Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой (ФС.3.3.1.0020.15)
Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)
ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
ФС.3.3.1.0020.15 Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой
Взамен ГФ Х, ст.719, ФС 42-426 ВС-94
Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину холерную бивалентную химическую, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, которая представляет собой смесь холерогена-анатоксина и О-антигена, полученных из инактивированных штаммов классического биовара 569 В V. cholerae О1, серовара Инаба и
М-41 серовара Огава.
Вакцина предназначена для профилактики холеры и вызывает развитие специфического иммунитета длительностью до 6 мес.
ПРОИЗВОДСТВО
Для производства вакцины используют штаммы V. cholerae О1 гиперпродуценты холерного экзотоксина (холерогена), несущие гены, ответственные за синтез холерного токсина (ctх A, B) и О-антигена. Производственные штаммы V. cholerae О1 должны, иметь типичные культурально-морфологические, биохимические и антигенные свойства; обладать холерогенными, токсигенными и иммуногенными свойствами.
Технология производства вакцины холерной бивалентной химической предусматривает культивирование штаммов-продуцентов в жидких питательных средах (3 пассажа); инактивирование культур формалином; последующее выделение из полученной биомассы V. cholerae О1 сероваров Инаба и Огава специфических фракций холерогена-анатоксина и О-антигенов; их очистка, концентрирование аммонием сернокислым; сублимационное высушивание; смешивание с разрешенными для использования в иммунобиологической промышленности наполнителями (сахароза, крахмал, тальк, кальция стеарат); таблетирование и покрытие таблеток кислотоустойчивой оболочкой из целлацефата (ацетилфталилцеллюлоза). В процессе производства вакцины проводят контроль чистоты и концентрации бактериальной культуры, контроль стерильности инактивированной культуры, контроль диализа специфических фракций, контроль на отсутствие сульфат — ионов и ионов аммония.
ИСПЫТАНИЯ
Описание. Таблетка – серовато-желтая компактная масса, покрытая светлой блестящей кислотоустойчивой оболочкой.
Подлинность. Одна таблетка должна содержать (100000 ± 20000) единиц связывания холерогена-анатоксина (ЕС) и иметь обратный показатель титра в РНГА О1-антигена штаммов V. cholerae не менее 2000 условных единиц. Методика определения изложена в разделе «Специфическая активность».
Распадаемость. Определение проводят в соответствии с ОФС «Распадаемость таблеток и капсул».
Средняя масса таблетки. От 0,285 до 0,315 г. Определение проводят в соответствии с ОФС «Однородность массы дозированных лекарственных форм».
рН растворенного препарата. От 6,7 до 7,4. Таблетку растворяют в 50 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».
Потеря в массе при высушивании. Не более 5,0 %. На каждый из 2 параллельных анализов используют навеску из 3 измельченных таблеток. Определение проводят в соответствии с ОФС «Потеря в массе при высушивании».
Формальдегид. Не более 0,2 %. 2 таблетки предварительно растирают в ступке, добавляют 10 мл воды очищенной, перемешивают до получения суспензии, центрифугируют в течение 15 мин при 6000 об/мин. Отбирают 2 мл прозрачной надосадочной жидкости и доводят водой очищенной до 5 мл. Далее определение проводят в соответствии с ОФС «Количественное определение формальдегида в иммунобиологических лекарственных препаратах».
Микробиологическая чистота. В 1 таблетке допускается не более 1000 колоний непатогенных микроорганизмов. Вакцина не должна содержать патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
На испытание одного образца используют 5 таблеток. Определение проводят в соответствии с правилами асептики. Каждую таблетку берут пинцетом, ополаскивают стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида, рН (7,2 ± 0,1), и помещают в фарфоровую ступку с пестиком, прикрытую марлевой салфеткой; вносят 20 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, тщательно растирают в течение 1 – 2 мин, переносят во флакон вместимостью 100 мл и перемешивают до образования гомогенной суспензии. По 0,2 мл суспензии высевают пипеткой на 10 чашек Петри с мясопептонным агаром (МПА), рН (7,3 ± 0,1), на 5 чашек с МПА с добавлением 3 – 5 % дефибринированной бараньей крови и по 1 мл вносят во флакон с 50 мл 10 % желчного бульона, рН (7,4 ± 0,1). Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 48 ч. После инкубации по 0,2 мл из флакона с желчным бульоном высевают на 5 чашек с агаром Эндо и инкубируют в течение 48 ч при температуре
(37 ± 1) °С.
Учет результатов. Подсчитывают число колоний, выросших на 10 чашках. Петри с МПА. Если при посеве на МПА выросло более 1000 колоний непатогенных микробов на 1 таблетку, препарат контролируют повторно на удвоенном количестве образцов. Если при повторном контроле число выросших колоний превысит 1000, серию вакцины бракуют.
Пример расчета: 5 таблеток одной серии восстановлены в 20 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, то есть 1 таблетка восстановлена в 4 мл; далее делают высев в объеме 0,2 мл на одну чашку Петри и, соответственно на 10 чашек Петри с МПА 2 мл. Если сумма выросших колоний составляет 500, то на 1 таблетку приходится 1000 колоний непатогенных микробов.
Не допускается наличие колоний, дающих зону гемолиза, на МПА с дефибринированной бараньей кровью. На среде Эндо должны отсутствовать как бесцветные, так и красные с металлическим блеском колонии.
Аномальная токсичность. Вакцина должна быть нетоксичной. Испытание проводят на беспородных белых мышах обоего пола массой
(19 ± 1) г.
Соблюдая условия асептики, 2 таблетки от серии берут пинцетом, ополаскивают 0,9 % раствором натрия хлорида, помещают в фарфоровую ступку с пестиком, добавляют 160 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и тщательно растирают таблетки в течение 1 – 2 мин, содержимое переносят во флакон вместимостью 100 мл и тщательно перемешивают до образования гомогенной суспензии. Полученную суспензию в объеме 0,5 мл вводят подкожно в область спины вдоль позвоночника 10 животным. Животные должны оставаться живыми в течение 7 сут без видимых признаков заболевания. Масса каждого животного в день окончания наблюдения не должна быть меньше исходной. Если в течение периода наблюдения регистрируется гибель, уменьшение массы, заболевание, развитие некроза или абсцесса в месте введения хотя бы у 1 животного, испытание повторяют на удвоенном количестве белых мышей. Повторное испытание считается удовлетворительным, если препарат отвечает установленным требованиям.
Специфическая безопасность. Вакцина должна быть специфически безопасной.
Определение проводят на 2 кроликах массой (2,75 ± 0,25) кг со светлой кожей. За 24 ч до постановки испытания ножницами выстригают шерсть на боковой поверхности тела размером 30×15 см, затем остатки шерсти удаляют кремом-депилятором.
Испытанию подлежит смесь из 3 таблеток. Таблетки пинцетом помещают в ступку и растирают в 75 мл 0,9 % раствора натрия хлорида до получения суспензии (разведение 1:25). Затем 1 мл суспензии вносят в пробирку, содержащую 9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, получая разведение вакцины 1:250. Далее в ряд пробирок вносят по 1 мл этого разведения и добавляют 3; 5 и 7 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, получая разведения 1:1000; 1:1500 и 1:2000 соответственно. По 0,2 мл каждого разведения переносят в пробирки, добавляют к ним по 0,6 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, получая конечные разведения 1:4000; 1:6000; 1:8000, которые соответствуют 4000; 6000; 8000 ЕС анатоксина в 0,1 мл или соответственно 40 000; 60 000 и 80 000 ЕС/мл. Каждое разведение вводят 2 кроликам в объеме 0,1 мл внутрикожно на расстоянии 30 мм друг от друга, начиная с последнего разведения 1:8000.
Учет результатов проводят через 24 ч, измеряя размер папул линейкой. Вакцина специфически безопасна, если при внутрикожном введении в разведении не более 1:6000 (60000 ЕС/мл) не образуются или образуются папулы диаметром до 10 мм. Если размер папул хотя бы у 1 кролика больше 10 мм, испытание повторяют на том же количестве животных. Если при введении вакцины в разведении 1:8000 наблюдаются папулы диаметром 5 мм и более, серию вакцины бракуют.
Специфическая активность
1. Антигенная активность по анатоксинсвязыванию. Одна таблетка должна содержать (100000 ± 20000) единиц связывания анатоксина (ЕС). Испытание проводят на 2 кроликах массой (2,75 ± 0,25) кг со светлой кожей. Подготовка боковой поверхности кожи кролика изложена в разделе «Специфическая безопасность». В испытании используют стандартные образцы (СО) холерного тест-токсина сухого (далее тест-токсин) и сыворотки антихолерогенной сухой (далее сыворотка).
Разведение СО сыворотки антихолерогенной сухой. Содержимое ампулы СО сыворотки антихолерогенной сухой растворяют в 1 мл воды очищенной, переносят во флакон объемом 100 мл и разводят водой очищенной до получения разведения сыворотки 80 АЕ/мл.
Разведение СО холерного тест-токсина сухого. В ампулу СО холерного тест-токсина сухого вносят 1 мл воды очищенной, переносят во флакон объемом 100 мл и разводят водой очищенной до получения 20 опытных доз в 1 мл раствора.
Определение ЕС проводят в смеси из 3 таблеток. Таблетки растирают в ступке, добавляют 75 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и растворяют до получения гомогенной суспензии (разведение 1:25). Затем 1 мл переносят в пробирку и добавляют 9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, получая разведение 1:250. Далее делают ряд последовательных разведений 1:1000; 1:1500; 1:2000; 1:2500; 1:3000 и 1:3500 в 0,9 % растворе натрия хлорида. По 0,2 мл каждого разведения переносят в пробирки и добавляют по 0,2 мл сыворотки, содержащей 80 АЕ/мл, получая разведения вакцины от 1:2000 до 1:7000. Пробирки выдерживают в течение 30 мин при температуре
(37 ± 1) °С. После инкубации в каждую пробирку добавляют по 0,4 мл 20 опытных доз/мл тест-токсина, получая разведения от 1:4000 до 1:14000. Пробирки встряхивают и выдерживают при температуре (37 ± 1) °С в течение 30 мин. По 0,1 мл содержимого каждой пробирки вводят внутрикожно на расстоянии 30 мм 2 кроликам в депилированный участок кожи, начиная с разведения 1:14000.
Одновременно на тех же кроликах определяют 1 АЕ сыворотки. В ряде пробирок готовят разведения антитоксической сыворотки в 0,9 % растворе натрия хлорида, содержащие 80; 60; 40; 30 и 20 АЕ в 1 мл. По 0,2 мл каждого разведения сыворотки переносят в пробирки и добавляют по 0,2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и по 0,4 мл из разведения тест-токсина, содержащего 20 опытных доз/мл, получая содержание в сыворотке 2; 1,5; 1; 0,75; 0,5 АЕ. Пробирки выдерживают при температуре (37 ± 1) °С в течение 30 мин. После инкубации по 0,1 мл каждого разведения вводят внутрикожно 2 кроликам, начиная с 2 АЕ (контрольный ряд).
Учет результатов. Учет результатов проводят через 24 ч. Положительной реакцией в опытных рядах при введении разведений 1:8000; 1:10000; 1:12000 считают зону отека диаметром от 5 до 10 мм. Размер папулы в опытном ряду должен быть равен размеру папулы в контрольном ряду, где 1 опытная доза тест-токсина связала 1 АЕ сыворотки.
Принимая во внимание значительные колебания индивидуальной чувствительности кожи кроликов, расчет антигенной активности по ЕС проводят по одному из 4 вариантов:
1 вариант положительная реакция в контрольном ряду наблюдается с сывороткой 1; 0,75 и 0,5 АЕ и отсутствует в разведениях 2 и 1,5АЕ; следовательно, 1 опытная доза тест-токсина связала 1 АЕ сыворотки. Наибольшее разведение вакцины, при введении которой наблюдается положительная кожная реакция у 2 кроликов в опытном ряду, например, 1:8000, следовательно, в 0,1 мл вакцины содержится 8000 ЕС или 80000 ЕС в 1 мл (в 1 таблетке).
2 вариант положительная реакция в контрольном ряду наблюдается в разведениях сыворотки 0,75 и 0,5 АЕ; следовательно, 1 опытная доза тест-токсина связала 1,25 АЕ (2 АЕ – 0,75 АЕ) сыворотки. Наибольшее разведение вакцины, при введении которого наблюдается положительная кожная реакция у 2 кроликов в опытном ряду, например, 1:8000. Так как токсин связал 1,25 АЕ, расчет количества ЕС в препарате проводят путем умножения 1,25 * 8000, следовательно, в 0,1 мл содержится 10000 ЕС или 100000 ЕС в 1 мл (в 1 таблетке).
3 вариант положительная реакция в контрольном ряду наблюдается в разведениях сыворотки 1,5; 1; 0,75 и 0,5 АЕ и отсутствует только с разведением 2 АЕ; следовательно, 1 опытная доза тест-токсина связала 0,5 АЕ (2 АЕ – 1,5 АЕ) сыворотки. Например, наибольшее разведение вакцины, при введении которой наблюдается положительная кожная реакция у 2 кроликов в опытном ряду, 1:8000. Так как токсин связал 0,5 АЕ, расчет количества ЕС в препарате проводят следующим образом: 0,5 * 8000, следовательно, в 0,1 мл содержится 4000 ЕС или 40000 ЕС в 1 мл (в 1 таблетке).
4 вариант – если положительная реакция в контрольном ряду наблюдается хотя бы у 1 кролика при разведении 0,5 АЕ или во всех разведениях сыворотки 2; 1,5; 1; 0,75 и 0,5 АЕ, то учет результата не проводят и постановку испытания повторяют на 2 кроликах. Повторное испытание считается удовлетворительным, если препарат отвечает установленным требованиям по вариантам 1, 2 или 3.
2. Содержание О-антигена. Одна таблетка должна содержать не менее 2000 условных единиц О-антигена вакцинных штаммов V. cholerae О1 (обратный показатель титра в РНГА).
Для испытания используют 3 таблетки. Каждую таблетку тщательно растирают в отдельной ступке, добавляют 10 мл воды очищенной. Содержимое каждой ступки переносят в отдельные флаконы вместимостью 100 мл и оставляют для осаждения на 10 15 мин при температуре
(20 ± 2) °С. По 5 мл надосадочной жидкости из каждого флакона переносят в пробирки и добавляют по 2 капли 40 % раствора натрия гидроксида; выдерживают на водяной бане при температуре (100 ± 1) °С в течение 2 мин, охлаждают водопроводной водой до температуры (19 ± 1) °С и добавляют пастеровской пипеткой по капле 0,5 % раствор розоловой кислоты до окрашивания растворов в ярко-розовый цвет. Далее в пробирки добавляют по каплям (2 4 капли) ледяную уксусную кислоту до перехода окрашивания растворов в желтый цвет. Затем по каплям (от 2 до 7 капель) вносят 10 % раствор натрия углекислого до появления бледно-розового окрашивания. Для постановки реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) каждую пробу вакцины дополнительно разводят 1:3 и 1:7. Для постановки РНГА используют неразведенную (цельную) пробу и полученные разведения.
Постановка РНГА (микрометод). Постановку РНГА проводят на 3 полистироловых планшетах с круглодонными лунками. В 8 лунок 6 рядов каждого планшета вносят по 0,025 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. В первые лунки каждого ряда вносят по 0,025 мл следующих образцов: в 1 2 ряды цельной пробы, в 3 4 ряды разведение 1:3, в 5 6 ряды разведение 1:7; и делают последовательные двукратные разведения до восьмой лунки (из восьмой лунки 0,025 мл удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором), получая разведения: в 1 2 рядах – от 1:2 до 1:256, в 3 4 рядах от 1:6 до 1:768, в 5 6 рядах от 1:14 до 1:1792. После этого в лунки всех рядов добавляют по 0,025 мл 50 % взвеси формалинизированных эритроцитов барана, разведенных в 50 раз. Содержимое лунок перемешивают покачиванием планшетов, оставляют на 15 мин при температуре (20 ± 2) °С и затем во все лунки вносят по 0,05 мл сыворотки холерной О1 агглютинирующей адсорбированной в разведении 1:2. Планшеты оставляют при температуре (20 ± 2) °С в течение 24 ч.
Постановка контроля формалинизированных эритроцитов барана. В контрольную лунку вносят 0,025 мл взвеси разведенных в 50 раз эритроцитов барана и добавляют 0,075 мл 0,9 % раствора натрия хлорида.
Учет результатов РНГА. Результат считают положительным при наличии гемагглютинации (эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», занимая не менее 2/3 сферической поверхности лунки; в ряде случаев может наблюдаться фестончатое оплывание краев агглютината).
Результат считают отрицательным при отсутствии гемагглютинации (эритроциты выпадают на дно лунки в виде темно–коричневой полусферы или узкого колечка с ровным краем – «пуговки»). В контрольных лунках результат должен быть отрицательным.
Последние лунки ряда, в которых наблюдается положительная гемагглютинация, учитывают как показатели титров в РНГА, определяющие разведения вакцины. Рассчитывают среднее арифметическое значение обратных показателей титров в РНГА 3 разведений (в 2 повторностях) и умножают на 10 (разведение таблетки). Обратная величина титра РНГА соответствует содержанию О1-антигена вакцинных штаммов V. cholerae в условных единицах в 1 таблетке. Колебания результатов обратных показателей титров в РНГА в таблетках не должны превышать 5 % от средней арифметической величины.
Иммуногенностъ. ЕD50 должна быть не более 1/20000 части таблетки. Для испытания используют 2 таблетки, которые растирают в стерильной ступке и добавляют 10 мл 0,9 % раствора натрия хлорида (в 0,5 мл 1/10 часть таблетки). Затем делают десятикратные последовательные разведения в 0,9 % растворе натрия хлорида, получая в 0,5 мл от 1/100 до 1/1000 части таблетки. После чего делают последовательные пятикратные разведения в 0,9 % растворе натрия хлорида, содержащие в 0,5 мл от 1/5000 до 1/125000 части таблетки. Таким образом, получают 4 иммунизирующие дозы, содержащие 1/1000, 1/5000, 1/25000 и 1/125000 часть таблетки в объеме 0,5 мл каждая. Каждую дозу вводят в объеме 0,5 мл однократно внутрибрюшинно 16 беспородным белым мышам обоего пола массой
(11 ± 1) г.
Через (13 ± 1) сут по 8 иммунизированных животных заражают дозой 300 LD50 (допускается доза от 50 до 500 LD50) внутрибрюшинно взвесью 3 4-часовых агаровых культур V. cholerae О1 биовара Эльтор, серовара Инаба и V. cholerae О1 биовара Эльтор, серовара Огава в объеме 0,5 мл.
Подготовка штаммов для заражения описана в нормативной документации производителя. Для контроля берут по 10 белых мышей на каждый штамм для заражения, вводят им ту же дозу LD50, что и иммунизированным животным.
Учет результатов. Наблюдение за животными ведут в течение 3 сут. В группах иммунизированных и заражённых животных для определения ЕD50 подсчитывают количество выживших. В группе зараженных белых мышей для определения 1 LD50 подсчитывают количество павших животных. В контрольной группе животных, зараженных 300 LD50, допустимо выживание от 1 до 3 белых мышей для каждого штамма.
По методу Кербера в модификации И. П. Ашмарина подсчитывают ЕD50 и LD50 для каждого заражающего штамма. Если величина ED50 хотя бы одного из заражающих штаммов будет выше допустимого значения, контроль повторяют на том же количестве животных. Если при повторном испытании величина ED50 вновь превысит допустимый предел, серию бракуют.
Если при расчете величины заражающей дозы будет установлено, что она содержит менее 50 или более 500 LD50, контроль повторяют на том же количестве животных. Если в контрольной группе животных, зараженных 300 LD50, выживет более 3 белых мышей, контроль повторяют на том же количестве животных.
Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».
Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8 °С.