Определение специфической активности пробиотиков (ОФС.1.7.2.0009.15)

Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОФС.1.7.2.0009.15 Определение специфической активности пробиотиков 

ОФС вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы испытания специфической активности пробиотических производственных штаммов и пробиотиков на их основе, которая определяется количеством жизнеспособных бактерий и активностью кислотообразования или их антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам.

Таким образом, описанные в настоящей статье микробиологические методы позволяют определить следующие показатели специфической активности испытуемого препарата или штамма:

• — количество жизнеспособных бактерий в 1 дозе иммунобиологического лекарственного препарата (ИЛП) (раздел 1);
• — активность кислотообразования (раздел 2);
• — антагонистическая активность (раздел 3).

ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Требования к специфической активности испытуемого препарата касаются определения количества живых бактерий в 1 дозе лекарственного средства, кислотообразующей активности штаммов-продуцентов, входящих в лакто- и бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения, и определения уровня антагонистической активности испытуемого препарата.

Контроль испытуемого препарата по показателю «Количество жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства» является обязательным при отработке новых технологий производства лекарственного средства, предварительном и сертификационном контроле, оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности. Определение количества живых микроорганизмов в испытуемой дозе проводят методом серийных разведений, при необходимости, с последующим высевом на питательные среды (Человеческая доза – доза испытуемого препарата, указанная на этикетке или в инструкции по медицинскому применению (листке-вкладыше)).

При проведении контроля поликомпонентных или комбинированных пробиотиков необходимо учитывать количество и соотношение всех видов или штаммов, входящих в состав препарата.

Показатель «Активность кислотообразования» является обязательным при контроле штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков, при предварительном и сертификационном контроле, при оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности.

Показатель «Антагонистическая активность» является обязательным при контроле колисодержащих и споровых пробиотиков для медицинского применения и производственных штаммов. Уровень антагонистической активности ИЛП в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов определяют методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов.

Производственные штаммы контролируются не реже 1 раза в год.

Питательные среды, используемые в испытаниях

Для выращивания микроорганизмов, входящих в пробиотики для медицинского применения, используют адекватную для данного вида бактерий и для данной методики питательную среду (если нет других указаний в нормативной документации):

• для лактобактерий – МРС- 2, МРС- 4, МРС- 5, МРС- 1; для ацидофильных лактобактерий – стерильное обезжиренное молоко;
• для бифидобактерий – полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, среду Блаурокка с натрия азидом, МРС-5;
• для кишечной палочки – среду Эндо, мясопептонный агар (МПА), среду Гаузе № 2 агаризованную;
• для энтерококков – МПА, среду № 1;
• для бактерии рода Bacillus – среду Гаузе № 2 агаризованную, МПА, полусинтетическую среду с дрожжевым диализатом.

Питательные среды для проведения испытаний готовят в соответствии с приведенными ниже указаниями. Также могут использоваться эквивалентные коммерчески доступные среды при условии, что они выдерживают испытания на ростовые свойства. Необходимое значение рН питательных сред устанавливают при температуре (25 ± 2) ^оС.

Среда МРС-1

В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:

• марганец сернокислый — 0,05 г
• цистеин солянокислый или L-цистин — 0,10 г
• магний сернокислый — 0,200 г
• калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный — 2,00 г
• аммония цитрат — 2,00 г
• натрия ацетат (натрий уксуснокислый) — 5,00 г
• печеночный экстракт^а) (1:1) — 100,0 мл
• дрожжевой аутолизат^б) с содержанием
• аминного азота (0,15 0,03) % — 50,0 мл
• пептон сухой ферментативный — 10,00 г
• гидролизат обезжиренного молока^в) — 500,0 мл
• полисорбат 80 — 1,00 мл
• глюкоза — 20,00 г

Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл; рН среды (6,4 0,2). Питательную среду разливают в пробирки по 10 , 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (120 ± 2) ^оС в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения готовой стерильной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Примечание.

^а) Приготовление печеночного экстракта с содержанием аминного азота (0,0500,005) %.

• Печень говяжья — 1,0 кг
• Вода очищенная — 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112±5) ^оС в течение (20±1) мин (процесс стерилизации валидируется).

Приготовление: 1,0 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3×3×3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5 – 2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань «миткаль»), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре 120±2 ^оС в течение 15±1 мин. Срок хранения печеночного экстракта при температуре от 2 до 8 ^оС не более 6 мес или не более 3 мес при комнатной температуре.

^б) Приготовление дрожжевого аутолизата с содержанием аминного азота (0,150,03) %.

• Дрожжи хлебопекарные — 1000 г
• Вода питьевая — 4000 мл
• Хлороформ — 40 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин.

^в) Приготовление гидролизата обезжиренного молока по Богданову.

• Молоко коровье пастеризованное, нежирное (рН 6,7±0,1) — 1000 мл
• Панкреатин — 1,0 г
• Хлороформ — 5,0 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин.

Среда МРС-2

• Марганец сернокислый — 0,05 г
• Цистеин солянокислый или L-цистин — 0,10 г
• Магний сернокислый — 0,20 г
• Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный — 2,00 г
• Аммония цитрат — 2,00 г
• Натрия ацетат — 5,00 г
• Печеночный экстракт (1:1) — 100,0 мл
• Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота (0,15 ± 0,03) % — 50,0 мл
• Пептон сухой ферментативный — 10,00 г
• Гидролизат обезжиренного молока — 500,0 мл
• Полисорбат 80 — 1,00 мл
• Глюкоза — 20,00 г

Агар микробиологический — 1,00 г

• Вода очищенная до 1000 мл

Значение рН готовой среды (6,4 0,2). Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре (120 ± 2) ^оС в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Среда МРС-4

В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:

• Марганец сернокислый — 0,05 г
• Цистеин солянокислый или L-цистин — 0,10 г
• Магний сернокислый — 0,200 г
• Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный — 2,00 г
• Аммония цитрат — 2,00 г
• Натрия ацетат — 5,00 г
• Печеночный экстракт (1:1) — 100,0 мл
• Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота (0,15 ± 0,03) % — 50,0 мл
• Пептон сухой ферментативный — 10,00 г
• Гидролизат обезжиренного молока — 500,0 мл
• Полисорбат 80 — 1,00 мл
• Глюкоза — 20,00 г
• Агар микробиологический — 19,0 г

Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл (рН 6,40,2). Питательную среду стерилизуют в автоклаве при температуре (120 ± 2) ^оС в течение (15 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС в стерильных герметичных флаконах или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Среда МРС-5

• Марганец сернокислый — 0,05 г
• Цистеин солянокислый или L-цистин — 0,10 г
• Магний сернокислый — 0,200 г
• Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный — 2,00 г
• Печеночный экстракт (1:1) — 100,0 мл
• Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота (0,15±0,03) % — 50,0 мл
• Пептон сухой ферментативный — 10,00 г
• Гидролизат обезжиренного молока — 500,0 мл
• Полисорбат 80 — 1,00 мл
• Глюкоза — 20,00 г
• Агар микробиологический — 15,0 г
• Вода очищенная — 1000 мл.

Питательную среду (рН 7,0) стерилизуют в автоклаве при температуре (120±2) ^оС в течение (15±1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС в стерильных герметичных контейнерах (флаконах) или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Примечание.

Приготовление обезжиренного стерильного молока рН (6,7±0,3);

показатель кислотности не более 18 °Т:

• Молоко сухое обезжиренное — 80 г
• Вода очищенная — до 1000 мл

Разливают в пробирки по 10 , 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (60±1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения обезжиренного стерильного молока 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Модифицированная печеночная среда Блаурокка

• Печеночная вода (1:2) с содержанием

аминного азота (100 ± 20) мг% — 1000 мл

• Пептон сухой — 10 г
• Натрия хлорид — 5 г
• Лактоза — 10 г
• Цистеин — 0,1 г
• Агар микробиологический — 0,75 г

Устанавливают требуемое значение рН (7,2 ± 0,2) с помощью 20 % раствора натрия гидроксида. Питательные среды разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (60 ± 1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС . После 14 сут хранения перед использованием для снижения содержания растворенного кислорода среду следует однократно регенерировать путем нагревания пробирок на водяной бане при температуре 70 – 80 °С в течение 10 – 15 мин.

Примечание.

Приготовление печеночной воды с содержанием аминного азота (10020) мг %.

• Печень говяжья — 0,5 кг
• Вода очищенная — 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ±1 ) мин (процесс стерилизации валидируется).

0,5 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3×3×3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5 – 2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань «миткаль»), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения не более 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Среда Блаурокка с азидом натрия

• Среда Блаурокка — 1000 мл
• Натрия азид — 0,1 г

Среду перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре (112±5) ^оС в течение (20±1) мин. Срок хранения питательной среды 1 мес при температуре от 2 до 8 ^оС.

Среда Гаузе №2 агаризованная

• Бульон Хоттингера¹⁾ с содержанием аминного азота 700 мг% — 30 мл
• Пептон сухой — 5 г
• Натрия хлорид — 5 г
• Глюкоза — 10 г
• Агар микробиологический — 30 г
• Вода очищенная — до 1000 мл

Примечание.

Приготовление бульона Хоттингера (содержание аминного азота 700 мг%).

• Гидролизат Хоттингера — 24,0 г
• Натрия хлорид — 5,0 г
• Вода очищенная — до 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды в течение 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).

Полусинтетическая среда с дрожжевым диализатом агаризованная

• Марганец хлористый 4-водный или марганец сернокислый — 0,01 г
• Железо(III) сернокислое 7-водное — 0,01 г
• Магний сернокислый 7-водный или

магния хлорид 6-водный — 0,1 г

• Кальция хлорид — 0,08 г
• Пептон сухой — 0,5 г
• Дрожжевой диализат с содержанием азота аминного 150 мг % — 5,0 мл
• Глюкоза — 10,0 г
• Агар микробиологический — 20-30 г
• Вода очищенная — до 1000 мл.

Стерилизация в автоклаве при температуре (112 ± 5) ^оС в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).

Мясопептонный агар (МПА)

• Пептон — 10,0 г
• Натрия хлорид — 5,0 г
• Мясная вода — 300–500 мл
• Агар микробиологический — 13–20 г

В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2–7,4 и добавляют измельченный агар в количестве, зависящем от его качества и назначения среды. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном перемешивании до полного растворения агара. Разливают в пробирки и флаконы, стерилизуют при температуре 120 ^оС в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации среда, остывая, уплотняется.

Срок хранения готовой среды (pH 7,3 ± 0,2) 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Мясопептонный бульон (МПБ)

• Пептон — 10,0 г
• Натрия хлорид — 5,0 г
• Мясная вода — 1000 мл.

В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2–7,4 и разливают в пробирки и флаконы. Стерилизуют при температуре 120 ^оС в течение (20 ± 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 ^оС или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Примечание.

Приготовление мясной воды (1:2).

• Мясо–говядина (фарш) — 500 г
• Вода очищенная — 1000 мл

Стерилизация при температуре 121 ^оС в течение 20 мин. Срок хранения 2 мес при температуре от 2 до 8 ^оС и не более 1 мес при температуре от 18 до 25 ^оС.

Перед испытанием, в случае использования плотной питательной среды, по 10–15 или 20–25 мл расплавленной агаризованной питательной среды (при температуре около 45 ^оС) разливают в стерильные чашки Петри диаметром 9 или 12 см (соответственно), оставляют на горизонтальной поверхности и дают среде застыть. Поверхность агаризованных сред перед посевом подсушивают для удаления конденсационной воды и проверки стерильности. Чашки Петри с питательными средами помещают закрытыми и перевернутыми вверх дном в термостат при температуре (37 1) ^оС на 48 ч. Агар Эндо подсушивают 40 мин в ламинарном шкафу с открытыми крышками.

Раздел 1. Определение количества жизнеспособных бактерий в 1 дозе ИЛП

В настоящем разделе изложены общие принципы определения количества живых бактерий в пробиотиках для медицинского применения методом десятикратных разведений с высевом на плотные питательные среды (метод Коха) и глубинного чашечного метода или в жидкие и полужидкие среды (метод предельных разведений). Результаты количественного определения микроорганизмов выражаются в колониеобразующих единицах (КОЕ).

Отбор и подготовка образцов для анализа

От каждой испытуемой серии препарата пробиотика методом случайной выборки отбирают по 3 испытуемых образца.

Испытания проводят, соблюдая правила асептики.

Каждый образец в отдельности разводят стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида и перемешивают пипеткой 8–10 раз.

Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):

• 1. Лиофилизаты (флаконы) – каждый образец в отдельности ресуспензируют стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида (из расчета 1 мл на 1 дозу) и перемешивают пипеткой 8–10 раз, получая исходное разведение.
  2. Порошки – содержимое пакета (саше) асептически пересыпают в стерильную колбу вместимостью 250 мл, добавляют 100 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин, получая разведение 1:100 (10^-2).
  3. Таблетки – каждый образец в отдельности предварительно растирают в стерильной ступке стерильным пестиком до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз, получая исходное разведение.
  4. Капсулы – каждый образец в отдельности вносят в стерильные пробирки, добавляют 10 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида. Пробирки с капсулами помещают на водяную баню при температуре (39±1)^оС. Через 10–30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10^-1).
  5. Суппозитории–каждый образец в отдельности помещают в стерильные пробирки и добавляют предварительно нагретый до температуры (37 + 1) ^оС стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл в зависимости от величины средней массы суппозитория испытуемой серии (например, при массе 1,1 г добавляют 8,9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, а при массе 2 г – 8 мл физиологического раствора). Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре (39 ± 1) ^оС. Через 10–30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10^-1).

Методика испытания

Испытание проводят методом последовательных десятикратных разведений, соблюдая правила асептики. Для этого 1 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение, разведения 10^-1 или 10^-2) вносят пипеткой в пробирку, содержащую 9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10–15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10^-2 или 10^-3), и затем 1 мл суспензии переносят в следующее разведение. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.

В случае, если образец содержит 1 дозу, 0,5 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение) пипеткой вносят в пробирку, содержащую 4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10–15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10^-1) и 1 мл суспензии переносят в пробирку с 9 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, получая разведение 10^-2. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.

В зависимости от биологических свойств бактерий, входящих в состав испытуемого образца, используют соответствующую методику испытания.

1. Высев на плотные питательные среды

1.1 Метод Коха

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в 1 дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по 2 чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или с помощью стеклянных бус до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации.

Посевы инкубируют при температуре (37 1) ^оС в течение 24–96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизма, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных). При инкубировании в анаэробных или микроаэрофильных условиях чашки Петри с посевами помещают в анаэростат и создают необходимую газовую атмосферу.

Данный метод может быть использован при определении количества живых бактерий каждого вида в поликомпонентных пробиотиках при условии, что бактерии, входящие в состав препарата, образуют визуально различимые по форме и другим признакам колонии.

1.2. Глубинный чашечный метод

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в исследуемом препарате) по 1,0 мл микробной суспензии стерильной пипеткой вместимостью 1,0 мл вносят в чашки Петри диаметром 90 мм (по 2 чашки на каждое разведение). Добавляют 20–25 мл расплавленной и охлажденной до температуры 42,5 ± 2,5 ^оС агаризованной питательной среды, закрывают и быстро осторожно перемешивают вращательно-поступательными движениями, не отрывая дна чашки от поверхности стола и не допуская попадания среды на крышку чашки. После застывания агара чашки Петри переворачивают вверх дном и инкубируют в адекватных условиях при температуре (37 1) ^оС в течение необходимого для данного микроорганизма времени.

Учет результатов

По окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе испытуемого образца. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний.

Пример расчета содержания живых микробных клеток в 1 дозе испытуемого образца:

– из разведения 10^-7 выросло 42 и 45 колоний; среднее арифметическое равно (42+45) : 2 = 43,5;

– из разведения 10^-6 выросло 410 и 450 колоний; среднее арифметическое равно (410+450) : 2 = 430;

– количество живых бактерий в 1 дозе равно:

(43,5 ∙ 10⁷ + 430 ∙ 10⁶ ) : 2 10 = 4325000000 = 4,3 ∙ 10⁹.

Умножают среднюю арифметическую числа колоний на степень разведения и в том случае, если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл, умножают на коэффициент 10 для пересчета на 1,0 мл.

1. Метод предельных разведений с последующим высевом на жидкие и полужидкие питательные среды
   1. Пробирочный метод наиболее вероятных чисел (определение количества живых ацидофильных лактобактерий)

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии от каждого разведения в 2 пробирки с 9 мл стерильного обезжиренного молока. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10^-6 препарата в 0,9 % растворе натрия хлорида соответствует разведению 10^-6 в молоке. Для контроля среды добавляют 4 незасеянные пробирки с молоком. Засеянные и контрольные пробирки инкубируют при температуре (38  1) ⁰С в течение 3–4 сут.

По окончании инкубации определяют количество пробирок со свернувшимся молоком. Из сгустка с культурой готовят мазки и окрашивают по Граму. Если в мазках видны характерные бактерии и отсутствует посторонняя микрофлора, то данное разведение учитывают, как содержащее микроорганизмы данного вида. В случае сквашивания молока в контрольных пробирках и при обнаружении посторонней микрофлоры в мазках, контроль проводят на новой партии среды.

Учет результатов

При подсчете количества живых особей используют таблицу Мак-Креди (табл. 1). Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из 3 цифр: на первое место (слева) ставят цифру, равную числу пробирок со свернувшимся молоком, взятых в том последнем разведении, где молоко свернулось во всех пробирках (например, 2 пробирки разведения 10^-6).

Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком в 2 последующих разведениях (например, в 1 пробирке разведения 10^-7 и в 1 пробирке разведения 10^-8).

Числовая характеристика результата будет 211.

По таблице Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее полученной цифровой характеристике (в нашем случае 13), умножают его на разведение, которому соответствует первая цифра числовой характеристики (в данном примере – 10^-6). Тогда количество живых особей микроорганизмов в 1 дозе составляет 13 ∙ 10⁶ = 1,3 ∙ 10⁷.

Таблица 1. Таблица Мак-Креди, используемая при подсчете количества живых ацидофильных лактобактерий

Числовая характеристика	Наиболее вероятное число микроорганизмов при посеве в 2 параллельные пробирки
200	2,5
201	5,0
202	—
210	6,0
211	13,0
212	20,0
220	25,0
221	70,0

2.2. Пробирочный метод учета колоний в полужидкой среде

Из разведений препарата 10^-6,10^-7,10^-8,10^-9,10^-10 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10^-6 препарата в 0,9 % растворе натрия хлорида соответствует разведению 10^-6 в питательной полужидкой среде.

Посевы инкубируют при температуре (37 1) ^оС в зависимости от вида микроорганизма в течение 1–6 сут. По окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост типичных колоний для данного вида микроорганизмов.

Учет результатов

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в полужидкой питательной среде должно наблюдаться 10-кратное уменьшение количества колоний микроорганизмов.

Количество живых бактерий в дозе испытуемого препарата вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке (объем вносимого материала в 1,0 мл дает коэффициент умножения 1, который не влияет на конечный результат при вычислении).

1. Определение количества живых бактерий в поликомпонентных пробиотиках

3.1 Комбинированный метод (определение количества бифидо- и колибактерий)

Для определения количества живых бактерий в составе препарата пробиотика из соответствующих последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в 0,9 % растворе натрия хлорида (с 10^-1 по 10^-9) проводят высевы на среду Блаурокка с натрия азидом (учет бифидобактерий) и на среду Эндо (учет колибактерий).

Для определения количества бифидобактерий по 1 мл микробной суспензии из разведений 10^-6,10^-7,10^-8,10^-9 высевают в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды Блаурокка с азидом натрия (отмечая разведение, из которого сделан посев). При этом учитывают, что разведение 10^-6 препарата в 0,9 % растворе натрия хлорида соответствует разведению 10^-6 в среде Блаурокка с азидом натрия. Посевы в среде Блаурокка с азидом натрия инкубируют при температуре (38 1) ^оС в течение 4 – 5 сут.

Для определения количества кишечных палочек делают посев по 0,1 мл микробной суспензии из разведений испытуемого образца 10^-5, 10^-6 на чашки Петри со средой Эндо (по 2 чашки от каждого разведения). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды Эндо шпателем Дригальского до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 1) ^оС в течение 18–24 ч.

Учет результатов

В среде Блаурокка с натрия азидом по окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост колоний в виде «гвоздиков». Количество живых бактерий в дозе вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке.

На среде Эндо по окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний. Пример для расчета аналогичен описанному в подразделе 1.

Раздел 2. Активность кислотообразования

Кислотообразующую активность штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков для медицинского применения определяют по титруемой кислотности при культивировании бактерий в адекватной питательной среде. Испытание количественного определения кислотообразующей активности проводят методом кислотно-основного титрования.

Для выращивания бифидобактерий используют полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, для лактобактерий – МРС-1 или стерильное обезжиренное молоко, если нет других указаний в нормативной документации.

Реактивы, используемые в испытании:

• титрованный 0,1 М раствор натрия гидроксида;
• индикатор – 1% раствор фенолфталеин.

Особенности отбора и подготовки образцов для анализа

От каждой испытуемой серии лекарственного средства, независимо от ее объема, методом случайной выборки отбирают по 2 образца. В случае, если испытуемый образец (т.е. таблетка/капсула/суппозиторий) содержит 1 дозу, то в 1 образец объединяют 3 таблетки/капсулы/суппозитория.

Испытания проводят, соблюдая правила асептики.

Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):

1. Лиофилизаты – испытуемый образец (каждый образец в отдельности) разводят стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу препарата и перемешивают пипеткой 8–10 раз.

По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38±1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).

1. Таблетки – каждый образец в отдельности предварительно растирают (асептически) в ступке до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8–10 раз.

По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 ± 1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).

1. Порошки – содержимое саше асептично пересыпают в пробирку, вместимостью 50 мл, содержащую 25 мл питательной среды, и перемешивают. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 ± 1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
2. Капсулы – каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре (39 ± 1) ^оС. Через 20–30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 ± 1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
3. Суппозитории – каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды, адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре (39 ± 1) ^оС. Через 20–30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 ± 1) ^оС и инкубируют в течение 48 – 72 ч (сроки инкубации определяются видом микроорганизма).

Примечание.

После окончания инкубации суспензию в пробирках освобождают от липофильной суппозиторной основы одним из следующих способов:

• сразу после окончания инкубирования при температуре посевов (38 ± 1) ^оС стерильной пипеткой удаляют растопленный верхний слой жира;
• пробирки охлаждают при температуре от 2 до 8 ^оС в течение (20±5)мин, затем застывшую суппозиторную основу снимают асептически пастеркой с загнутым концом или бактериологической петлей.

Методика испытания

Уровень кислотообразования определяют в каждом из 2 образцов.

После окончания инкубации содержимое пробирки перемешивают отдельной пипеткой 8–10 раз. Каждую пробу в объеме 10 мл вносят в отдельную коническую колбу или стакан вместимостью 100 мл.

Штаммы-продуценты, выращенные в стерильном обезжиренном молоке, образуют сгусток. Образовавшийся сгусток разбивают путем тщательного перемешивания (10-12 раз) пипеткой вместимостью 10 мл. После этого 10 мл микробной суспензии переносят из пробирки с культуральной средой в коническую колбу вместимостью 100 мл, содержащую 20 мл воды очищенной. Колбу интенсивно встряхивают для равномерного перемешивания содержимого, затем прибавляют 2–3 капли 1% раствора фенолфталеина.

Полученную суспензию титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления стойкого слабо-розового окрашивания и достижения рН (8,5±0,1) (контролируют потенциометрически), при этом учитывают количество миллилитров 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование.

Учет результатов

Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т) и вычисляют по формуле:

^оТ = А ∙ К ∙10,

где: А – количество миллилитров 0,1М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование 10 мл исследуемой микробной суспензии;

К – поправка к титру 0,1 М раствора натрия гидроксида;

10 – объем микробной суспензии, мл.

Пример расчета: на титрование 10 мл микробной суспензии пошло 10,6 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, где К = 1,03, тогда:

Т = 10,6 ∙ 1,03 ∙ 10 = 109,18 ^оТ

Вычисляют средний показатель из 2 параллельных проб от каждого образца (пробирки) и средний показатель из 2 образцов (пробирок) при условии, если показатель активности кислотообразования каждого из них был не ниже регламентированного.

Раздел 3. Антагонистическая активность

Антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов оценивают как у штаммов-продуцентов, так и у препаратов пробиотиков, полученных на их основе. Определение антагонистической активности штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, проводят с помощью метода отсроченного антагонизма.

При проведении испытания применяют питательную среду, адекватную для данного вида бактерий (если нет других указаний в нормативной документации):

• для лактобактерий и бифидобактерий – среду МРС-5;
• для кишечной палочки и споровых пробиотиков – среду Гаузе № 2.

Тест-штаммы микроорганизмов

Тест-штаммы микроорганизмов, используемые в испытании, приведены в табл. 2. Их получают в лиофилизированном виде (в ампулах) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» (если нет других указаний в нормативной документации) с сертификатом соответствия (паспортом на штамм).

Таблица 2. Тест-штаммы микроорганизмов, используемых в испытаниях по отсроченному антагонизму

Тест-штамм микроорганизма	Номер штамма
Staphylococcus aureus	ATCC 6538 (FDA 209Р)
Escherichia coli	О157
Shigella flexneri	170, 337
Shigella sonnei	5063
Proteus mirabilis	H-237 или 56/10
Proteus vulgaris	177 или 401
Candida albicans	ATCC10231

Восстановление лиофилизированных тест-штаммов микроорганизмов

Ампулы с тест-культурами микроорганизмов вскрывают в асептических условиях в соответствии с инструкцией производителя.

Для восстановления жизнеспособности культуры необходимо не менее двух пересевов на адекватной питательной среде (соответствующей потребностям используемого микроорганизма) с инкубацией в стандартных условиях. Для получения изолированных колоний второй пересев культуры тест-штамма проводят на адекватной плотной питательной среде при инкубации в стандартных условиях.

Температура инкубации посевов бактерий (32,5 ± 2,5) ^оС, грибов (22,5 ± 2,5) ^оС, если нет других указаний в нормативной документации.

По окончании инкубации изучают морфологию выросших колоний, микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, изучают биохимические свойства с использованием тест-систем, разрешенных к использованию. Тест-штамм микроорганизма должен обладать типичными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами в соответствии с представленным сертификатом коллекции.

Тест-штаммы микроорганизмов в лиофилизированном виде хранятся при температуре (6 ± 2) ^оС в течение 24 мес.

Допускается не более 5 пассажей от исходной культуры.

Приготовление тест-штаммов микроорганизмов для испытания Для испытания используют культуры, выращенные в течение (22 ± 2) ч, второго или третьего пассажа, которые инкубируют на адекватной плотной питательной среде в адекватных условиях. Выросшую чистую культуру смывают 0,9 % раствором натрия хлорида с поверхности плотной питательной среды. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.). Доводят концентрацию микробных клеток в полученной суспензии в соответствии со стандартным образцом мутности 5 ОЕ в соответствии с ОФС «Определение концентрации микробных клеток».

Отбор и подготовка образцов для анализа

Методом случайной выборки отбирают образцы от каждой серии препарата. Посевы проводятся в стерильных условиях.

Пробиотические производственные штаммы-продуценты (лиофилизаты) восстанавливают до первоначально высушенного объема (но не менее 10⁷ микробных клеток/мл), добавляя в лиофилизат стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида.

Особенности подготовки испытуемого образца препарата пробиотиков в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):

1. Лиофилизаты разводят стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8–10 раз.
2. Таблетки предварительно растирают в ступке (асептически) до гомогенного состояния дробно добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8–10 раз.
3. Порошки – содержимое пакета (саше) высыпают в пробирку, содержащую 25 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида, и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин.
4. Капсулы содержимое капсулы вносят в пробирку, добавляют 1 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида и перемешивают до гомогенного состояния.
5. Суппозитории вносят в пробирку, добавляют до общего объема 10 мл стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида, предварительно нагретый до температуры (37 + 1) ^оС. Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре (39 ± 1) ^оС. Через 10–30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния и освобождают от жировой основы (как описано выше в разделе 2).

Методика испытания

Полученную суспензию испытуемого образца перемешивают и высевают бактериологической петлей диаметром (3,5+0,5) мм на 6 чашек Петри с питательной средой, проводя по 2 параллельных штриха длиной, равной диаметру чашки.

После инкубирования в течение 48–96 ч при температуре (37 + 1) ^оС в адекватных (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных) условиях в зависимости от вида микроорганизма к выросшей культуре испытуемого образца подсевают культуры тест-штаммов (в соответствии с требованиями нормативной документации). Подсев тест-штаммов производят петлей диаметром (1,75 + 0,25) мм в направлении, перпендикулярном зоне роста изучаемого микроорганизма, и не касаясь его. Чашки Петри перевернутые вверх дном инкубируют при температуре (37 + 1) ^оС в течение 18–20 ч (если нет других указаний в нормативной документации).

Контролем роста тест-штаммов служит их параллельный посев на чашки с той же питательной средой без испытуемой культуры.

Учет результатов

Учитывают величину зоны отсутствия роста тест-штамма, выраженную в мм. Чем больше величина угнетения роста тест-культур, тем выше антагонистическая активность испытуемого штамма.

Если нет других указаний в нормативной документации, антагонистическую активность штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, считают высокой, если:

• зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 20 мм для штаммов-продуцентов, входящих в лактосодержащие пробиотики;
• зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 15 мм для штаммов-продуцентов, входящих в коли-, бифидосодержащие пробиотики.
• зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 10 мм — для штаммов-продуцентов, входящих в споросодержащие пробиотики