Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ (ОФС.1.8.2.0006.15)
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)
ОФС.1.8.2.0006.15 Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ
ОФС вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), предназначенный для определения молекулярных параметров иммуноглобулинов. Механизм процесса эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии заключается в хроматографическом распределении молекул иммуноглобулинов в соответствии с их размером и молекулярными массами. Основные положения эксклюзионной ВЭЖХ указаны в ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография».
Метод эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии вводится взамен метода гель-фильтрации.
Метод эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии
Процесс эксклюзионной ВЭЖХ происходит в водной среде и называется гель-фильтрационным, в результате чего происходит распределение молекул иммуноглобулинов по их размеру в широком диапазоне молекулярных масс от 10 до 600 тыс. кДа. Особенностью метода эксклюзионной жидкостной ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (размером 3-5 мкм). Это позволяет быстро и полно разделять сложные смеси веществ.
Принципиальные основы метода заключаются в объеме эксклюзионной колонки, который можно выразить суммой трех слагаемых:
Vc = Vo + Vi + Vd,
Vo – свободный объем подвижной фазы;
Vi – объем пор, заполненный подвижной фазой (объем неподвижной фазы);
Vd – объем матрицы сорбента без учета пор.
Полный объем подвижной фазы колонки (Vt) представляет собой сумму свободного объема подвижной фазы (Vo) и объема неподвижной фазы Vi.
Удерживание молекул в эксклюзионной колонке определяется вероятностью их диффузии в поры и зависит в основном от соотношения размеров молекул и пор. Коэффициент распределения Кd представляет собой отношение концентраций вещества в неподвижной (С1) и подвижной фазах (Со): Кd =C1/Cо. Время удерживания молекул иммуноглобулинов зависит от силы взаимодействия вещества с подвижной и неподвижной фазами.
Анализ иммуноглобулинов проводят в соответствии с методиками, изложенными в фармакопейных статьях или нормативной документации, с указанием следующих необходимых параметров: пробоподготовки исследуемого образца; приготовления стандартных образцов; приготовления подвижной фазы. При описании требуемых хроматографических условий необходимо указать:
- характеристику хроматографической колонки (ее марку (тип), размеры);
- диапазон разделения молекулярных масс;
- состав и название подвижной фазы;
- наименование носителя (сорбента);
- характеристику детектора;
- длину волны;
- объем вводимой пробы;
- температуру колонки;
- скорость потока подвижной фазы;
- последовательность (порядок) ввода проб;
- время хроматографирования.
В процессе разделения фракций иммуноглобулинов на хроматографической колонке белковые молекулы иммуноглобулина с молекулярной массой более 400 тыс. кДа свободно проходят между гранулами носителя (сорбента), не попадая и не задерживаясь в пористых гранулах. Более мелкие молекулы частично попадают в гранулы и задерживаясь в них, медленнее вымываются подвижной фазой. Мелкие молекулы с молекулярной массой менее 50 тыс. кДа попадают в гранулы носителя и еще медленнее вымываются подвижной фазой. Распределение по времени удерживания/выхода компонентов (фракций) иммуноглобулинов, происходит в порядке уменьшения их молекулярных масс: полимеры (агрегаты), димеры, мономеры Ig G (основная фракция иммуноглобулина, полученная из сыворотки крови человека) и фрагменты Ig G.
Количественный анализ иммуноглобулинов состоит из следующих стадий: 1) хроматографическое разделение; 2) измерение площади и/или высоты пиков; 3) расчет количественного состава фракций иммуноглобулинов на основании хроматографических данных; 4) интерпретация полученных результатов (статистическая обработка хроматографического анализа, полученного методом эксклюзионной ВЭЖХ).
Содержание компонентов (фракций) иммуноглобулинов вычисляется автоматически с помощью программного обеспечения счетно-аналитического прибора по площадям пиков и указывается в процентах. Процентное содержание определяемых компонентов иммуноглобулинов должно соответствовать требованиям, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации.
Пригодность хроматографической системы оценивается по стандартным образцам. Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются условия, указанные в фармакопейной статье или нормативной документации: фактор разрешения (R) между пиками, эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику с указанием числа теоретических тарелок, относительное стандартное отклонение площадей пиков.
Примечания.
- Испытуемый раствор. Образцы иммуноглобулина перед анализом разводят, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации.
- Подвижная фаза. Подвижную фазу готовят в соответствии с методикой, изложенной в фармакопейной статье или нормативной документации.
- Стандартные образцы:
- раствор для проверки пригодности хроматографической системы;
- маркеры для эксклюзионной ВЭЖХ с молекулярной массой в диапазоне от 10 до 600 тыс. кДа. Приготовление маркеров осуществляют в соответствии с инструкцией по применению или по методике, указанной в фармакопейной статье или нормативной документации.