Растительные клетки в биотехнологии

1. Введение
2. Основная часть:
2.1. Основные понятия
2.2. История развития метода культуры клеток, тканей и органов растений
2.3. Основные направления и сферы применения культур растительных клеток
2.4. Каллусные культуры
2.5. Морфофизиологическая характеристика каллусных клеток. Твердофазный способ культивирования
2.6. Глубинное культивирование клеток растений в жидкой
питательной среде. Суспензионные культуры
2.7. Культивирование отдельных клеток
2.8. Культура растительных клеток как источник лекарственных веществ
3. Заключение
4. Список используемой литературы

Растительные клетки. Введение
В отличие от микроорганизмов, которые издавна используются в традиционных технологиях (хлебопечение, производство кисломолочных продуктов и др.), культуры клеток высших организмов являются сравнительно новым объектом биотехнологии.
Метод культуры клеток высших растений лежит в основе изучения биологии клетки, существующей вне организма. Популяциям растительных клеток, выращиваемым в искусственных условиях, присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференциальной активности генов) и физиологические. Изменчивость, наследуемость возникших изменений, адаптивный отбор и эволюция, свойственные культивируемым клеткам растений, позволяют считать, что они являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока еще мало изучены. Однако знать их очень важно, потому что культивируемые клетки высших растений широко используются в фундаментальных исследованиях и в практике.
На основе культивируемых клеток и тканей растений созданы технологии для промышленности, медицины и сельского хозяйства. Углубление знаний биологии культивируемых растительных клеток обязательно для дальнейшего прогресса в разработках новых, перспективных для практики технологий.
В своей работе я поставила перед собой цель: изучить особенности применения растительных клеток в биотехнологии и их перспективы развития. В связи с этим я поставила следующие задачи:

1. Изучить историю развития метода культуры клеток, тканей и органов растений;
2. Изучить культуры растительных клеток, применяемых в биотехнологии и изучить их особенности;
3. Узнать какие биологически активные вещества можно получать с помощью культур растительных клеток;
4. Определить преимущества получения целевых продуктов с использованием культур клеток.

Растительные клетки. Основные понятия

Время генерации клетки – интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями.

Время удвоения популяции — интервал времени, за который число клеток в популяциях увеличивается вдвое.

Дедифференциация — переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации.
Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между дочерними клетками, а также между материнскими и дочерними клетками.

Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее их от других.

Изолированный протопласт – растительная клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или механическим способом.

Инокулюм (трансплант) – часть суспензионной (каллусной) культуры, используемая для пересадки в свежую среду.

Каллус – ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений.

Клеточная селекция – метод выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.

Клон – культура, возникшая из одной клетки.

Культура каллусных тканей – выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов растений.

Суспензионная культура – выращивание отдельных клеток или небольших групп их во взвешенном состоянии в жидкой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание.

Культура эксплантов – инкубация в стерильных условиях на питательных средах, либо вызывающих, либо не вызывающих пролиферацию сегментов, изолированных из разных органов растений.

Линия – культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая характерные маркерные признаки.

Популяция клеток – совокупность культивируемых клеток.

Редифференциация – переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно.

Ростовой цикл – рост популяции клеток в цикле периодического выращивания. Фазы ростового цикла: латентная, экспоненциальная, замедления роста, стационарная, деградации.
Субкультивирование – перенос клеток в другой культуральный сосуд на свежую питательную среду.

Цикл выращивания – период от помещения инокулюма или трансплантанта в свежую среду до последующего субкультивирования.

Штамм – культура, возникшая после первого субкультивирования. Состоит из многих клеточных линий, возникших из клеток, присутствующих в первичной культуре.

Эксплант – фрагмент ткани или органа, инкубируемый самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.

Растительные клетки. История развития метода культуры клеток, тканей и органов растений
Период с 1892 по 1902г можно считать предысторией развития метода культуры клеток и тканей растений. Первым исследователем был Карл Рехингер (1893). Он выращивал тонкие срезы корня свеклы и одуванчика и сегменты стебля тополя на песке с применением водопроводной воды, без стерильных условий. Эти исследования показали, что каллус образуется при толщине среза не менее 1,5 мм. Еще в 19 веке Х. Фёхтинг провел ряд экспериментов, доказывающих тотипотентность клетки. При этом убедительно была показана полярность как органов, так и клеток.
Основы экспериментальной эмбриологии растений были заложены исследованиями Моссарта (1902), который наблюдал набухание завязей некоторых растений после обработки их спорами Licopodium, нежизнеспособными поллиниями и водными экстрактами пыльцы. В связи с этим было высказано предположение, что пыльцевая трубка не только обеспечивает передвижение спермиев к яйцеклетке, но и переносит в завязь ауксины, стимулирующие ее рост.
Габерландт в 1902 году также выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения, которая впоследствии была подтверждена экспериментально. Ряд ученых, в том числе и его ученики, последовали его примеру и получили отрицательные результаты. Некоторые на основании этого усомнились в гипотезе тотипотентности растительных клеток. Исследования Габерландта с фотосинтезирующими клетками были неудачны, что привело к потере интереса к культивированию тканей и клеток растений. Однако они все же положили начало поиску адекватных питательных смесей и условий, необходимых для поддержания роста органов, тканей и клеток растений.
Толчком к возобновлению работ послужили исследования Гаррисона, проведенные в 1904 — 1907 гг. Он вырастил нейробласты лягушки в лимфатической жидкости, доказав возможность выращивания in vitro изолированных клеток. Большое влияние на направление дальнейших работ с растительными клетками оказали работы зоологов Карреля и Барроуза (1911).
Французский ученый Мольяр уже в 1921 культивировал сегменты корня и гипокотиля молодых побегов редьки. Они были способны к росту в условиях культуры, но при этом не происходило формирования новых тканей.
В 1922 г. один из учеников Рехингера — Коттэ начал эксперименты с лишенными пигментов меристематическими тканями — изолированными кончиками корней, и добился успеха. Практически одновременно и независимо от Коттэ Роббинс подобрал состав питательной среды, обеспечивающий в культуре рост апикальной меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало культивированию изолированных органов растений на питательных средах. Не всегда эти исследования были успешны. Под влиянием работ Карреля и Барроуза в 1927 году Прат начал культивировать клетки растений на средах с добавками растительных экстрактов. Результаты его экспериментов были отрицательны, так как он избрал неудачные объекты для исследований.
Начало длительным и удачным исследованиям по культивированию клеток и тканей растений положили работы американского исследователя Ф. Уайта и француза Р. Готре. Они показали, что изолированные органы и ткани могут расти в культуре неограниченно долгое время, если их пересаживать на свежую питательную среду. Такую же способность наблюдал Ф. Уайт для клеток опухолевого происхождения. Результаты чужих и собственных экспериментов Уайт обобщил в монографии «Культура растительных тканей», которая была переведена на русский язык и издана в СССР в 1949 году.
Период 1940 — 1960 гг. значительно расширил список видов, выращиваемых in vitro. В монографию Готре, вышедшую в 1959 г., включено уже 142 вида. Были разработаны составы питательных сред, изучено значение микро- и макроэлементов для поддержания нормальной ростовой активности тканей, определено влияние витаминов и стимуляторов роста. Проводились работы по выявлению значения различных натуральных экстрактов для поддержания неорганизованного клеточного роста, а также для стимуляции органогенеза. Изучением этих вопросов занимались такие ученые, как Р. Хеллер, И. Нич, Ф. Скуг, Ф. Стевард, Р. Г. Бутенко. В это же время разработаны методы получения и выращивания клеточных суспензий, а также культивирования отдельной клетки, деление которой индуцируется с помощью ткани-няньки.
В 1960 — 1975 гг. положено начало методу получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитических и целлюлолитических ферментов. Основоположник этого метода — Э. Коккинг. Начиная с 1976 г., разработывались методы электрослияния протопластов и селекции гибридных клеток, культивирования гаплоидных клеток и получения новых форм и сортов сельскохозяйственных растений. Удалось создать системы иммобилизованных клеток для получения различных химических соединений и их биотрансформации. Ведутся работы по переносу генов в растительные клетки и получению трансгенных растений.

Растительные клетки. Основные направления и сферы применения культуры клеток
Культуры клеток высших растений имеют две сферы применения:
1.Изучение биологии клетки, существующей вне организма, обуславливает ведущую роль клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений. Популяциям растительных клеток присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференцированной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции идет размножение клеток, фенотип и генотип которых соответствуют данным условиям выращивания, следовательно, популяция эволюционирует. Отличия культивируемых клеток от клеток организма, часто специально усиленные созданием биохимических мутантов, гибридных или трансформированных клеток, помогают глубже проникнуть в механизм процессов, происходящих в растениях. Все это позволяет считать, что культуры клеток являются новой экспериментально созданной биологической системой. Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения.
2. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:
1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения:
традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);
синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу;
культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, изомеризации). В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений других видов.
2. Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.
3. Получение безвирусных растений.
4. Эмбриокультура и оплодотворение in vitro часто применяются для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша, для получения растений после отдаленной гибридизации. При этом оплодотворенная яйцеклетка вырезается из завязи с небольшой частью ткани перикарпа и помещается на питательную среду. В таких культурах можно также наблюдать стадии развития зародыша.
5. Антерные культуры – культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.
6. Клеточный мутагенез и селекция. Тканевые культуры могут производить регенеранты, фенотипически и генотипически отличающиеся от исходного материала в результате сомаклонального варьирования. При этом в некоторых случаях можно обойтись без мутагенной обработки.
7. Криоконсервация и другие методы сохранения генофонда.
8. Иммобилизация растительных клеток.
9. Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.
10.Конструирование клеток путем введения различных клеточных оганелл.
11.Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.
12. Изучение системы «хозяин – паразит» с использованием вирусов, бактерий, грибов и насекомых).

Растительные клетки. Каллусные культуры
В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности. Тотипотентность (от лат. totus — весь, целый и potentia — сила) — свойство клеток реализовать генетическую информацию ядра, обеспечивающую их дифференцировку, а также развитие до целого организма. Благодаря этому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования.

Культура растительной ткани позволяет получить многочисленные популяции в сравнительно короткое время и в ограниченном пространстве. Клетки в условиях in vitro лишаются очень многих важных взаимодействий, которые определяют их судьбу и дифференциацию в целом организме. В определенных пределах дифференциация культивируемых клеток поддается контролю со стороны экспериментатора.
Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус.
Каллусная ткань — один из видов клеточной дифференцировки, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения.
У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время. Эта ткань защищает место ранения, может накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или регенерации утраченного органа.
Значительно реже культивируют клетки опухолей растений разного происхождения. Культуры опухолевых клеток мало отличаются внешне и по морфологии при культивировании от каллусных клеток. Основным различием между ними служит гормононезависимость опухолевых клеток, таким образом, они могут расти на питательных средах без добавок фитогормонов, но опухолевые клетки не способны дать начало нормально организованным структурам (корни, побеги и т.п.) и часто образуют тератомы (уродливые органоподобные структуры), нормальное развитие которых дальше не происходит.
Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести гормононезависимость. Природа такой гормонозависимости к одному обоим гормонам (ауксину и цитокинину), может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормононезависимость клетки). При генетической гормононезависимости каллусные клетки ведут себя как опухолевые, при эпигенетической они теряют признак гормононезависимости в ряду превращений клетка-растение-клетка, что является доказательством негенетической природы такой приобретенной гормононезависимости.

Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших растений — корней, листьев, стеблей, пыльников, зародышей (экспланты) помещают на искусственную среду, содержащую фитогормоны (ауксины, цитокинины), в пробирки, колбы, чашки Петри (in vitro). В качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолилмасляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 — 10 мг / л, в зависимости от вида экспланта. Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий. Для этого с помощью растворов, содержащих активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экспланты, тщательно отмывая их затем от употребляемого раствора стерильной водой. Стерилизуют в автоклаве или фильтрованием через ультрафильтры питательную среду. В автоклаве при давлении 2атмосферы в течение 1 часа или сухим паром в шкафах при 160 градусах в течение 1,5 часов стерилизуют посуду, инструменты, материалы, необходимые для работы. Манипуляции с культурами проводят в боксах микробиологического типа, облучаемых перед работой УФ-лучами, или в ламинар-боксах, где асептика достигается постоянной подачей стерильного воздуха в рабочий объем.

Особенности дедифференцировки клеток экспланта и каллусогенеза зависят от эпигенетических характеристик составляющих его тканей. Клетки тканей запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла листа и других специализированных тканей, эксплантированных на питательную среду, содержащую минеральные соли, источники углерода, витамины и гормоноподобные вещества, должны дедифференцироваться, т. е. потерять структуры, характерные для их специфических функций в растении и вернуться к состоянию делящейся клетки.
На рис. 1 изображены фазы клеточного цикла и показано, в каких из них клетки могут выйти из цикла деления (митотического цикла) и перейти в дифференцированное состояние и соответственно вернуться в цикл при дедифференцировке и индукции их к делению. В большинстве случаев клетки переходят к специализации из фазы G1, предшествующей S-фазе, в которой происходит центральное событие в делении клетки – синтез ДНК, специализированные клетки возникают редко в результате выхода клеток из цикла деления после репликации ДНК, в G2-фазе.

При изучении механизмов дедифференцировки, действия гормонов и других факторов, индуцирующих деление, небезразлично, в какой фазе клеточного цикла данная клетка перешла к дифференцировке. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани, так как некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации илиэпигенетически наследуемые признаки.
В клетках экспланта, состоящего из неделящихся, специализированных клеток, в самом начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматическими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к процессу деления. Для разделения этих процессов можно рекомендовать прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в течение 306 суток. Это позволяет исключить не только изменения, связанные с травмой, но и возможное неконтролируемое влияние эндогенных гормонов экспланта на изучаемые процессы. При этом становится ясной роль фитогормонов группы ауксинов и цитокининов, дедифференцировки специализированных клеток поддержании каллусных клеток в делящемся состоянии, приводящем к образованию первичного каллуса. При этом наблюдаются сложные взаимодействия между фитогормонами. Присутствие в среде одного ауксина определяет переход специализированной клетки из покоящейся фазы Gо к вступлению в S-фазу клеточного цикла.

Однако для завершения фазы синтеза ядерной ДНК, синтеза белков, стимулирующих переход клеток к митозу и цитокинезу, необходимо добавление к середе кинетина или другого цитокинина.

В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех форм РНК, исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменении в активности генов и белкового аппарата клеток при дедифференцировке.
Образование каллуса не во всех случаях связанно с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Примером каллуса, не связанного с травмой, является каллусогенез, наблюдающийся в культуре изолированного пыльника. Образование каллуса при эксплантировании фрагмента ткани и в условиях in vitro отклоняется в ряде случаев от нормального процесса микроспорогенеза, ее ядро индуцируется к повторным делениям, а сама клетка превращается в каллусную. Образование каллуса при эксплантировании в условиях in vitro свойственно двудольным и однодольным покрытосеменным и голосеменным растениям, папоротникам, мхам и печеночникам.
Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4-6 недель, переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Размер экспланта (переносимого кусочка) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно колеблется от 60 до 100 мг массы ткани на 30-40 мл питательной среды.
Резюмируя, можно отметить, что техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную, пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интактного растения. Клетки различно дифференцированные (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу дедифференциации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус.
В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.

Растительные клетки. Морфофизиологическая характеристика каллусных клеток. Твердофазный способ культивирования.
Нормальные клетки в культуре могут существовать в двух видах: в виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой питательной среды в виде каллуса. Поверхностное культивирование осуществляют на твердых питательных средах, содержащих гелеобразующий компонент, чаще всего Агар-агар как наиболее близкий по природе субстрат растительного происхождения. Такая среда имеет вид плотного геля, и каллусные клетки находятся на ее поверхности. Поверхностное культивирование также проводят на дисках из полиуретана, на мостиках из фильтровальной бумаги, полупогруженных в жидкую питательную среду. Можно также использовать комочки ваты, пропитанные питательной средой, которые сверху покрываются кусочком фильтровальной бумаги.
Твердофазный способ культивирования чаще проводят в лабораторных условиях для первичного получения изолированных растительных культур, предварительной оценки культур в качестве возможных продуцентов БАВ, а также для выращивания посевного материала. За 4-6 недель среда истощается, что определяет необходимость производить пересев. В противном случае ткани могут погибнуть.
Основными компонентами питательных сред для культуры тканей и клеток растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, экстракты из разных органов растения).

В таблице №2 представлен состав наиболее часто используемых питательных сред.
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным.

В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают:
— рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;
— средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;
— плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. Как правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.
В цикле выращивания каллусной ткани клетки после ряда делений приступают к росту растяжением, дифференцируются как зрелая каллусная ткань и деградируют.

Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллусных клеток, первичный каллус переносят на свежую питательную среду через 28 — 30 дней, то есть проводят пассирование или субкультивирование каллусной ткани.
Неорганизованно растущая каллусная ткань характеризуется тремя типами клеток: мелкими, средними и крупными. При пассировании ткани на среду, содержащую индукторы органогенеза, мелкие клетки приступают к делению и формируют меристематические очаги. Деление клеток меристематического очага приводит либо к формированию почек и последующему развитию из них побегов (геммогенез), либо к ризогенезу. Поэтому различают морфогенный и ризогенный каллус.
Каллусы с высоким морфогенетическим потенциалом обычно матовые, компактные, структурированные, имеют зеленые хлорофиллсодержащие участки, которые представляют собой зоны морфогенеза. Впоследствии там формируются побеги или растения-регенеранты. В культуре также встречаются каллусы рыхлые, не имеющие глобулярного характера. Такие каллусы либо совсем не способны к органогенезу, либо формируют только корни. Появление корней свидетельствует о сдвиге гормонального баланса в сторону ауксинов, что препятствует образованию побегов. Эти каллусы могут остаться ризогенными, и регенерировать из них растения не удастся. Неморфогенные каллусы могут быть переведены в суспензионную культуру для получения вторичных метаболитов.
Химический состав каллусной ткани и ткани органа, из которого она получена, как правило, различаются. (таб. №3)

Каллусные ткани, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, из них получают суспензии клеток, культивируемых в жидкой питательной среде, для регенерации растений.

Глубинное культивирование клеток растений в жидкой питательной среде. Суспензионные культуры
Суспензионные культуры — отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.
Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.
Отдельные клетки, небольшие группы или достаточно крупные агрегаты (более 50 клеток) выращивают во взвешенном состоянии в жидкой среде. Применяют разные аппараты и способы поддержания их в таком состоянии. Начальный момент получения суспензионной, клеточной культуры является событием рандомическим. Это означает, что только клетки, которые по ряду причин способны к перестройке метаболизма и размножению с высоким коэффициентом в данных конкретных условиях суспензионного культивирования, образуют «хорошие» линии. Признаком «хорошей» линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования.

Морфологические характеристики такой линии:

• высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);
• морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);
• отсутствие трахеидоподобных элементов.

Преимущества выращивания клеточных суспензий в жидкой питательной среде перед выращиванием каллусных тканей поверхностным способом:

• Легче и более воспроизводимо влияние на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами;
• Более удобно для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов (изучение индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.)

Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на качалке, имеющей скорость перемешивания 100 — 120 об/мин. При первом переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и крупные агрегаты, фильтруя через 1 — 2 слоя марли, нейлоновые сита, шприц с соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной культуры необходимо 2 — 3 г свежей массы каллусной культуры на 60 — 100 мл жидкой питательной среды. Однако для каждой линии культуры клеток существует минимальный объем инокулята, при меньшем размере которого культура не растет.

Растительные клетки. Рост суспензионных культур клеток можно оценивать по одному или нескольким следующим параметрам:
1. Объем осажденных клеток (ООК). Переносят небольшой объем суспензионной культуры в мерную пробирку объемом 15 мл, лучше всего коническую. Центрифугируют 5 минут при 200 g. ООК — величина, которую составляет объем осадка от объема суспензии, обычно в %.
2. Число клеток. Подсчитывается в камере Фукса-Розенталя.
3. Сырая и сухая масса. Суспензия клеток фильтруется через смоченный и взвешенный фильтр, вложенный в воронку Бюхнера под слабым вакуумом. Клетки промывают дистиллированной водой, оттягивают воду под вакуумом и взвешивают снова вместе с фильтром. Сухая масса – определяется аналогично, но взвешивается сухой фильтр, а клетки сушат вместе с фильтром в термостате при 60оС до постоянной массы.
4. Содержание белка. Для определения белка клетки собирают на фильтре из стекловолокна, дважды промывают кипящим раствором 70% этанола, сушат ацетоном, гидролизуют 1М NaOH при температуре 85оС полтора часа. Затем фильтруют и определяют белок по Лоури.
5. Проводимость среды. Определяют с помощью кондуктометра. Как правило, она обратно пропорциональна свежей массе клеток.
6. Жизнеспособность клеток. Оценивают, изучая движение цитоплазмы под микроскопом, а также с помощью прижизненных красителей (флюоресцеиндиацетат, соли тетразолия, синий Эванса). Перед использованием подбирают рН инкубационного буфера, концентрацию красителя, время инкубации, строят калибровочные кривые для смеси живых и убитых клеток.

По полученным данным строят ростовые кривые, которые имеют S-образную форму и состоят из нескольких участков: 1- латентная, или лаг-фаза, где видимый рост не наблюдается ни по одному из критериев; 2 — экспоненциальная, рост с ускорением; 3 — линейная, где скорость роста постоянна; 4 — фаза замедленного роста; 5 — стационарная фаза; 6 — фаза деградации клеток.
Реальная ростовая кривая может несколько отличаться от модельной. На форму ростовых кривых влияют и генетическая характеристика популяции (вид растения), и количество инокулята, и условия выращивания (состав среды, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания).

Необходимо отметить, что ростовые кривые для разных критериев не идентичны. Дисбаланс между скоростями клеточного размножения (число клеток), синтеза структурных элементов клетки (сухая масса) и увеличения объема и содержания вакуолей (сырая масса) отражает специфику онтогенеза высшего растения.
Для глубинного культивирования растительных клеток применимы способы, разработанные в микробиологии. Испльзуют метод непрерывного культивирования в ферментерах (биореакторах) различной конструкции, имеющих конструктивные особенности, которые учитывают специфику растительных клеток. Метод основан на поддержании баланса между разбавлением среды и удалением части суспензии.
Если в культуральную систему периодически добавлять свежую среду, то деление клеток может поддерживаться неограниченно долго. Это и послужило основой для создания непрерывного культивирования.

Различают два вида систем культивирования: открытую (проточные) и закрытую (полупроточные).
Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания. В таком режиме ферментеры могут работать в течение нескольких месяцев.
Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеточной массы. В таком режиме ферментеры могут работать в течение нескольких лет.
Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т.д. Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования. При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость.

Растительные клетки. Глубинное культивирование в ферментерах имеет ряд преимуществ по сравнению с твердофазным статическим способом:

• Автоматически поддерживаются все необходимые параметры: температура, pH среды, степень аэрации, скорость работы мешалки и т.п.
• Постоянный контроль содержания в культуральной среде основных элементов питания;
• Культуральная система периодически пополняется свежей питательной средой;
• Постоянно осуществляется микробиологический контроль с целью предотвращения инфицирования и гибели культур;
• Контроль активности роста и деления клеток;
• Контроль образования БАВ.

Для культивирования суспензий в производственных масштабах применяется аппаратура, разработанная для микробиологической промышленности, однако исследования последних лет показали, что растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования. Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий и грибов, кроме того, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Если в начале экспоненциальной фазы роста они мелкие и плотные, то в стационарной фазе роста они сильно увеличиваются в размерах и вакуолизируются. Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. В то же время клетки растений, крупные и тяжелые, требуют эффективного перемешивания. Оседание их приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток. Для культуры клеток женьшеня отрицательное влияние механического стресса при выращивании в ферментере с турбинными мешалками сказывалось на жизнеспособности клеток уже при скоростях мешалок свыше 100—350 об/мин, это отрицательно влияло на синтез ими антрахинонов. Устойчивость штамма к механическому стрессу является важным требованием к культуре и трудной задачей для исследователей.

Мягкое перемешивание и аэрацию обеспечивает пневматический способ перемешивания потоком сжатого стерильного воздуха, подаваемого в ферментер с восходящим током воздуха. К сожалению, и этот способ имеет свой недостаток, потому что в культуральной среде возникает избыток воздуха, приводящий к кислородному голоданию. От концентрации кислорода в среде зависят рост и вторичный метаболизм клеток. В микробиологических системах изучена взаимозависимость роста биомассы, выхода искомого продукта и снабжения кислородом. Для растений таких данных нет.

Высокая степень аэрации может оказывать негативное действие на рост и синтез продуктов вторичного метаболизма, поскольку удаляются углекислый газ и летучие соединения. Клетки растений in vitro по сравнению с микроорганизмами имеют низкую интенсивность дыхания, что тоже должно учитываться при конструировании сосуда для культивирования.
Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений — высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, со провождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии. Адгезия (прилипание) клеток друг к другу, на поверхностях культурального сосуда и погруженных в него мешалок и датчиков вызывает затруднения.

В верхней части сосуда постепенно может образовываться пена, состоящая из выделяемых клетками белков и полисахаридов. В процессе культивирования клетки слипаются и часть из них скапливается в этой пене, образуя «корку», или «безе». С увеличением биомассы клеток увеличивается и эта «корка», снижая интенсивность перемешивания, что в конце концов может привести культуру к гибели.
Клетки растений обладают меньшей физиологической и метаболической активностью по сравнению с микроорганизмами. Время генерации (интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями) растительной клетки в 60—100 раз превосходит время генерации микробной клетки. Пул пролиферирующих клеток не превышает 50—60%, многие клетки быстро прекращают деление и переходят в фазу покоя.
Все эти обстоятельства определяют продолжительный рост популяции клеток при накопительном, или периодическом, выращивании. Поддержание стерильности длительное время также является одной из технических проблем, особенно при непрерывном культивировании.

Однако периодическое, или накопительное, культивирование — это самый простой способ выращивания клеток, являющийся пока традиционным. Суспензионные культуры используют для промышленного получения вторичных метаболитов. Вещества, продуцируемые растительными клетками используются в медицине, парфюмерной промышленности, растениеводстве и других отраслях промышленности. К ним относятся: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, пигменты, антиканцерогены, пептиды (ингибиторы фитовирусов).

В настоящее время в разных странах около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения экономически важных веществ, среди них — женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, белладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, мак снотворный и др.
Получение вторичных метаболитов имеет свои особенности. Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной фазе. Знание таких закономерностей позволяет регулировать процессы получения ценных веществ. Правильное сочетание компонентов среды, двухэтапное культивирование клеток на средах для «роста» и для «продукции» может увеличить количество продукта в клеточной культуре, полученной из растения, способного к данным синтезам.

Растительные клетки. Культивирование отдельных клеток
Источниками отдельных клеток являются суспензии, растущие в жидкой питательной среде, мацерация тканей растений, изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки.
Отдельные клетки культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Кроме того, культивирование отдельных клеток позволяет изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани. Отдельные клетки также важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Обычно в такие клетки вводят маркерные гены, которые позволяют осуществлять селекцию.
Кроме того, отдельные клетки могут служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке. Например, для изучения фотодыхания можно сравнивать процесс фотосинтеза на уровне отдельных клеток мезофилла листа и целой ткани.
Отдельные клетки могут быть изолированы из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюориметра с сортером или путем последовательных разбавлений.
Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки».
Клетку изолируют при помощи микроманипулятора из рыхлого каллуса непосредственно на кусочек фильтра размером 8 * 8 мм, помещенный на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка. Каллус должен находится в фазе активного роста. Можно также в качестве «няньки» использовать каллусную ткань другого растения родственного вида. В этом случае клетки растут и делятся. По мере старения каллуса – няньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус. Когда ткань из клетки достигает размеров 0,5 – 1 мм, то ее можно высаживать непосредственно на питательную среду.
Проводились также эксперименты по высаживанию клетки непосредственно на агаризованную среду, но обязательно рядом с фильтром, который в течение нескольких дней контактировал с молодой, интенсивно растущей каллусной тканью. Поскольку эти работы показали, что постоянный контакт клетки через фильтр с каллусной массой не является обязательным для деления клетки, то было предложено использовать старую культуральную среду для стимуляции одиночной клетки к делению.
Можно также использовать метод «кормящего слоя». Для этого берут суспензию клеток того же вида, что и одиночная клетка, или близкого вида. Клеточная суспензия должна находиться в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла. В 1959 году Бергман предложил фильтровать суспензионную культуру (в его экспериментах это были табак и фасоль) стерильно через один слой батиста (ячейки 0,3 * 0,1 мм). В результате получали суспензию, на 90% состоящую из отдельных клеток. Эту суспензию смешивали с агаризованной питательной средой того же состава, что использовался при культивировании суспензии (среда содержала 0,6% агара). Смесь разливали тонким слоем (1 мм) в чашки Петри. Агар разделял клетки, но не препятствовал обмену химическими сигналами между ними, а толщина слоя позволяла смотреть за их поведением под микроскопом.
Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, например, среды Као и Михайлюка. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен был минимальным (микрокапли объемом до 20 мкл).
Все эти способы культивирования позволяют клетке «ощущать» фактор кондиционирования. Он либо вырабатывается в достаточном количестве клетками «кормящего слоя», «ткани – няньки», либо содержится в суспензии, где ранее культивировались клетки, либо не теряется в большом объеме среды. Таким образом, фактор, вызывающий деление клеток, вырабатывается самими клетками, но в небольшом количестве. И только увеличивая число клеток, вырабатывающих этот фактор, чтобы он не рассеивался в больших объемах питательной среды, или же уменьшая объем среды, в котором будет выращиваться клетка, можно заставить ее делиться.

Растительные клетки. Культура растительных клеток как источник лекарственных веществ
Природные запасы лекарственных растений уменьшаются, а синтез БАВ либо не осуществлен, либо нерентабелен. Поэтому технология получения биомассы на основе культуры клеток приобретает большое значение для производства лекарственных средств.

Преимущества использования клеточных культур:

• Решается проблема дефицита исходного сырья, особенно ценных исчезающих видов, не поддающихся плантационному культивированию;
• Возможно получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, тяжелых металлов и пр.;
• Имеется возможность получения новых веществ, не синтезируемых соответствующим целевым растением;
• Возможно управление биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и другими способами;
• Имеется возможность индустриализации и удешевления производства некоторых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог.

Вместе с тем, развитие производства БАВ из изолированных клеток культур в промышленных масштабах сдерживается рядом причин. Некоторые культуры изолированных клеток и тканей либо не синтезируют БАВ, характерные для соответствующего целого растения, либо вырабатывают их значительно меньше. В сравнении с микроорганизмами растительные клетки растут значительно медленнее, время их удвоения в среднем в 20 раз больше, чем клеток микроорганизмов.
Вследствие длительности производства высок риск инфекций и гибели культур. Кроме того, большие объемы суспензионных культур растительных клеток состоят как из единичных клеток, так и агрегатов различного размера, которые не идентичны, что усложняет процесс производства БАВ. Вторичные метаболиты многих растительных культур не выделяются в питательную среду, что создает трудности их экстрагирования. Из-за больших размеров растительные клетки очень чувствительны к перемешиванию и снабжению кислородом. Себестоимость производства лекарственных средств на основе культуры изолированных растительных клеток достаточно высока. Промышленный выпуск такой продукции рентабелен лишь для особо ценных БАВ, стоимость которых на мировом рынке очень высока, сырье мало доступно, синтез пока не осуществлен и продуктивность культур достаточно высока.
В настоящее время получено около 30 видов различных изолированных клеточных культур лекарственных растений, продуцирующих БАВ либо на уровне соответствующего интактного растения, либо в большем количестве.
Первый отечественный биопродукт из культуры изолированных клеток – настойка «Биоженьшень» — разработан в лаборатории культуры тканей Института физиологии растений РАН, под руководством Р.Г. Бутенко. Препарат получен на основе высокопродуктивного клеточного штамма культуры клеток женьшеня и используется для изготовления лосьонов, кремов, а также тонизирующих напитков. Комплекс гинзенозидов (сапонинов женьшеня), выделяемый из культуры тканей, предлагается в качестве противоэпилептического средства.
Культивируемые in vitro клетки раувольфии змеиной являются перспективным источником гипотензивных и противоаритмических индольных алкалоидов. Методами клеточной селекции с использованием химических мутагенов и оптимизации условий выращивания получен высокопродуктивный штамм, накапливающий противоаритмический алкалоид аймалин, содержание которого составляет около 50% от суммы алкалоидов, синтезируемых культурой.
Получены изолированные клеточные культуры из различных видов барбариса, а также василистника малого. Суспензионная клеточная культура василистника малого продуцирует берберин – растительный антибиотик и противоопухолевое средство. При этом более 80% синтезируемых тканями алкалоидов секретируются в культуральную жидкость. В Японии налажено биотехнологическое производство противоопухолевого алкалоида берберина из культуры клеток коптиса японского, а также производство нафтохинонового пигмента шиконина – природного антибиотика широкого спектра действия из культуры клеток Воробейника. На основе шиконина российские ученые разработали мазь «Эритромицин», которая обладает антимикробной активностью в отношении антибиотико-резистентных микроорганизмов, многих патогенных бактерий, а также грибов.
Перспектива использования культуры тканей тиса обыкновенного связана с возможностью получения таксола – вещества, обладающего противоопухолевой активностью. Для лечения одного больного в течение года требуется 120-130 г сухой коры нативного растения, сырьевые запасы которого истощаются. Национальный институт рака США выделил около 1 млн долларов для разработки экономически целесообразного способа получения таксола из культуры клеток.
Активно продолжаются работы с культурой клеток барвинка розового, продуцирующего противораковые алкалоиды. Стоимость субстанции Винкристина на мировом рынке достигает 30 тыс. долларов за 1 кг, Винбластина – около 20 тыс. за кг.
В Германии разработали способ получения кислоты розмариновой из культуры клеток каллуса. Кислота розмариновая – вещество, обладющее противоопухолевой активностью, и природный антибиотик широкого спектра действия. Из культуры клеток табака получен убихинон 10. На основе убихинона получают препарат для лечения инсультов и купирования спаечных процессов.

Растительные клетки. Заключение
Выполнив данную курсовую работу я смогла достичь своей цели и разобрать следующие вопросы:
История развития метода культуры растительных клеток;
Культуры растительных клеток, применяемых в биотехнологии, их особенности;
Получение биологически активных веществ с помощью культур растительных клеток;
Преимущества и недостатки использования культур клеток.
Метод культуры клеток высших растений лежит в основе изучения биологии клетки. Популяциям растительных клеток, выращиваемым в искусственных условиях, присущи специфические особенности, знание которых очень важно, потому что культивируемые клетки высших растений широко используются в фундаментальных исследованиях и в практике.
На основе культивируемых клеток и тканей растений созданы технологии для промышленности, сельского хозяйства, медицины и фармации. Углубление знаний биологии культивируемых растительных клеток обязательно для дальнейшего прогресса в разработках новых, перспективных для практики технологий.

Природные запасы лекарственных растений с каждым годом все уменьшаются, а синтез БАВ либо не осуществлен, либо нерентабелен. Поэтому технология получения биомассы на основе культуры клеток приобретает большое значение для производства лекарственных средств и имеет свои преимущества:
Решается проблема дефицита исходного сырья;
Получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, тяжелых металлов и пр.;
Получение новых веществ, не синтезируемых соответствующим целевым растением;
Управление биосинтезом целевых продуктов;
Индустриализация и удешевление производства некоторых БАВ.

Список используемой литературы
1. Биотехнология. Учебное пособие для вузов. Книга 3: клеточная инженерия/Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин и др. Под редакцией Егорова. М.: Высшая школа, 1987-127стр.
2. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева, Л.С. Белова. – Ростов н/Д.: Феникс; Томск: издательство НТЛ, 2006. – 256с.
3. Биотехнология: учебное пособиедля студентов высших учебных заведений/ Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева; под редакцией А.В. Катлинского. – 2ое издание. М.: издательский центр «Академия», 2007. – 256с.
4. Основы биотехнологии. Для студентов институтов; аспирантов и практических работников. Издательская фирма «Наука» СПБ 1995г.с., 600 стр.166 ил.
5. Валиханова Г. Ж. Биотехнология растений. Алматы: Конжык, 1996. 272 с.