Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах (ОФС.1.5.3.0009.15)
Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
ОФС.1.5.3.0009.15 Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в ЛРС и ЛРП
ОФС вводится впервые
Требования настоящей общей фармакопейной статьи распространяются на методы количественного определения тяжелых металлов: свинца, кадмия, ртути и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах.
Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах проводят с использованием одного из следующих методов:
- атомно-абсорбционной спектрометрии;
- атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой;
- масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.
Результаты, полученные при определении содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье, распространяются на лекарственный растительный препарат, произведенный из данной партии лекарственного растительного сырья.
Лекарственные растительные препараты подвергаются выборочному контролю на содержание тяжелых металлов и мышьяка не реже одного раза в год (одна серия каждого наименования).
Процедура определения содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах состоит из следующих основных этапов:
1. Отбор пробы для определения остаточных пестицидов, тяжелых металлов и мышьяка. Отбор пробы проводится в соответствии с требованиями ОФС «Отбор проб лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов» в условиях, исключающих дополнительное загрязнение сырья.
2. Подготовка пробы.
3. Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в испытуемых пробах.
4. Определение соответствия сырья допустимым нормам.
Оборудование, реактивы, растворы
Для определения содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах используют оборудование, отвечающее требованиям ОФС на соответствующие методы анализа.
При выполнении исследований используют реактивы, предназначенные для спектральных методов анализа или марки «ос.ч.».
Приготовление растворов осуществляют в мерной посуде класса А или 1 класса точности, а их хранение в пластиковой посуде (PMP, PFA, PP).
Используемая вода должна быть деионизованной (деионизированной) на ионнообменных смолах и соответствовать требованиям, предъявляемым к воде очищенной.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И МЫШЬЯКА МЕТОДОМ АТОМНО-АБСОРБЦИОННОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Аппаратура для метода атомно-абсорбционной спектрометрии
Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах проводят на атомно-абсорбционном спектрометре с различными атомизаторами пробы (пламенный, электротермический), а также методом «холодного пара» и генерации гидридов.
Подготовка лабораторной посуды включает следующие последовательные этапы: обычная мойка посуды с раствором моющего средства, тщательное ополаскивание проточной водой питьевой, затем замачивание в натрия гидроксида растворе 1 % и водорода пероксиде, ополаскивание проточной водой питьевой с последующим замачиванием в течение 1 ч в хлористоводородной кислоты растворе 10 %, либо обработка посуды азотной кислоты раствором 1 %, ополаскивание водой для хроматографии 3-4 раза, сушка.
Приготовление стандартных растворов тяжелых металлов и мышьяка осуществляют в лабораторных условиях или используют готовые растворы стандартных образцов.
Подготовка проб к анализу
Пробоподготовка включает в себя предварительное измельчение пробы для определения остаточных пестицидов, тяжелых металлов и мышьяка с целью приготовления однородного образца и последующего взятия не менее двух параллельных навесок, деструкцию органической матрицы для переведения ионов металлов и мышьяка в раствор.
При отборе проб следует избегать контакта лекарственного растительного сырья и препаратов с предметами, содержащими определяемые металлы. Загрязнение лабораторной посуды железом, хромом и никелем может происходить при контакте с нержавеющей сталью, свинцом с резиной, кадмием с некоторыми видами пластмасс. Эти загрязнения контрольным опытом не учитываются и могут давать заметное завышение результатов.
Пробу сырья предварительно измельчают с помощью ножа или ножниц, затем в специальных лабораторных дробилках или мельницах-измельчителях и просеивают сквозь сито с размером отверстий 1 мм (ОФС «Оборудование»). Лекарственные растительные препараты, расфасованные в пачки, дополнительно измельчают и просеивают сквозь сито с размером отверстий 1 мм.
Лекарственные растительные препараты, расфасованные в фильтр-пакеты, дополнительно измельчают и просеивают сквозь сито с размером отверстий 1 мм.
Для дальнейшей подготовки к анализу рекомендуется использовать два метода подготовки пробы:
- сухая минерализация;
- мокрая минерализация.
Пробоподготовка сырья и препаратов к анализу заключается в деструкции органической основы пробы методами «сухой» (термической) минерализации, «мокрой» (кислотной) минерализации с последующим растворением остатка в водных растворах кислот или кислотной экстракции (неполной минерализации). При недостаточной чувствительности проводят концентрирование токсичных элементов с последующим атомно-абсорбционным определением их в органических растворах.
Метод «сухой» минерализации основан на полном разложении органических веществ путем сжигания анализируемой пробы в муфельной печи при контролируемом температурном режиме.
Метод «мокрой» минерализации основан на полном разложении органических веществ пробы при нагревании в смеси концентрированных кислот. Проведение «мокрой» минерализации возможно в открытых системах (колбах Кьельдаля, стеклянных стаканах), либо в закрытых системах (например, автоклав, микроволновая система для пробоподготовки).
Метод пробоподготовки лекарственного растительного сырья и препаратов к анализу выбирают в соответствии с аппаратурным оснащением аналитической лаборатории. Для арбитражного контроля используют метод «мокрой» минерализации (с использованием микроволновой системы для пробоподготовки). Параллельно проводят холостой опыт.
Метод 1а («сухая» минерализация, Pb, Cd)
Около 2,5 г (точная навеска) лекарственного растительного сырья/препарата помещают в фарфоровый, стеклоуглеродный, кварцевый или другой тигель и ставят в холодную муфельную печь. Озоление образцов проводят постепенно, поднимая температуру печи на 50°С каждые 30 мин (во избежание воспламенения) до 480°С, выдерживают в печи до полного озоления образца. После охлаждения пробу переносят во фторопластовый стакан, прибавляют 5 мл азотной кислоты концентрированной, свободной от свинца и кадмия, и оставляют на ночь. Затем нагревают пробу на электрической плитке и выпаривают до сухого остатка, после чего добавляют 1 мл фтористоводородной кислоты концентрированной и при сильном нагреве выпаривают досуха. Остаток охлаждают и обрабатывают 10 мл хлористоводородной кислоты разведенной (1:1) и упаривают до «влажных солей». Остаток доводят хлористоводородной кислоты раствором 2,5 % до объема 10 мл.
Метод 1б («сухая» минерализация, Pb, Cd)
Около 0,5-1,0 г (точная навеска) лекарственного растительного сырья/препарата помещают в тигель (из стеклоуглерода марки С-200, разрешается использование кварцевых и платиновых тиглей, фарфоровых с неповрежденной внутренней поверхностью), смачивают 0,5-1,5 мл серной кислоты концентрированной и осторожно нагревают на пламени газовой горелки, электрической плитке и др. до полного обугливания. Затем тигель охлаждают до комнатной температуры и прибавляют к его содержимому 1 мл азотной кислоты концентрированной и 5 капель серной кислоты концентрированной. После этого осторожно нагревают на электрической плитке до исчезновения бурых паров, избегая разбрызгивания, потом усиливают нагрев до исчезновения плотных белых паров. Затем тигель помещают в муфельную печь и прокаливают при температуре около 500 °С до получения зольного остатка. После чего тигель охлаждают до комнатной температуры и к его содержимому прибавляют 4 мл хлористоводородной кислоты раствора 6 М, закрывают крышкой и нагревают на кипящей водяной бане 15 мин. Затем крышку снимают и осторожно упаривают содержимое тигля до «влажных солей», после чего прибавляют 1 каплю хлористоводородной кислоты концентрированной и 5 мл горячей воды и нагревают в течение 2 мин. Полученный остаток количественно (трехкратно) переносят небольшими порциями при помощи воды для хроматографии в мерную колбу вместимостью 25 или 50 мл, фильтруя через беззольный фильтр, промытый хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, и доводят водой для хроматографии до метки и перемешивают.
Метод 2a («мокрая» минерализация, Pb, Cd)
Около 1,0 г (точная навеска) лекарственного растительного сырья/препарата помещают в колбу Кьельдаля вместимостью 100 мл, прибавляют 7 мл азотной кислоты концентрированной, перемешивают до полного смачивания пробы. После этого к содержимому прибавляют 4 мл хлорной кислоты концентрированной и перемешивают. Колбу закрепляют под углом 45° на песчаной бане, осторожно нагревают до появления бурых паров азота оксида и нагрев отключают. После полного прекращения выделения бурых паров температуру повышают до появления плотных белых паров и получения кислотного остатка 1-2 мл, колбу снимают с песчаной бани, охлаждают и количественно при помощи воды для хроматографии переносят ее содержимое в мерную колбу вместимостью 50 или 100 мл, фильтруя содержимое через беззольный фильтр (промытый хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М), доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Метод 2б («мокрая» минерализация, Hg)
Около 0,5 г (точная навеска) лекарственного растительного сырья/препарата помещают в стеклянный стакан вместимостью 50 мл, смачивают водой, приливают 6 мл серной кислоты концентрированной и 3 мл азотной кислоты концентрированной. Перемешивают, стакан накрывают крышкой из стеклоуглерода и оставляют в водяной бане на 1 сут при температуре около 10-20 °C, затем переносят на водяную баню и нагревают при температуре 50-60 °С в течение 2 ч. После этого стакан охлаждают до комнатной температуры, снимают крышки из стеклоуглерода и прибавляют 5 мл аммония персульфата раствора 5 %. Смесь перемешивают и оставляют в стакане на ночь при комнатной температуре. На следующий день содержимое стакана переносят в мерную колбу вместимостью 200 или 250 мл и проводят дальнейшее определение.
Метод 2в («мокрая» минерализация, Hg)
Около 1,0 г (точная навеска) лекарственного растительного сырья/препарата помещают во фторопластовый стакан металлического тубуса, смачивают 6 мл смеси серной кислоты концентрированной и азотной кислоты концентрированной в соотношении 1:5. Стакан, закрытый фторопластовой крышкой, помещают в металлический тубус. Металлический тубус закрывают, помещают в сушильный шкаф, нагревают до 100 °С и выдерживают при этой температуре в течение 4 ч, далее его вынимают, охлаждают, вскрывают и количественно переносят содержимое фторопластового стакана в мерную колбу вместимостью 200 или 250 мл, и проводят определение.
Метод 2г («мокрая» минерализация, Pb, Cd, As)
Около 1,0 г (точная навеска) лекарственного растительного сырья/препарата помещают во фторопластовый стакан автоклава, смачивают 10 мл смеси хлористоводородной кислоты концентрированной и азотной кислоты концентрированной в соотношении 1:1. Стакан, закрытый фторопластовой крышкой, помещают в автоклав. Автоклав закрывают, помещают в сушильный шкаф, нагревают до 200 °С и выдерживают при этой температуре 2 ч. Далее автоклав вынимают, охлаждают, вскрывают и количественно переносят содержимое фторопластового стакана в мерную колбу вместимостью 50 мл, фильтруя содержимое через беззольный фильтр, промытый хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Метод 2д («мокрая» минерализация, Pb, Cd, Hg, As)
Мокрую минерализацию проводят в системе микроволнового разложения. Разложение в микроволновой системе возможно в различном аппаратурном исполнении при использовании различных кислот и реагентов. При использовании таких систем нужно придерживаться рекомендаций фирмы-изготовителя. Необходимо валидировать методику разложения лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов.
В качестве примера приводится следующая методика.
Около 0,5 г (точная навеска) измельченного лекарственного растительного сырья/препарата помещают в сосуд для микроволнового разложения, приливают 3 мл воды и 5 мл азотной кислоты концентрированной, осторожно перемешивают до полного смачивания и выдерживают в течение 5-10 мин. Сосуд герметично закрывают, помещают его в защитный кожух и затем в ротор микроволновой системы. Далее проводят обработку по программе, приведенной в табл. 1.
Таблица 1. Программа обработки образцов лекарственного растительного сырья/препарата в системе микроволнового разложения
| Этап | Время,
мин |
Температура,°С | Мощность излучения, Вт |
| 1 | 5 | 80 | до 350 |
| 2 | 3,5 | 160 | до 800 |
| 3 | 4,5 | 190 | до 1000 |
| 4 | 12 | 190 | до 800 |
В конце цикла сосуды охлаждают на воздухе, открывают и полученный прозрачный или с небольшим осадком раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, фильтруя через беззольный фильтр, промытый хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, затем доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Допускается проведение пробоподготовки с использованием систем для минерализации проб (микроволновые, автоклавные и т.д.) с валидацией по образцам с известным содержанием элементов.
Проведение измерений
Измерения проводят различными вариантами метода атомно-абсорбционной спектрометрии с разными способами атомизации пробы. Чувствительность измерения в атомно-абсорбционном анализе для пламенного метода составляет 0,01-10 мкг/мл, для непламенных 0,0001-0,1 мкг/мл. Ртуть определяют методом атомно-абсорбционной спектрометрии с применением техники «холодных паров».
Анализ проб на содержание свинца и кадмия осуществляют пламенным вариантом (табл. 2), свинца, кадмия и мышьяка с использованием электротермического атомизатора (табл. 3); ртути на ртутном анализаторе или с использованием ртутно-гидридной приставки к атомно-абсорбционному спектрометру, мышьяка с использованием ртутно-гидридной приставки к атомно-абсорбционному спектрометру в соответствии с условиями анализа элементов (табл. 2).
Таблица 2. Ориентировочные параметры определения тяжелых металлов и мышьяка методом атомно-абсорбционной спектрометрии (пламенный вариант)
| Металл | Длина волны, нм | Ширина щели, нм | Тип пламени | Чувствительность, мкг/мл |
|---|---|---|---|---|
| Кадмий | 228,8 | 0,3 | В — А | 0,025 |
| Свинец | 283,3 | 0,4 | В — А | 0,50 |
| Ртуть | 253,7 | 0,7 | «холодный
пар» |
0,002 |
| Мышьяк | 193,7 | 0,5 | 0,002 |
Примечание: тип пламени: В — воздух, А – ацетилен в соответствии с требованиями инструкции по эксплуатации фирмы изготовителя.
Обработку полученного аналитического сигнала для ртути и мышьяка осуществляют по высоте пика.
Стадия высушивания зависит от кислотного, органического, минерального состава пробы и конструктивных особенностей прибора.
Обработку полученного аналитического сигнала для кадмия, свинца и мышьяка осуществляют по площади пика.
Параметры определения тяжелых металлов и мышьяка со стадиями высушивания, озоления (пиролиза), атомизации и отжига (очистки) исследуемых проб отрабатываются для конкретных приборов в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
Таблица 3. Ориентировочные параметры определения тяжелых металлов и мышьяка методом атомно-абсорбционной спектрометрии (электротермический вариант)
| Металл | Длина волны,
нм |
Ширина щели, нм | Стадия озоления (пиролиза) | Стадия атомизации | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Т,°С | tсек, с | Т,°С | tсек, с | tинт, с | |||
| Кадмий | 228,8 | 0,20-0,5 | 300-600 | 8-25 | 1300-1700 | 3-5 | 3-5 |
| Свинец | 283,3 | 0,20-0,5 | 500-800 | 8-25 | 1600-2000 | 3-5 | 3-5 |
| Мышьяк* | 193,7 | 0,20-0,5 | 800-1400 | 8-15 | 2200-2600 | 3-5 | 3-5 |
Примечание: Т,°С температура озоления, атомизации; tсек, с время озоления, атомизации; tинт, с время интегрирования;
* при использовании корректора Зеемана
Для уменьшения влияния минерального состава лекарственного растительного сырья или препарата на исследуемые элементы используют:
1. Кювету с пластиной (платформой).
2. Модификаторы матрицы.
3. Разбавление анализируемого раствора.
Подготовку атомно-абсорбционного спектрометра к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора с учетом особенности измерения низких концентраций элементов.
Результатом измерений является величина атомного поглощения элемента, полученная в абсорбционном режиме с доверительной вероятностью Р=0,95.
Обработка результатов измерений и определение соответствия тяжелых металлов в сырье допустимым нормам
Обработку результатов проводят с использованием компьютерных программ. При ручной обработке данных строят график зависимости абсорбции от концентрации. Допускается применять линейную, кусочно-линейную или сглаженную нелинейную аппроксимацию градуировочной функции с коэффициентом корреляции не менее 0,990. В расчетах используют среднее арифметическое значение 3 параллельных измерений.
Результаты определения содержания тяжелых металлов в испытуемом образце (С) следует считать как среднее арифметическое 3 параллельных определений с точностью до 0,001 мкг.
Содержание металла в испытуемом лекарственном растительном сырье/препарате (Х) в мкг/г вычисляют по формуле:
где
СХ концентрация металла в испытуемом растворе, мкг/мл;
V разведение, мл;
СК концентрация металла в контрольном опыте, мкг/мл;
VК объем контрольной пробы, мл;
а навеска сырья/препарата, г.
Методики определения тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах должны быть валидированы. Выбор методики измерения аналитического сигнала (по градуировочной кривой или методом «стандартных добавок») для конкретных объектов исследования определяется в ходе валидации методики.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СПОСОБЫ ПРОБОПОДГОТОВКИ И ПРОВЕДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
При проведении определения содержания тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах методами атомно-абсорбционной спектрометрии; атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой; масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой; рентгенофлуоресцентной спектрометрии могут быть использованы способы пробоподготовки и проведения результатов измерений, приведенные ниже.
Метод 1 (сухая минерализация)
Метод соответствует методу 1б («сухая» минерализация, Pb, Cd), приведенному в разделе «Подготовка проб к анализу» для атомно-адсорбционной спектрометрии.
Метод 2 (мокрая минерализация)
Метод соответствует методу 2д («мокрая» минерализация, Pb, Cd, Hg, As), приведенному в разделе «Подготовка проб к анализу» для атомно-адсорбционной спектрометрии.
Проведение измерений
Определение содержания кадмия, ртути, мышьяка, свинца проводят методом калибровочной кривой. Для этого из стандартных образцов элементов с концентрацией 1000 мг/дм3 готовят серию градуировочных растворов, содержащих заявленные элементы в концентрациях:
| Градуировочный раствор | Концентрация, мг/дм3 |
| №1 | 0,003 |
| №2 | 0,01 |
| №3 | 0,03 |
| №4 | 1,0 |
| №5 | 4,0 |
| №6 | 10 |
Приготовление градуировочных растворов
Для приготовления градуировочных растворов используют готовые растворы стандартных образцов (ГСО) состава ионов металлов отечественного или зарубежного производства (CRM) c концентрацией элементов 1000 мг/дм3 в азотной или хлористоводородной кислоте с массовой долей кислоты не менее 1%.
Измерения для каждого градуировочного раствора выполняют не менее 5 раз. С помощью программы обработки данных полученные результаты для каждого градуировочного раствора усредняют и строят линейную градуировочную характеристику (калибровочную кривую) зависимости выходного сигнала от концентрации определяемых элементов в градуировочном растворе (мг/дм3).
Градуировочная характеристика должна быть линейной во всем диапазоне измеряемых концентраций с коэффициентом корреляции не менее 0,990, который определяется автоматически, без вмешательства оператора.
По значению выходного сигнала испытуемого раствора с использованием градуировочной характеристики и программы обработки данных находят концентрацию определяемых элементов в анализируемом растворе (мг/дм3).
За результат измерений принимают среднее арифметическое 3 параллельных определений одной пробы.
Предельно допустимое содержание тяжелых металлов не должно превышать значений, приведенных в табл. 4.
Таблица 4. Предельно допустимое содержание тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах
| Металл | Предельно допустимое содержание, мг/кг |
|---|---|
| Свинец
Кадмий Ртуть Мышьяк |
6,0
1,0 0,1 0,5 |
Примечание В соответствии с требованиями безопасности, принятыми в Российской Федерации.