмов.

При поверхностном культивировании (в монослое) суспензию клеток получают обработкой измельчённой ткани эмбриона трипсином. Клетки в такой суспензии, оседая на плотной поверхности сосуда с культуральной средой, становятся плоскими и делятся, образуя монослой на поверхности сосуда. Обычно при этом способе культивирования пользуются цилиндрическими бутылями, которые медленно вращаются вдоль своей длинной оси. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель — микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются и пролиферируют. Суспензионные культуры можно получать в сосудах объёмом до 1000 л при перемешивании.

Преобладающим является глубинный метод культивирования, предполагающий возможность использования всего объема питательной среды.

На рост и развитие микроорганизмов влияют внутриклеточные и внеклеточные факторы. К внутриклеточным факторам относятся: структура клетки, механизмы метаболизма и генетические характеристики. Внеклеточные (внешние) факторы, т. е. условия внешней среды клетки, являются основными регуляторными факторами биотехнологии.

Промышленное культивирование и очистка целевого продукта — процессы многоступенчатые. Общая схема ферментации представлена на рис. 8.

Процесс начинается с приготовления и стерилизации культуральной среды и оборудования. Вначале выращивают исходную культуру (5 — 10 мл), затем инкубируют ее во встряхиваемой колбе (200 -1000 мл), далее переносят в ферментер для посевного материала (10 -100 л) и далее в промышленный ферментер (1000 -100000 л). По завершении ферментации выделяемый продукт находится в клетках или в культуральной среде, но не в обеих фракциях одновременно, поэтому дальнейшие манипуляции проводят с одной из этих фракций.

Микроорганизмы можно выращивать:
— в ферментере периодического действия;
— в ферментере периодического действия с добавлением субстрата;
— в непрерывной культуре.

В первом случае микроорганизмы выращивают в стерильных условиях без добавления в ходе ферментации свежей культуральной среды. При периодической ферментации состав культуральной среды, концентрация микроорганизмов (биомассы), количество белкового продукта или метаболита зависят от фазы роста, клеточного метаболизма и наличия питательных веществ.

Различают шесть основных фаз роста (рис. 9)

— лаг-фаза (1);
— фаза ускорения (2);
— экспоненциальная или логарифмическая фаза (3);
— фаза замедления (4)
— стационарная фаза (5);
— фаза отмирания (6).

Как правило, после инокуляции стерильной культуральной среды мгновенного увеличения числа клеток не наблюдается. В течение определенного периода времени, называемого лаг-фазой, клетки адаптируются к новым условиям (другим pH или концентрации питательных веществ). Продолжительность лаг-фазы зависит от времени, в течение которого клетки посевного материала находились в стационарной фазе, и от того, насколько различалась среда, в которой росла культура, от новой, свежей культуральной среды. Если посевным материалом служит культура, находящаяся в экспоненциальной фазе, выраженная лаг-фаза, может отсутствовать и рост клеток начнется немедленно после инокуляции. Между лаг- и экспоненциальной фазами есть короткий период — фаза ускорения, когда скорость роста клеток увеличивается до достижения постоянной величины. В период экспоненциальной фазы клетки претерпевают несколько делений. Когда субстрат присутствует в избытке, достигается максимальная скорость роста культуры в экспоненциальной фазе, из-за большого числа клеток в конце экспоненциальной фазы субстрат расходуется очень быстро, наступает фаза замедления, которая может быть кратковременной. В результате истощения лимитирующего субстрата или накопления продуктов метаболизма, замедляющих рост, увеличение числа клеток постепенно прекращается и культура переходит в стационарную фазу. В это время биомасса остается постоянной, метаболизм претерпевает кардинальные изменения, синтезируются соединения (вторичные метаболиты), представляющие коммерческий интерес, например антибиотики. Продолжительность стационарной фазы зависит от конкретного микроорганизма и условий роста. В фазе отмирания метаболизм прекращается, так как энергетические запасы клеток оказываются исчерпанными. При промышленном синтезе, еще до наступления фазы отмирания, ферментацию останавливают.

Периодическая культура с добавлением субстрата предполагает периодическое внесение в ферментер увеличивающегося количества питательных веществ. При этом культуральную среду не удаляют до окончания процесса. Периодическое добавление субстратов приводит к удлинению экспоненциальной и стационарной фаз, к увеличению биомассы и количества метаболитов, синтезируемых во время стационарной фазы. Для обеспечения непрерывного синтеза рекомбинантного белка и его стабильности необходим тщательный контроль процесса и добавление субстрата (источника углерода, азота, витаминов, микроэлементов и др. БАВ) тотчас, как в этом возникает необходимость.

В зависимости от генотипа микроорганизма и природы рекомбинантного белка периодическая ферментация с добавлением субстрата может повысить выход готового продукта на 25-1000% по сравнению с простой периодической ферментацией.

Периодическая ферментация с добавлением субстрата используется также для культивирования клеток млекопитающих и насекомых; эти культуры широко применяют для получения белковых продуктов, имеющих медицинское значение, кроме того без периодического добавления субстрата, клетки млекопитающих неэффективно синтезируют чужеродные белки. Для периодической ферментации характерны небольшие различия во времени сбора клеток, который проводят, начиная с середины экспоненциальной фазы, и заканчивают ее поздним этапом.

Однако в стационарной фазе микроорганизмы часто синтезируют протеолитические ферменты — протеиназы, разрушающие производимые белки; если цель ферментации — получение белковых продуктов, нужно остановить процесс до перехода его в стационарную фазу. Определяя время добавления следующей порции субстрата, используют показатели, коррелирующие с его расходом: количество синтезированных органических кислот, значение pH или количество образовавшегося СО₂. Конечный продукт собирают по завершении процесса.

При непрерывной ферментации свежая культуральная среда поступает в ферментер непрерывно, параллельно отводится такой же объем клеточной суспензии. Таким образом, убыль числа клеток (удаление продукта) уравновешивается их увеличением в результате деления. При этом жестко контролируют скорость притока культуральной среды и постоянный объем культуры в биореакторе.

Следует заметить, что в промышленных целях непрерывная ферментация применяется реже, хотя стоимость получения определенного количества биомассы в ферментере непрерывного действия существенно ниже, чем в биореакторе, работающем в периодическом режиме. Это удешевление обусловлено следующим:

— при непрерывной ферментации нужны не столь громоздкие биореакторы и оборудование для сбора клеток, их разрушения, последующей очистки белкового продукта или метаболита, синтезированного микроорганизмами;

— биореактор периодического действия время от времени разгружают, готовя к повторному использованию (ремонт, чистка, стерилизация биореактора — основная причина снижения эффективности процесса); для ферментера, работающего в непрерывном режиме, простой существенно меньше;
— при непрерывной ферментации синтез целевого продукта происходит более согласованно, так как физиологический статус большинства клеток одинаков.

Непрерывную ферментацию используют для промышленного получения белков одноклеточных микроорганизмов и антибиотиков, однако и этот способ выращивания микроорганизмов связан с определенными затруднениями:

1. Продолжительность ферментации в непрерывном режиме составляет иногда 500-1000 ч, в течение которого некоторые клетки могут потерять рекомбинантные плазмиды (известно, что клетки, не несущие плазмид, расходуют меньше энергии, делятся быстрее, поэтому со временем выход целевого продукта может снижаться из-за уменьшения числа клеток, способных его синтезировать);

2. В промышленных установках затруднительно в течение длительного времени поддерживать стерильные условия; непрерывные процессы требуют наличия стерильного резервного оборудования, что значительно увеличивает основные затраты.

Культуры с высокой плотностью. При максимальной конечной плотности культуры получается и максимальное количество целевого продукта. В ферментерах периодического действия с добавлением субстрата концентрация рекомбинантных клеток E.coli достигает 50 г сухого вещества на 1 л питательной среды (в некоторых случаях более 100 г/л). Один из способов повышения плотности культуры — оптимизация культуральной среды.

Следует иметь в виду, что некоторые питательные вещества (в том числе источники углерода, азота) при высоких концентрациях замедляют рост клеток. Так, глюкоза подавляет рост при концентрации более 50 г/л, аммиак — при концентрации свыше 3 г/л; железо, магний, фосфор, цинк соответственно — более 1,15 г/л, 8,7 г/л, 10 г/л, 0,038 г/л.

Таким образом, простое увеличение содержания питательных веществ в культуральной среде при периодической ферментации не дает желаемого результата.

Для избежания недостатка кислорода в культурах с высокой плотностью повышают количество поступающего диспергированного воздуха и скорость перемешивания. Возможна подача в культуру чистого кислорода, а не воздуха (содержащего только 20% кислорода) или выращивание клеток под определенным давлением для увеличения растворимости кислорода.

Высокой плотности роста культуры удается достичь в периодическом режиме с добавлением субстрата. Режим подачи питательных веществ может быть: непрерывным, ступенчатым, экспоненциальным. При непрерывном режиме в культуральную среду в течение всей ферментации вносят одинаковые количества питательных веществ. При ступенчатом режиме питательные вещества добавляют во все большем количестве по мере увеличения концентрации клеток. При экспоненциальном режиме питательные вещества добавляют в количестве, обеспечивающем постоянную скорость роста клеток.

Периодическую подачу питательных веществ автоматизируют, основываясь на результатах измерения концентрации лимитирующего субстрата культуральной среды (например глюкозы) в процессе ферментации.

При крупномасштабной ферментации следует учитывать еще один аспект. Важно не допустить случайного попадания рекомбинантных микроорганизмов в окружающую среду; для этого используют надежные системы, предотвращающие утечку живых рекомбинантных организмов или ограничивающие их распространение при произошедшей утечке.

Перед окончательным удалением из установки, все рекомбинантные микроорганизмы должны быть инактивированы в соответствий с определенными инструкциями. Использованную культуральную среду тщательно проверяют на наличие в ней жизнеспособных микроорганизмов, чтобы исключить их попадания в окружающую среду.

5.4. Аппаратурное оформление биотехнологического процесса. Биореакторы.

Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических,, биофизических, биохимических, физико-химических процессов и предполагает использование большого количества разнотипного оборудования, которое связано между собой материальными, энергетическими потоками, образующими технологические линии.

Основным аппаратурным элементом биотехнологического процесса является биореактор — ферментер (рис. 10).

Биореакторы предназначены для культивирования микроорганизмов, накопления биомассы, синтеза целевого продукта. Биореакторы изготавливают из высоколигированных марок стали, иногда из титана. Внутренняя поверхность биореактора должна быть отполирована.

Типовые ферментеры представляют собой вертикальные ёмкости различной вместимости (малые — от 1 до 10 л, многотоннажные — более 1000 л) с минимальным числом штуцеров и передающих устройств. В биореакторах должны быть обеспечены оптимальные гидродинамические и массообменные условия.

Ферментеры снабжены паровой рубашкой, мешалками, барботерами, стерилизующими воздушными фильтрами, отбойниками, обеспечивающими необходимые температурный, газовый режим, гидродинамическую обстановку в биореакторе (т.е. процессы массо- и теплообмена). В биореакторах имеются пробоотборники для отбора проб культуральной жидкости в процессе биосинтеза. Могут быть и другие конструктивные особенности, учитывающие специфику биотехнологического процесса. Работа отдельных узлов контролируется измерительными приборами, фиксирующими как параметры технологического процесса, так и отдельные физико-химические показатели культивирования (температуру стерилизации и культивирования, скорость вращения мешалки, давление, расход воздуха или газов на аэрацию, пенообразование, pH, еН, рО2, рСО2 среды).

Тип биореактора, чистота обработки внутренних стенок аппарата и отдельных его узлов, ёмкость, коэффициент заполнения, поверхность теплоотдачи, способ отвода тепла, тип перемешивающих, аэрирующих устройств, арматура и запорные приспособления, способ пеногашения — это далеко не полный перечень отдельных элементов, которые, в отдельности и во взаимосвязи, влияют на процесс культивирования микроорганизмов и клеток.

Биореакторы подразделяют на три основные группы (рис. 11).
1. реакторы с механическим перемешиванием;
2. барботажные колонны, через которые для перемешивания содержимого пропускают воздух;
3. эрлифтные реакторы с внутренней или внешней циркуляцией; перемешивание и циркуляция культуральной среды в них обеспечивается потоком воздуха, за счет которого между верхним и нижним слоями культуральной среды возникает градиент плотности.

Биореакторы первого типа используют чаще всего, так как они позволяют легко изменять технологические условия и эффективно доставлять к растущим клеткам воздух, определяющий характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность. В таких реакторах воздух подают в культуральную среду под давлением через разбрызгиватель — кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом образуются мелкие пузырьки воздуха и за счет механического перемешивания обеспечивается их равномерное распределение. Для этой же цели используют мешалки — одну или несколько. Мешалки, разбивая крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору и увеличивают время пребывания в культуральной среде. Эффективность распределения воздуха зависит от типа мешалки, числа оборотов, физико-химических свойств среды.

При интенсивном перемешивании культуральной среды происходит ее вспенивание, поэтому рабочий объем биореактора не превышает 70% общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена, и таким образом предотвращается потеря культуральной жидкости. В пенящейся жидкости условия аэрации лучше, чем в плотных растворах (при условии непрерывного перемешивания и циркуляции слоя пены, т.е. при исключении нахождения микроорганизмов вне культуральной жидкости). Вместе с тем вспенивание может привести к переувлажнению фильтров в отверстиях, через которые воздух выходит из биореактора, уменьшению потока воздуха и к попаданию в ферментер посторонних микроорганизмов.

Конструктивные особенности барботажных колонн и эрлифтных биореакторов дают этим типам ферментеров некоторые преимущества перед реакторами с механическим перемешиванием. Барботажные колонны более экономичны, так как перемешивание в них происходит восходящими потоками воздуха равномерно по всему объему. Отсутствие механической мешалки исключает один из путей проникновения в биореактор посторонних микроорганизмов. В барботажных биореакторах не возникает сильных гидродинамических возмущений (сдвигов слоев жидкости культуральной среды относительно друг друга).

Уменьшение сдвиговых факторов важно по следующим причинам:
— клетки рекомбинантных микроорганизмов менее прочны, чем нетрансформированные;
— клетка отвечает на внешние воздействие уменьшением количества синтезируемых белков, в том числе рекомбинантных;
— под влиянием сдвиговых эффектов могут изменяться физические и химические свойства клеток, что затрудняет дальнейшую работу с ними (ухудшаются условия выделения, очистка рекомбинантных белков).

В барботажных колоннах воздух подают под высоким давлением в нижнюю часть биореактора; по мере подъема мелкие пузырьки воздуха объединяются, что влечет неравномерное его распределение. Кроме того, подача воздуха под высоким давлением приводит к еильному пенообразованию.

В эрлифтных биореакторах воздух подают в нижнюю часть вертикального канала. Поднимаясь, воздух увлекает за собой жидкость к верхней части канала, где расположен газожидкостный сепаратор (здесь частично выходит воздух). Более плотная деаэрированная жидкость опускается по другому вертикальному каналу ко дну реактора и процесс повторяется. Таким образом, в эрлифтном биореакторе культуральная среда вместе с клетками непрерывно циркулирует в биореакторе.

Эрлифтные биореакторы выпускаются в двух конструктивных вариантах. В первом — реактор представляет емкость с центральной трубой, которая обеспечивает циркуляцию жидкости (реакторы с внутренней циркуляцией). У эрлифтного биореактора второго типа культуральная среда проходит через отдельные независимые каналы (реактор с внешней системой циркуляции).

Эрлифтные биореакторы более эффективны, чем барботажные колонны, особенно в суспензиях микроорганизмов с большей плотностью или вязкостью. Перемешивание в эрлифтных ферментерах более интенсивно и вероятность слипания пузырьков минимальна.

Для стерилизации биореактора применяют пар под давлением. Внутри биореактора не должно быть «мертвых зон», недоступных для пара во время стерилизации. Стерилизации подлежат все клапаны, датчики, входные и выходные отверстия. Стерильность обеспечивается и герметизацией биотехнологического оборудования, работающего в асептических условиях. Стерильная передача жидкости осуществляется через штуцеры парового затвора. Технологическая обвязка биореактора исключает контаминацию культуральной жидкости посторонней микрофлорой и возможности попадания продуктов биосинтеза в окружающую среду. Основные агенты, контаминирующие клеточные культуры — бактерии, дрожжи, грибы, простейшие, микоплазмы, вирусы. Источники контаминации — воздух, пыль, питательные среды, рабочие растворы, оборудование, рабочий персонал.

Очистка воздуха от микроорганизмов и аэрозольных частиц осуществляется через фильтры предварительной очистки (комбинированные глубинные фильтры — бумага, картон, тканевые материалы), которые устанавливают на всасывающей линии перед компрессором (воздух очищается от частиц размером более 5 мкм) и фильтры тонкой очистки (ткань ФП, удаляющая частицы размером до 0,3 мкм, металлокерамические и мембранные фильтры).

Металлокерамические фильтры изготовлены из калиброванных металлических порошков (бронзы, никеля, нержавеющей стали, титана) способами спекания, прессования, прокатки; размер пор варьирует от 31 до 100 мкм. Металлокерамические фильтры стерилизуют при температуре 150 °С 50 мин. Они стейки к действию сильных кислот, щелочей, окислителей, спиртов, использоваться при температуре от -250 °С до +200 °С.

Преимущество металлокерамических фильтрующих элементов — простота регенерации, большой срок работы (5-10 лет). В отличие от волокнистых, нетканных и фторопластовых фильтров, зернистые металлокерамические материалы имеют неизменную структуру, химически инертны, поддаются любым методам стерилизации, отличаются высокой механической прочностью, просты в изготовлении.

Мембранные фильтры патронного и кассетного типа несмотря на менее значительный срок службы (1 год) обладают высокой эффективностью, быстрой съёмностью, надёжны в работе. Отмечена способность рядом фильтрующих материалов, заряженных отрицательно, задерживать живые клетки, бактерии, вирусы, эритроциты, лимфоциты и тромбоциты. Частицы, размер которых меньше величины пор фильтрующего материала, остаются на фильтре, если дзета-потенциал (электрический потенциал) частиц и стенок пор фильтра имеет противоположные заряды. Это явление наблюдается при использовании в качестве фильтрующих элементов мембран в соответствующими электростатическими свойствами. Выбор фильтрующего материала зависит от объекта фильтрации и дзета-потенциала суспендированных частиц.

Отработанный воздух, отводимый из лабораторных и производственных помещений, контролируется на чистоту (отсутствие микроорганизмов).

Для обслуживания установок глубинного культивирования применяют автоматизированную модульную систему, включающую:
— очистку и стерилизацию воздуха и пара с использованием металлокерамических и титановых фильтрующих элементов; модули технологической обвязки, содержащие автономную систему термостатирования, запорную и регулирующую, арматуру, индивидуальные входные и выходные фильтры, электропневмообразователи и другие регулирующие устройства;
— блок автоматического контроля и управления, содержащий программное устройство, преобразователи сигналов от измерительных электродов, газоанализаторы для измерения О₂, СО₂, еН, температуры, рСО2, pО₂.
— системы цифровой и диаграммной индикации текущих параметров культивирования.

Установки глубинного культивирования снабжены блоками дистанционного измерения давления в биореакторе и его рубашке, блоками дистанционного контроля интенсивности аэрации воздухом или газовой смесью (кислорода и азота, кислорода и углекислого газа, воздуха и углекислого газа, азота и углекислого газа).

Блок автоматического управления позволяет контролировать и поддерживать на заданном уровне программную стерилизацию биореактора и арматуры, скорость вращения мешалки и дистанционный контроль открытия или закрытия вентилей и регулирующих клапанов.

Ряд стран специализируется на выпуске широкого ассортимента оборудования для культивирования различного назначения (фирма NBS — США; Полиферм, Биотек — Швеция; Марубиши — Япония; LH — Ферментейшн — Великобритания; Браун — Германия; БИОР-0,1, БИОР-0,2 — Россия, институт биологического приборостроения с опытным заводом АН РФ).

5.5. Повышение эффективности ферментации

Независимо от типа биореактора процесс ферментации строго контролируют по:
— концентрации растворенного кислорода;
— pH;
— температуре;
— интенсивности перемешивания биомассы.

Существенные изменения любого из этих параметров резко снижают скорость роста клеток и стабильность белкового продукта. Для оптимального роста Е. coli и других микроорганизмов, используемые при экспрессии рекомбинантных белков, нужна хорошо аэрируемая культуральная среда. Кислород плохо растворим в воде (0,0084 г/л при 25 °С), поэтому он должен подаваться в среду непрерывно. В процессе ферментации специальный датчик контролирует содержание растворенного кислорода в среде, равномерность его распределения по всему объему, тщательность перемешивания культуры, что, вместе взятое, обеспечивает эффективность диспергирования пузырьков. Пространство, где взаимодействуют микроорганизмы и питательная среда, принято называть микросредой. Если микросреда данной культуры одинакова в каждой точке, такую культуру считают гомогенной. Гомогенность достигается эффективным перемешиванием всех компонентов среды и микроорганизмов по всему рабочему объему. Гомогенность невозможна без аэрации, которая осуществляется барботерами различных конструкций, например, в виде кольцевого желоба с отверстиями, перфорированной трубы или форсунки.

Оптимальный рост большинства микроорганизмов идет при pH от 5,5 до 8,5; однако клеточные метаболиты, выделяющиеся в культуральную среду, могут изменять рН. Изменение рН среды заметно сказывается на активности ферментов микроорганизмов, состоянии промежуточных продуктов, их диссоциации, растворимости и т.п., что значительно влияет на выход конечного продукта. Тщательно контролируя pH, при необходимости в ферментер добавляют кислоту или основание, хорошо перемешанные с питательной средой и равномерно распределенные по всему объему.

Успех ферментации зависит от температуры. Если она ниже оптимальной (37 °С), рост микроорганизмов замедлен, интенсивность их метаболизма снижена. При повышении температуры до 38 °С, возможна преждевременная индукция, синтеза белка или индукция белков теплового шока, что активирует клеточные протеиназы и снижает выход белкового продукта. Для отвода тепла используют охлаждающую рубашку. Тщательное перемешивание культуральной среды — один из наиболее распространенных процессов в биотехнологии. Перемешивание необходимо для:

— равномерной доставки питательных веществ к клеткам;
— предотвращения накопления токсических побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом участке биореактора.

Механическое перемешивание и аэрация снабжают растущую культуру кислородом, азотом, отводят продукты газообмена и физиологическое тепло, выделяемое микроорганизмами в процессе биосинтеза, способствуют гомогенизации суспензии, увеличивают скорость процессов масса- и теплообмена.

Конструкция мешалки играет важную роль в работе биореактора. Мешалки делят на быстро- и тихоходные. Быстроходные аппараты с большой и Средней циркуляционной производительностью используют в препаратах ш отражательными перегородками; (отбойниками). Отсутствие перегородок приводит к завихрению жидкости, снижению скорости у стенки аппарата и образованию воронки.

Мешалки быстроходные — турбинные, пропеллерные, лопастные, дисковые. Тихоходные — якорные, рамные, ленточные, вибрационные, скребковые; последние для перемешивания средне- и высоковязких сред. Для глубинного культивирования чаще всего используют турбинную мешалку с прямыми лопастями, расположенными радиально.

Перемешивание культуральной среды влияет на другие параметры:
— скорость переноса кислорода из пузырьков газа в жидкую среду, из среды — в клетки;
— эффективность теплопередачи;
— точность измерения концентрации метаболитов культуральной жидкости;
— эффективность диспергирования добавляемых реагентов (кислот, оснований, питательных сред и т.д.).

Следует соблюдать баланс между необходимостью тщательного перемешивания среды и целостностью клеток, так как при чрезмерном перемешивании в среде могут возникнуть гидромеханические эффекты, губительные для бактериальных клеток.

Непрерывный мониторинг всех параметров, дает возможность изменять условия в ходе ферментации. Как правило, оптимальные условия изменяются при каждом десятикратном увеличении объема биореактора.

5.6. Методы контроля биомассы и количества клеток при культивировании. Апоптоз и некроз клеток

Под определением биомасса подразумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твёрдой или жидкой питательной среде при культивировании. Наиболее чувствительный метод контроля биомассы — подсчёт клеток е определением линейных размеров или числа жизнеспособных клеток (метод окрашивания) при помощи микроскопа. Количество клеток в биомассе можно контролировать и по объёму осаждения в центрифужных стаканчиках. Также используют косвенные методы определения биомассы по интенсивности дыхания (изменению концентрации СО2 инфракрасным газоанализатором) или содержанию белка (самый чувствительный метод — бромсульфалеиновая проба, основанная на связывании бромсульфалеина основными группами белка). Количество микроорганизмов и клеток можно определять физико-химическими методами: кондуктометрически (по удельной электропроводимости), спектрофотометрически, колориметрически, нефелометрически.

Гибель клеток ведёт к выделению клеточных фрагментов, загрязняющих фильтры и пробы, высвобождению внутриклеточных ферментов.

Гибель клеток идёт по двум механизмам: апоптоз и некроз.

Погибать могут, казалось бы, вполне жизнеспособные клетки, т.е. те, которые еще не успели исчерпать свои, жизненные ресурсы. Зачастую активную роль в своей гибели играет сама клетка — с помощью содержащихся в ней механизмов, которые лишь запускаются теми или иными факторами внеклеточной или внутриклеточной среды; в результате возникло представление об апоптозе или программированной клеточной гибели. Апоптоз определяют, как программируемую клеточную смерть, понимая под этим такую гибель клетки, в развитии которой активную роль играют специальные и генетически запрограммированные внутриклеточные механизмы.

Исходный смысл слова «апоптоз» весьма поэтичен, по-гречески он означает «опадание листьев».

Круг обстоятельств, когда в клетке включается программа апоптоза, весьма широк, их можно представить двумя группами:
— «неудовлетворительное» состояние самой клетки, что вызывает апоптоз изнутри;
— «негативная» сигнализация снаружи, передающаяся через спе­циальные рецепторы клетки («апоптоз по команде»).

О «неудовлетворительном» состоянии самой клетки может свиде­тельствовать серьезное повреждение хромосом и внутриклеточных мембран. В этом смысле апоптоз выполняет функцию уничтожения де­фектных клеток. Важнейший инструмент апоптоза — цитоплазматиче­ские протеазы, ядерные эндонуклеазы, последние разрушают ДНК не до нуклеотидов, а лишь до более или менее крупных фрагментов. К про­чим «орудиям» апоптоза относится совокупность сильных окислителей и избыточное накопление не только оксида азота, но и друих реакци­онноактивных веществ — супероксидного и гидроксидного радикалов, пероксинитрита, нитритов, нитратов и т.д. Известно, что в нормальной клетке существуют механизмы защиты от радикалов и окислителей. Это ферменты антиоксидантной системы: супероксиддисмутаза (превраща­ет супероксид в перекись водорода), каталаза и пероксидаза, элимини­рующие из среды пероксид водорода. Повреждения клеток могут быть вызваны изменением температуры, нарушением питания. Если же повреждения клетки чрезмерны, процесс ее гибели становится неуправляемым — это уже некроз.

Таким образом, в зависимости от интенсивности и характера повреждающих воздействий гибель клетки может пойти либо по апоптическому, либо по некротическому пути.

5.7. Выделение продуктов биосинтеза

Общая схема этой стадии технологического процесса представлена на рис. 12. Если продукты локализованы внутри клеток, их разрушают клеточные осколки и выделяют продукты из осветленной среды; секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды.

Для отделения биомассы клеток или культуральной жидкости используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр-прессы, вакуум-барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба культивирования, типа кле­ток, свойств культуральной жидкости.

Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды (в промышленных масштабах) используют высокоскоростное центрифугирование с помощью соответствующих центрифуг полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан центрифуги, клетки концентрируются в нем, осветленная жидкость удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавлива­ют и клетки собирают. Неудобство этого способа — необходимость остановки процесса, вероятность утечки микроорганизмов в окружающую среду, невозможность полного удаления клеток из среды.

Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды — фильтрация через мембрану. Но процесс фильтрации быстро замедляет­ся за счет накопления клеток на поверхности фильтра. Увеличение дав­ления фильтруемой среды дает временный эффект, так как клетки заби­вают поры, образуя менее проницаемый слой.

Разрушение (дезинтеграция) клеток. Для этой цели применяют разнообразные химические, биологические, физические методы. Все процедуры должны быть одновременно достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку и достаточно мягкими для исключения денатурации белка (изменения структуры конечного продукта).

Клеточные стенки микроорганизмов состоят из разных полимеров, поэтому универсального метода их разрушения не существует,

У грамположительных микроорганизмов клеточная стенка состоит из толстого пептидогликанового слоя N-ацетилглюкозамина и остатков N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных пептидными мостиками.

У грамотрицательных бактерий клеточная стенка тоньше и покры­та снаружи слоем липидов.

Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированных маннатов и β-глюканов.

Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состоящие из α- и, β -глюканов, гликопротеидов и хитина.

Состав и прочность клеточной стенки зависят от условий культиви­рования, скорости роста клеток, фазы, на которой они собираются, ус­ловий хранения сконцентрированных клеток и от того, экспрессировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген.

Химический метод разрушения клеточных стенок — обработка ще­лочью. Если белковый продукт не разрушается при pH от 10,5 до 12,5, то можно без труда визировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гормон роста человека очень про­сто выделить из клеток Е. coli обработкой натрия гидрокарбонатом при pH 11. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов.

Основной биохимический меток разрушения клеток микроорганиз­мов — лизис с помощью ферментов. Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для раз­рушения клеток грамотрицательных бактерий используют лизоцим и ЭДТА. Клеточные стенки дрожжей и плесневых грибов гидролизуют одним или несколькими ферментами: фосфоманназой, β -1,3- и β -1,6- глюканазой, хитиназой — или комплексным дрожжелитическим препаратом. Ферментативная обработка высокоспецифична, а лизис происхо­дит в мягких условиях.

Клетки можно разрушать физическими методами: немеханическими (осмотическим шоком или быстрым многократным замораживани­ем-оттаиванием), механическими (обработкой УЗ, соударением, гомо­генизацией под давлением). Механическое разрушение высокоэффек­тивно, особенно УЗ-излучателями, генерирующими высокочастотные звуковые волны. УЗ-дезинтеграторы состоят из транзисторного генера­тора УЗ-волн, пьезоэлектрического или магнитострикционного преоб­разователя, набора рабочих камер (аппарат на основе УЗ-диспергатора УЗДН-1, Россия).

При большом количестве клеток используют баллистическую дезинтеграцию, ее проводят в высокоскоростных шаровых мельницах, куда помещают концентрированную суспензию клеток. Камера мель­ницы заполнена инертным абразивным материалом (стеклянными, полимерными шариками диаметром 1 мм). Содержимое быстро перемешивают лопасти, насаженные на ось. Большинство клеток разрушаются под действием сдвиговых напряжений, возникающих в результате быстрого движения шариков относительно друг друга, поверхности лопа­стей и камеры. Условия оптимального разрушения клеток подбирают, варьируя числом и формой лопастей, скоростью перемешивания, чис­лом и размером шариков, геометрией камеры, температурой, концен­трацией клеток (аппараты фирмы «Willi А. Bachhotem — Швейцария, «Gifford Wood Со» — США).

Соударение — клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность, в месте соприкосновения выделяется большое количество энергии, разрушающей клетки. Актив­ность клеточных белков при разрушении клеток методом соударения уменьшается незначительно.

Экструзионные методы (продавливание суспензии клеток через капиллярные отверстия) предназначены для обработки жидких или замороженных суспензий клеток. Диаметр отверстий рабочих матриц со­ставляет от нескольких миллиметров до десятых его долей. В гидроэкс­трудерах давление достигает 2000-4000 кг/см², в            твердофазовых          экс­трудерах — 10000-50000 кг/см² . После экструзии давление резко сбра­сывают, что вызывает лизис клеток. Экструзионные дезинтеграторы производят фирмы «Manton Gaulin» (США), LKB (Швеция).

Дальнейшая обработка. После разрушения клеток их осколки удаляют низкоскоростным центрифугированием или микрофильтрацией через мембрану.

Белковый продукт выделяют из лизата методом высаливания — оса­ждением высококонцентрированными растворами, нейтральных солей, чаще всего натрия- или аммония сульфатом. Седиментация белка может быть достигнута органическими растворителям и (этанолом, ацетоном).

 5.8. Получение готовой продукции

Получение готовой продукции связано с сушкой и консервировани­ем биопрепаратов. Объект сушки — живые микроорганизмы, клетки, ферменты, гормоны и др. БАВ. Биопрепараты кроме биологически ак­тивной составляющей содержат органические соединения и значитель­ное количество воды. Вода в продуктах биосинтеза может быть в сво­бодном или связанном состояниях. Значительная часть воды удержива­ется в субстрате физико-механическими и адсорбционными связями (вандерваальсовы силы). Физико-механически связанная вода находит­ся в порах и капиллярах материала.

Для высушивания биопрепаратов применяют методы, не приводя­щие к потере биологической активности, где доминирует сублимацион­ная сушка (установки типа «Иней» — Россия, «Юзефруа» — Франция, «Heto — Helton» — Дания). Использование распылительных сушилок ограничено по причине сравнительно жестких условий сушки.

Термолабильные и неустойчивые по ряду показателей биопрепара­ты при высушивание в суспензиях (не содержащих защитных сред) подвержены существенным структурным и морфологическим измене­ниям. Это может сопровождаться утратой жизнеспособности и разру­шением клеточных структур.

Среды высушивания (защитные среды) — криопротекторы.

Дена­турирующее влияние замораживания сдерживается инактивацией (изменением свойств) защитных агентов:
— высокомолекулярных компонентов (ПВП м.м. от 2600 до 6400 — декстрин, желатин, пептон);
— низкомолекулярных и буферных компонентов (глютамат, трисбуфер).

Защитная среда предохраняет биопрепараты от необратимых изме­нений в процессе замораживания, высушивания и при последующем хранении. Защитные среды, как правило, состоят из нескольких компо­нентов. Так, для консервирования клеточных культур используют криозащитные свойства глицерина и ДМСО, их добавляют к питательной среде в концентрации 5-10%. При температуре минус 180 — 196 °С жизнеспособность законсервированной культуры может сохраняться неог­раниченно долго.

Розлив, укупорку, этикетировку, упаковку готовой продукции проводят в отдельных аппаратах (при малотоннажном производстве); это компактные установки для ампул, ёмкостей для инфузий; машины для укладки, упаковки.

Технологические линии (крупномасштабное промышленное производство) включают:
— УЗ — моечные машины;
— стерилизационные сушильные туннели (с ламинарными пото­ками горячего воздуха);
— машины для наполнения и запайки ампул;
— машины наполнения и запайки ёмкостей для растворов внутри­венного введения (электронно-турбинный розлив в соответст­вии GMP);
— машины для наполнения и запайки порошкообразных препара­тов;
— машины для наполнения и укупорки флаконов с навинчиваю­щимся колпачком и специальной насадкой;
— наполнительные и укупорочные машины для инъекций;
— машины для нанесения кода (маркировка цветным кольцом);
— машины для контроля на герметичность;
— этикетировочные машины;
— машины для капсулирования порошков;
— машины для сборки, наполнения и запайки шприц-тюбиков.

Отдельные установки и технологические линии выпускают фирмы Америки, Швейцарии, Франции, Германии, Финляндии; установки этих фирм отвечают требованиям GMP.