Спектрофотометрическое определение фосфора в ИЛП

Спектрофотометрическое определение фосфора в иммунобиологических лекарственных препаратах (ОФС.1.7.2.0017.15)

Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОФС.1.7.2.0017.15 Спектрофотометрическое определение фосфора в иммунобиологических лекарственных препаратах (ИЛП)

ОФС вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод,

предназначенный для количественного определения фосфора с помощью спектрофотометрии в иммунобиологических лекарственных препаратах (ИЛП). Метод основан на способности неорганического фосфора в кислой среде образовывать с молибденовой кислотой фосфорномолибденовую кислоту, которая в присутствии аскорбиновой кислоты дает цветную реакцию. Содержание фосфора определяется по результатам измерения оптической плотности растворов при 825 нм в видимой области спектра по калибровочному графику.

Определение фосфора с содержанием 1,2 -2,4 мкг/мл

В термостойкую пробирку размером 250 х 20 мм вносят 0,2 мл испытуемого образца, прибавляют 0,15 мл реактива для минерализации, закрывают стеклянным колпачком и минерализуют на песочной бане при температуре 180 °С до образования темно-коричневой жидкости. Минерализацию продолжают при температуре 250 °С не менее 10 ч до обесцвечивания содержимого пробирки. Одновременно в аналогичных условиях минерализуют контрольный образец, содержащий 0,2 мл воды очищенной и 0,15 мл реактива для минерализации.

Объем минерализата и контрольного образца доводят водой очищенной до 2 мл, перемешивают, прибавляют 2 мл цветного реактива и вновь перемешивают. Растворы помещают в водяную баню и выдерживают

2 ч при температуре 37 °С. Измеряют оптическую плотность испытуемых растворов при 825 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 0,15 мл реактива для минерализации, 1,85 мл воды очищенной и 2 мл цветного реактива.

Содержание фосфора (Х) в 0,5 мл исследуемого образца в микрограммах вычисляют по формуле:

Х = (А * 0,5) / В

где:

А – количество фосфора, найденное по калибровочному графику;

В – объем исследуемого образца, взятый на анализ, в мл,

Построение калибровочного графика. К 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 мл рабочего раствора калия дигидрофосфата (концентрация фосфора: 0,2; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2 мкг) прибавляют воду очищенную до 1,95 мл, 0,05 мл реактива для минерализации, 2 мл свежеприготовленного цветного реактива и выдерживают на водяной бане 2 ч при температуре 37 °С. Измеряют оптическую плотность калибровочных растворов, как описано выше, по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1,95 мл воды очищенной, 0,05 мл реактива для минерализации и 2 мл цветного реактива. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество фосфора в мкг, а по оси ординат – среднее значение показателя оптической плотности при 825 нм.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечания.

1. Приготовление испытуемого раствора. Содержимое каждого флакона (ампулы) растворяют в 0,5 мл растворителя (вода очищенная).
2. Приготовление основного раствор калия дигидрофосфата (80 мкг фосфора в 1 мл). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 0,3509 г (точная навеска) калия дигидрофосфата, доведенного до постоянной массы в эксикаторе над безводным кальция хлоридом, прибавляют 500 мл воды очищенной, 10 мл 5 М раствора серной кислоты, доводят объем раствора до метки и перемешивают. Основной раствор калия дигидрофосфата хранят при комнатной температуре в течение 18 мес.
3. Приготовление рабочего раствора калия дигидрофосфата (2 мкг фосфора в 1 мл). В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,25 мл основного раствора калия дигидрофосфата, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Рабочий раствор калия дигидрофосфата хранят при температуре 2 – 8 °С в течение 6 мес.
4. Приготовление реактива для минерализации. Смешивают в равных объемах серную кислоту концентрированную и 65 – 70 % хлорную кислоту. Раствор хранят в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 18 мес.
5. Приготовление 5 М раствора серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл наливают 600 — 700 мл воды, осторожно при постоянном перемешивании добавляют 279,0 мл серной кислоты концентрированной, доводят объем водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 12 мес.
6. Приготовление 1,5 М раствора серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 500 мл воды, осторожно несколькими порциями при помешивании приливают 83,5 мл серной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой очищенной до метки, охлаждают и перемешивают. Раствор хранят в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 12 мес.
7. Приготовление 2,5 % раствора аммония молибдата. Раствор готовят в конической колбе или химическом стакане вместимостью 1000 мл. Растворяют 25 г аммония молибдата при перемешивании в 700 мл кипящей воды очищенной и выдерживают на водяной бане 2 ч при температуре 37 °С. Раствор оставляют при температуре 18 -22 °С на сутки, затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят объём раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор фильтруют через два слоя фильтровальной бумаги и хранят в склянке из тёмного стекла с притёртой пробкой при температуре 4 – 8 °С в течение 1 мес.
8. Приготовление 10 % раствора аскорбиновой кислоты. В мерный цилиндр вместимостью 20 мл помещают 2 г аскорбиновой кислоты и растворяют в воде очищенной, затем объём раствора доводят до метки и перемешивают. Раствор готовят в день проведения анализа.
9. Приготовление цветного реактива. В химическом стакане при постоянном помешивании добавляют реактивы в следующем порядке: два объема воды очищенной, один объем 1,5 М раствора серной кислоты, один объем 2,5 % раствора аммония молибдата и один объем 10 % раствора аскорбиновой кислоты. Цветной реактив готовят перед проведением анализа.