Вакцина гриппозная живая ФС.3.3.1.0027.15

Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ФС.3.3.1.0027.15 Вакцина гриппозная живая

Взамен ВФС 42-265ВС-96

Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину гриппозную аллантоисную живую, которая представляет собой аттенуированные реассортантные вирусы гриппа типов А и В, полученные из вируссодержащей аллантоисной жидкости, выращенные раздельно на развивающихся куриных эмбрионах. Препарат лиофильно высушен со стабилизатором. Препарат вызывает формирование специфического иммунитета против гриппа.

Вакцина предназначена для специфической профилактики гриппа.

Производство

Штаммовый состав вакцин ежегодно рекомендуется ВОЗ и национальной Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам.

Куриные эмбрионы должны быть получены из птицехозяйств, благополучных по возбудителям, патогенным для человека. Качество поставляемых эмбрионов должно быть подтверждено ветеринарными свидетельствами.

Все этапы производства вакцины должны осуществляться с соблюдением установленных требований к правилам организации производства и контролю качества лекарственного препарата, гарантирующих его качество и безопасность для человека, в помещениях, исключающих работу с другими патогенными микроорганизмами и антибиотиками. Не допускается производство препарата на территории, на которой расположены производственные здания по производству антибиотиков, если не соблюдены требования к защитным зонам, согласно действующим санитарным правилам. Обязательным условием технологического процесса производства вакцины является соблюдение поточности, исключающей возможность перекреста промежуточных продуктов и полуфабрикатов, получаемых на разных стадиях производства, и их контаминацию посторонними веществами, в первую очередь посторонней микрофлорой. В производственных помещениях запрещается работа с другими вирусами гриппа, кроме вакцинных. Сотрудники, работающие на производстве живой гриппозной вакцины, не должны контактировать с другими инфекционными агентами в течение того же рабочего дня.

Все производственные процессы, технологическое оборудование и методы контроля должны быть валидированными. Качество исходного сырья и материалов, используемых в производстве должно быть подтверждено соответствующими документами (допустимо использование компонентов только фармакопейного качества). В состав вакцины должны входить вспомогательные компоненты, стабилизаторы, не снижающие эффективности вакцины, разрешенные к медицинскому применению в дозах, не вызывающих токсические, аллергические или иные нежелательные реакции у человека.

Производство вакцины включает несколько стадий с обязательным внутрипроизводственным контролем: получение посевного вируса; накопление вируса; объединение его со стабилизатором; лиофилизация; с указанием название защитного газа, используемого при запайке ампул, производство лекарственной формы препарата; маркировку: фасовку. На каждой стадии должны быть предусмотрены: система и схема анализа показателей качества в ходе технологического процесса и испытания конечного продукта; хранение промежуточных и конечного продуктов, обеспечивающее стабильность качества в течение срока годности продукта.

На этапах производства необходимо контролировать:

— Качество сырья: 9-11 — дневных куриных эмбрионов. Из каждой партии 2% эмбрионов, использованных для приготовления вируса, без заражения инкубируют одновременно с зараженными эмбрионами. Их аллантоисная жидкость испытывается на наличие гемагглютинирующих агентов. Эмбрионы следует брать из изолированных групп птиц, постоянно контролируемых в отношении отсутствия целого ряда инфекций и антител к следующим возбудителям: аденовируса птиц 1-ой группы (Celo, Phelps), аденовируса птиц 3-ой группы (В8/78), аденовируса птиц 4-ой группы (KR-95), энцефаломиелита птиц (Van Roakel), гриппа птиц (видовой) тип A (H1-Н15), парамиксовируса птиц (тип 2) (Yucaipa), реовируса птиц (1133), пневмовируса (UK), туберкулеза птиц (Mycobacterium avium intracellulare), вируса анемии цыплят (DelRose), оспы птиц (Кучинский), инфекционного бронхита (Massachusetts), инфекционного бурсита (Winterfild 2515), инфекционного ларинготрахеита (Cover), лейкоза птиц (антитела НС-1), вирусов лимфоидного лейкоза (р27) (А, В, С, D, Е, J), болезни Марека — серотипы 1, 2 и 3 (SB-1/HVT), микоплазмоза птиц (Mycoplasma gallisepticum), болезни Ньюкасла (La-Sota), гемофиллеза (Haemophilus paragallinarum), сальмонеллеза (род Salmonella), пастереллеза (Pasteurella multocida), орнитобактериоза (Ornithobacterium rhinotracheale).

— Производственные штаммы: используются аттенуированные, реассортантные штаммы вируса гриппа типа А и В. Источник и история пассажей должны быть известны. Вакцинный вирус должен быть генетически стабильным, иммуногенным, не передаваться восприимчивым индивидуумам и иметь соответствующие лабораторные маркеры аттенуации. Его иммуногенность и безопасность для человека должны быть предварительно установлены. Продукция вакцины основывается на системе посевных вирусов (seed-lot). Из штамма готовится маточный материал или главный посевной вирус, который должен храниться при температуре минус 70°С в жидком виде или при температуре минус 20°С в лиофильно высушенном виде. Штаммы и маточный материал должны быть проверены по всем биологическим свойствам в соответствии с регламентированными требованиями.

— Из маточного материала готовят рабочий посевной вирус. Финальный сбор представляет собой не более пятого пассажа от вакцинного вируса.

— Антибиотики: пенициллин или стрептомицин нельзя использовать ни на одной из стадий производства.

Испытания

Описание. Аморфная масса от белого до светло-коричневого цвета. Определяют визуально.

Подлинность. Моновакцины должны взаимодействовать с соответствующими гомологичными типоспецифическими сыворотками и не взаимодействовать с сыворотками к другим типам и подтипам вируса гриппа. Титр с гетерологичной сывороткой должен быть ниже ее собственного титра, по крайней мере, в 4 раза. Определение проводят в полуфабрикатах (моновакцинах), лиофилизированных одновременно с трехвалентным препаратом, в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Метод постановки РТГА с вирусом гриппа (макрометод). РТГА применяют для установления типа и подтипа вируса, т.е. специфичности, а также для определения нарастания титров специфических антител. Постановка РТГА включает следующие этапы работы: приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в реакции гемагглютинации (РГА) и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции. Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

— антиген (вакцина, вируссодержащая жидкость — аллаптоисная или культуральная);

— иммунные сыворотки к различным серотипам вируса гриппа;

— фосфатный буферный раствор рН 7,2 ± 0,2 ;

— взвесь куриных эритроцитов, 1%.

1. Приготовление взвеси куриных эритроцитов. Для постановки РТГА используют эритроциты петухов. Кровь у петухов берут из сердца или подкрыльцовой вены.

Свежеполученную кровь от 3-5 петухов помещают во флакон со стеклянными бусами или же с одним из антикоагулянтов (раствор Альсевера, 5% раствор натрия цитрата). Дефибринирование крови проводят немедленно путем интенсивного встряхивания флакона в течение 5-7 мин при температуре (20 ± 2)ºС до выпадения волокон фибрина.

Дефибринированную кровь фильтруют через 4 слоя марли, затем трехкратно отмывают фосфатным буферным раствором (на 1 объем крови — 4 объема фосфатного буферного раствора) при центрифугировании (800 ± 200) об/мин в течение (15 ± 5) мин. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка, принимаемого за 100%, готовят 1% суспензию куриных эритроцитов по объему.

2. Определение гемагглютинирующего титра антигена. В круглодонных лунках плексигласового планшета готовят двукратные разведения антигена (титруемого вируса из испытуемой вакцины) в объеме 0,4 мл на фосфатном буферном растворе, начиная с 1:10 до 1:1280. В каждую лунку вносят по 0,4 мл 1% суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием планшеты и оставляют при температуре (20 ± 2)ºС на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле).

Реакцию оценивают по «четырехкрестовой» системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (+++ или ++++).

Определение титра антигена сопровождается отрицательным контролем на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. С этой целью в контрольную лунку того же плексигласового планшета вносят 0,4 мл фосфатного буферного раствора и 0,4 мл 1% суспензии эритроцитов. При отсутствии спонтанной агглютинации на дне лунки выпадает гомогенный с ровными краями осадок эритроцитов (отрицательная реакция).

3. Приготовление рабочей дозы антигена. В РТГА рабочей дозой антигена является то разведение антигена, в 0,2 мл которого содержится 4 агглютинирующие единицы (4 АЕ). Для ее вычисления следует установленную величину титра антигена разделить на 8. Полученная от деления цифра указывает во сколько раз нужно развести антиген, чтобы в 0,2 мл его содержалось 4 АЕ (рабочая доза).

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (4 АЕ). Для этого в пять лунок горизонтального ряда плексигласового планшета, начиная со второй, вносят по 0,2 мл фосфатного буферного раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 0,2 мл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания переносят 0,2 мл смеси из лунки в лунку, начиная со 2-й по 5-ю лунку, из 5-й лунки 0,2 мл удаляют. Затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл фосфатного буферного раствора и по 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. В 6-й лунке ставят контроль на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. После встряхивания смесь оставляют при температуре (20 ± 2)ºС на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле).

При правильном выборе рабочей дозы полная (++++) агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в первых трех лунках. В 4-й и 5-й лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного выше, разведение антигена должно быть изменено путем добавления соответствующего количества антигена или фосфатного буферного раствора для получения необходимой рабочей дозы. При этом необходимо повторно проверить правильность приготовления рабочей дозы.

4. Постановка реакции торможения гемагглютинации. Сыворотки, используемые в РТГА, могут содержать неспецифические ингибиторы гемагглютинации. Поэтому для их удаления перед постановкой РТГА сыворотки необходимо обработать нейраминидазой холерных вибрионов или RDЕ-реагентом (Примечания).

После удаления неспецифических ингибиторов готовят двукратные разведения сывороток в лунках плексигласовой доски, начиная с 1:10 до 1:640 и выше в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл рабочей дозы антигена (4 АЕ). Смесь встряхивают и после контакта антигена и сыворотки (от 30 мин до 1 ч) при температуре (20 ± 2)ºС в каждую лупку добавляют по 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают, оставляют при температуре (20 ± 2)ºС в течение 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции.

При наличии специфических антител в сыворотке наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр сыворотки принимают предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

Задержка гемагглютинации указывает на соответствие типа антигена и взятой сыворотки; отсутствие задержки гемагглютинации свидетельствует о несоответствии типа взятой сыворотки.

Примечания.

1. Удаление неспецифических ингибиторов гемагглютинации из иммунных сывороток с помощью нейраминидазы холерных вибрионов или RDE-реагентом. При наличии инструкции по применению коммерческого реактива необходимо следовать требованиям, изложенным в данном документе. Метод основан на способности нейраминидазы холерных вибрионов, не действуя на специфические антитела, разрушать ингибиторы гемагглютинации к вирусам гриппа А и В в сыворотках крови человека, кур, крыс, кролика.

К 1 объему сыворотки добавляют 3 объема реагента нейраминидазы. К смеси, состоящей из 0,1 мл сыворотки и 0,3 мл реагента нейраминидазы добавляют 0,6 мл фосфатного буферного раствора для получения разведения сыворотки 1:10. Далее смесь инкубируют при температуре (37 ± 2)ºС в течение 18-20 час и затем прогревают при температуре (56 ± 2)ºС в течение 30 мин. Сыворотка, обработанная нейраминидазой, может быть использована для постановки РТГА в течение 2 недель при условии ее хранения при температуре (5 ± 1)°C .

2. Приготовление 0,1 М раствора фосфатного буферного рН 7,2 ± 0,2 .

Раствор 1. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 17,8 г натрия фосфата двузамещенного 2-водного (Na₂HPO₄ * 2H₂O), растворяют в 500 мл воды очищенной, доводят объём раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор 2. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 15,6 г натрия фосфата однозамещённого 2-водного (NaH₂PO₄ * 2H₂O) , растворяют в 500 мл воды очищенной, доводят объём раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 720 мл раствора 1, прибавляют 280 мл раствора 2 и перемешивают. Затем в мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 100 мл приготовленного 0,1 М фосфатного буферного раствора доводят объём раствора водой очищенной до метки, перемешивают, прибавляют 8,5 г натрия хлорида и вновь перемешивают. рН полученного раствора должен быть 7,2 ± 0,05 . Если показатель рН выше или ниже требуемого, его соответственно доводят 1 М раствором хлористоводородной кислоты или 1 М раствором натрия гидроксида.

Приготовление раствора Альсевера. Состав:

— 2,05% глюкозы;

— 0,42% натрия хлорида;

— 0,8% натрия цитрата;

— 100,0 мл воды очищенной

рН раствора доводят с помощью 5% раствора лимонной кислоты до рН 5,6 (примерно 10 мл 5% раствора лимонной кислоты на 1 л раствора Альсевера). Раствор стерилизуют фильтрацией или автоклавированием в течение 3 последовательных дней при температуре 100°С и давлении 0,7 атм. Для консервирования раствора добавляют на 1 мл крови 1,2 мл раствора Альсевера. В данном растворе эритроциты можно хранить при температуре (4 ± 2)°C в течение 1-2 нед. Перед употреблением эритроциты необходимо трехкратно отмыть фосфатным буферным раствором с помощью центрифугирования при (800 ± 200) об/мин в течение 10 мин.

3. Приготовление консервирующего 5% раствора натрия цитрата. 5% раствор натрия цитрата перед использованием разводят в 2 раза 0,1 М фосфатным буферным раствором. К одной части полученного раствора натрия цитрата добавляют 2 части крови петухов. В данном растворе эритроциты могут храниться при температуре (4 ± 2)°C в течение 3-5 сут.

Метод постановки РТГА с вирусом гриппа (микрометод). Принцип метода, его учет и ингредиенты для реакции, проводимой микрометодом, те же, что и для проведения РТГА макрометодом. Отличие методов заключается в изменении концентрации и объемов ингредиентов.

Реакцию ставят на микропанели с «U»-образными лунками.

Приготовление 0,5% взвеси куриных эритроцитов. Взвесь готовят из 1% суспензии эритроцитов (макрометод) разведением ее в 2 раза фосфатным буферным раствором (в соотношении 1:1).

2. Определение гемагглютинирующего титра антигена. В каждую лунку микропанели одного ряда вносят фосфатный буферный раствор в объеме 50 мкл. Затем в первую лунку вносят 50 мкл антигена в разведении 1:10 и далее проводят титрование по принципу двукратного разведения. Из последней лунки удаляют 50 мкл. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл 0,5% суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 40-45 мин до оседания эритроцитов в контроле.

Реакцию оценивают по «четырехкрестовой» системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (+++ или ++++).

Определение титра антигена сопровождается постановкой отрицательного контроля на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. В качестве отрицательного контроля служат несколько лунок панели, в которые вместо антигена внесен фосфатный буферный раствор.

3. Приготовление рабочей дозы антигена. Рабочая доза антигена при постановке РТГА микрометодом равна 8 АЕ. Для её приготовления гемагглютинирующий титр делят на 16. Полученное значение указывает во сколько раз необходимо развести антиген.

Пример разведения антигена: титр антигена равен 160. Разделив 160 на 16, получается цифра 10, указывающая на то, что антиген необходимо развести в 10 раз.

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (8 АЕ). Для этого в шесть лунок микропанели, начиная со второй, вносят по 25 мкл фосфатного буферного раствора. В 1 и 2 лунки добавляют по 25 мкл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания 25 мкл смеси переносят из 2 лунки в 3, из 3 — в 4 и т.д. Из последней лунки панели 25 мкл удаляют. Затем во все лунки добавляют по 25 мкл фосфатного буферного раствора и по 50 мкл 0,5% суспензии эритроцитов. После встряхивания смесь оставляют при температуре (20 ± 2)ºС на 40-45 мин до оседания эритроцитов в контроле.

При правильном выборе рабочей дозы агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в четырех лунках панели. В остальных лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного результата добавляют антиген или фосфатный буферный раствор для получения необходимой рабочей дозы.

4. Постановка реакции торможения гемагглютинации. Метод постановки реакции микрометодом соответствует таковому, описанному для макрометода, за исключением объемов используемых ингредиентов реакции.

Готовят двукратные разведения сыворотки в объеме 25 мкл, вносят рабочую дозу антигена (8 АЕ) в объеме 25 мкл и после контакта антигена и сыворотки (от 30 мин до 1 ч) при температуре (20 ± 2)ºС в каждую лунку панели вносят по 50 мкл 0,5% взвеси эритроцитов. После оседания эритроцитов в контроле (как правило, через 40-45 мин) проводят учет результатов (макрометод).

За титр сыворотки принимают величину обратную ее разведению, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов.

Испытания лиофилизированного препарата

Время растворения. Содержимое ампулы должно полностью раствориться в течение 3 мин при встряхивании в 0,5 мл воды. Определение проводят визуально.

Потеря в массе при высушивании. Не более 2,5%. Определение проводят в соответствии с ОФС «Потеря в массе при высушивании».

Испытания восстановленного препарата

Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость.

Прозрачность. Должен быть прозрачным или выдерживать сравнение с эталоном, указанным в фармакопейной статье. Определение проводят в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности».

Цветность. Должен быть бесцветным или выдерживать сравнение с эталоном, указанным в нормативной документации. Определение проводят в соответствии с ОФС «Степень окраски жидкостей».

рН. От 7,0 до 8,0. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Стерильность. Препарат должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».

Отсутствие посторонних вирусов, микоплазм, микобактерий туберкулеза. Препарат не должен содержать микоплазм, микобактерий туберкулеза, посторонних вирусов. Определяют в вируссодержащей аллантоисной жидкости до добавления стабилизатора в соответствии с ОФС «Испытание вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов».

При контроле на наличие посторонних вирусов испытания проводятся на 3-х клеточных культурах и куриных эмбрионах. При нейтрализации вируса гриппа не следует использовать иммунные сыворотки птичьего, обезьяньего или человеческого происхождения. Вирус, используемый для получения гипериммунной сыворотки, должен быть получен либо на культуре клеток не птичьего происхождения, либо на куриных эмбрионах свободных от патогенов. Если используются куриные эмбрионы, они должны быть получены от других групп птиц, которые не использовались для получения исследуемого вируса.

Контроль на микоплазмы проводят с использованием питательной среды для выделения и культивирования микоплазм полужидкую (среда Каган) с использованием нормальной сыворотки крови лошади.

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным.

Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность».

Доза для мышей 0,5 мл внутрибрюшинно.

Специфическая активность. Препарат должен обладать инфекционной активностью не менее 10^6.9 ЭИД₅₀/доза (эмбриональная инфекционная доза) для штаммов вируса гриппа типа А и не менее 10^6.4 ЭИД₅₀/доза для штамма вируса гриппа типа В. Определение проводят в полуфабрикатах (моновакцинах), лиофилизированных одновременно с трехвалентным препаратом по методике, изложенной ниже.

Определение проводят на развивающихся куриных эмбрионах 10-12-дневного возраста.

Готовят десятикратные разведения вируса (вакцины) в 4,5 мл фосфатного буферного раствора рН от 7,0 до 7,4 (каждое разведение отдельной пипеткой. По 0,2 мл вируссодержащей жидкости из разведений от 10^-5 до 10^-7 (разведения могут меняться в зависимости от целей исследования и предполагаемой инфекционной активности вируса) вводят в аллантоисную полость, используя на каждое разведение по 4 эмбриона. Для заражения эмбрионов используют одноразовые шприцы или проводят заражение одним шприцом, начиная с большего разведения.

Эмбрионы инкубируют при температуре, указанной в паспорте на штамм, в течение 48 ч для вируса гриппа (моновакцины) типа А и 72 ч для вируса гриппа (моновакцины) типа В. По истечении срока инкубации отдельно из каждого эмбриона отбирают по 0,4-0,5 мл аллантоисной жидкости, помещают в 4 отдельные лунки плексигласовой доски. Затем в каждую лунку добавляют по 0,4 — 0,5 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. Через 30-40 мин контакта при температуре (20 ± 2)ºС, после оседания эритроцитов в контроле, проводят учет гемагглютинации.

Контрольное испытание: проводят, как описано выше, но вместо аллантоисной жидкости из куриного эмбриона в свободные 4 лунки панели вносят по 0,4-0,5 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,2 ± 0,2 ).

Вычисление биологического титра проводят по методу Рида и Менча (табл. 1).

Метод основан на логической предпосылке, что тканевая культура или животное, погибшие при заражении каким-либо разведением вируса, погибнет и при заражении любым более низким разведением.

Таблица 1 — Подсчет 50% дозы (ТЦД₅₀) по методу Рида и Менча

На примере подсчёта 50% дозы (ТЦД₅₀ — количество цитопатогенных доз) показано, что 50% доза находится между разведениями вируса 10^-6 и 10^-7.

Далее расчет величины разведения (X), которую необходимо прибавить к разведению непосредственно ниже 50% дозы (в log₁₀), производится по следующей формуле:

где: А — процент гибели при разведении, непосредственно ниже искомой 50% дозы (в данном случае 60%);

В — процент гибели при разведении непосредственно выше искомой 50% дозы (в данном случае 17%).

Подставляя полученные значения в формулу 1, находим:

откуда титр вируса (в обратных log₁₀) равен 6 + 0,23 = 6,23; т.е., одна ТЦД₅₀ или LD₅₀ соответствует разведению вируса 10^-6.23.

Если в титрование были взяты разведения вируса с интервалом , то величину X в формуле 1 следует умножить на 0,5.

Поскольку при титровании вируса в пробирочных культурах обычно получаются четкие результаты и культуры со 100% дегенерацией отделены от культур с полным отсутствием дегенерации всего одним разведением вируса, удобно пользоваться при подсчете титров по Риду и Менчу упрощенной схемой (табл. 2).

Таблица 2 — Упрощенная схема подсчета титров по Риду и Менчу

Титр вируса log ИД₅₀/0,2 в равен: n, 33 т.е. 5,33 ИД₅₀/0,2 мл.

Указание объема вирусной взвеси, вводимой при заражении эмбрионов, обязательно, так как величина инфекционной активности будет различной.

Для вычисления ТЦД₅₀ вируса в 1 мл исследуемой жидкости к показателю величины титра вируса в log₁₀ прибавляют в зависимости от количества вируссодержащего материала, взятого для заражения одной культуры, соответствующие величины поправок (табл. 3).

Таблица 3 — Величины поправок

Например, если во всех пробирочных культурах, зараженных по 0,2 мл материалом в разведении 10^-4, наблюдается цитопатогенный эффект, а в культурах, инокулированных разведением 10^-6, цитопатогенного эффекта не наблюдается (при инокуляции же разведением 10^-5 цитопатогенный эффект отмечен в одной из четырех пробирок), то титр вируса в log₁₀ будет равен 10^4,66. Содержание же его в 1 мл будет равно 10^5,36 ТЦД₅₀.

Иммуногеиность. Препарат должен вызывать прирост гомологичных антигемагглютинирующих антител в сыворотке крови в 4 и более раз у не менее чем 60% привитых людей для штаммов вируса гриппа типа А и у 40% привитых людей для штамма вируса гриппа типа В. Определение проводят на группе из 50 человек с исходным титром антител не выше 1:16. Проводят контроль первых трёх серий при введении нового штамма.

Реактогенность. Препарат не должен вызывать повышение температуры выше 37,5°С более, чем у 2% привитых при проверке на группе из 50 человек в возрасте от 18 до 55 лет. Контролируют первые три серии при введении нового штамма.

Производственные штаммы. Вакцинные штаммы вирусов гриппа типа А и В рекомендованные ВОЗ, ЕС и Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам должны соответствовать по антигенной структуре антигенной разновидности вирусов гриппа подтипов A(N₁H₁), A(H₃N₂) и типа В на текущий эпидемический сезон, иметь известную историю пассажей и источник выделения.

Штаммы должны удовлетворять следующим требованиям:

— пройти не менее пяти пассажей на куриных эмбрионах и обладать инфекционной активностью не менее 10^7.0 ЭИД₅₀/0,2 для типа А и 10^6.5 ЭИД₅₀/0,2 для типа В;

— быть специфичными и соответствовать антигенной структуре циркулирующим вирусам гриппа в РТГА и РИНА (реакция ингибирования нейраминидазной активности);

— быть бактериологически стерильными, не содержать микоплазм, микобактерий туберкулеза и посторонних вирусов.

— быть нетоксичными для мышей;

— быть безвредными для людей, т.е. не вызывать повышение температуры выше 37,5°С в течение 4 сут наблюдения более, чем у 2% привитых с титром антител не выше 1:16 (при испытании на группе из человек, на которых проверяется иммуногенность);

— стимулировать прирост гомологичных антител в сыворотке крови в 4 и более раз у 70% людей, привитых двукратно, и у 50% людей, привитых однократно вакцинными штаммами типа А; у 50% людей, привитых двукратно и 40% людей, привитых однократно вакцинным штаммом типа В (при испытании на группе из 100 человек, из них не менее 40 человек с титром антител 1:8 и ниже).

Упаковка и маркировка. В соответствия с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты». Вторичная (потребительская) упаковка, кроме общепринятых сведений, должна содержать сведения о субстрате культивирования, составе штаммов и эпидсезоне, для которого предназначен препарат.

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8°С в сухом месте.