Определение активности факторов свертывания крови (ОФС.1.8.2.0003.15)

Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение активности факторов свертывания крови ОФС.1.8.2.0003.15

ОФС Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы определения активности факторов системы свертывания крови человека I, II, VII, VIII, IX, X, XI, фактора Виллебранда, активированных факторов свертывания крови, специфической удельной активности, антитромбина III и гепарина в плазме и препаратах крови.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Определение активности факторов свертывания базируется на двух подходах:

1. Одностадийный метод. Восстановление процесса свертывания крови в дефицитной по фактору плазме после добавления препарата этого фактора (Клоттинговый метод).
2. Двухстадийный метод. На первой стадии с использованием специфического кофактора активируется протеолитическая активность фактора II или фактора X с образованием соответственно активированного фактора IIa или Xa. На второй стадии количество образовавшегося активированного фaктора определяют по реакции расщепления им специфического хромогенного пептида (хромогенный метод).

Возможно проведение хромогенного метод двумя способами: по кинетике образования хромогена под действием активированного фактора или по конечной точке накопления хромогена за определенное время инкубации.

Для проведения обоих методов возможно использование пластиковых пробирок, планшетов, оптико-механических, механических полуавтоматических и полностью автоматизированных коагулометров.

Во всех методах расчет активности производят при сравнении активности тестируемого образца с активностью Международного стандарта NIBSC или рабочего стандартного образца фактора свертывания, откалиброванного относительно Международного стандарта в Международных Единицах активности (МЕ). Эквивалентность Международного стандарта в МЕ устанавливается ВОЗ. За 1 МЕ (100 %) принимают активность фактора свертывания в 1,0 мл свежей нормальной пулированной плазме крови от 300 доноров. Активность может быть выражена в МЕ/мл, МЕ/флакон, МЕ/мг белка и в % от заявленного производителем количества.

Факторы

1. Фактор I (Фибриноген)

Клоттинговый метод

Определение фибриногена проводят методом Клаусса.

Принцип метода

При добавлении тромбина к образцу, содержащему фибриноген, наблюдается образование сгустка фибрина. При использовании тромбина с высокой активностью (~10 МЕ/мл) и образцов с низкой концентрацией фибриногена (ниже 100 мг/дцл) можно получить линейную зависимость.

Для определения фибриногена используют коммерческие тестовые системы, в состав которых входит реагент тромбина, содержащий ингибитор гепарина, и буфер для разведения образцов или коммерческий тромбин-реагент.

Концентрация фибриногена выражается в мг/дцл. Для построения калибровочного графика используют стандартный образец фибриногена или аттестованную по международному стандарту плазму-калибратор. Стандартный образец или образец плазмы-калибратора растворяют в воде очищенной согласно инструкции. Готовят 5 последовательных разведений стандартного образца, начиная с концентрации ~ 100 мг/дцл, с помощью буферного раствора для разведения образцов pH 7,3 ± 0,1. Анализ проводят при температуре 37 °С согласно инструкции к набору. Для каждого разведения трижды определяют время образования сгустка. По полученным результатам в логарифмических координатах строят калибровочный график зависимости времени образования сгустка от концентрации фибриногена.

Готовят два разведения испытуемого образца с концентрацией ниже 100 мг/дцл. Для каждого разведения время образования сгустка определяют трижды. Количество фибриногена в каждом разведении определяют по калибровочному графику.

• Фактор II (Тромбин)
• Клоттинговый метод.

Определение фактора II проводят с использованием в качестве субстрата человеческой плазмы, дефицитной по фактору II. Процесс свертывания активируется добавления смеси кальций:тромбопластин (0,025 М раствора кальция хлорида с тромбопластином в соотношении 1:1).

Для разведения восстановленных стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буферный раствор pH 7,3 ± 0,1, содержащий 0,1 % бычьего или человеческого альбумина. Препарат разводят до концентрации менее 1 МЕ/мл. Анализируют три разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум два раза. Измерение проводят в течение 1 ч после разведения препарата.

Анализ проводят при температуре (37 ± 0,5) °С. В пластиковую пробирку вносят 50 мкл плазмы, дефицитной по фактору II и 50 мкл разведения стандарта или препарата. Смесь инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °С в течение 120 – 240 с. Время свертывания определяют с момента добавления к смеси 200 мкл предварительно нагретой до температуры (37 ± 0,5) °С кальций:тромбопластина. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьироваться в соответствующей пропорции.

Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта фактора II в интервале активности от 0,3 до 1 МЕ/мл. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора II, по оси ординат – время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора II для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность FII (А) в МЕ в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

А = Ах * k

где:

Ax- активность соответствующего разведения исследуемого образца найденная по калибровочному графику, в МЕ;

k — разведение исследуемого образца.

• Хромогенный метод.

Метод основан на сравнении ферментативной активности фактора IIа, образованного после специфической активации фактора II, в отношении специфического хромогенного пептидного субстрата с такой же активностью стандартного образца (международного или аналогичного).

Фактор II активируется с помощью активатора экарина, выделенного из яда гадюки. Активированный фактор II (тромбин) селективно расщепляет хромогенный субстрат (H-D-фенилаланин-L-пипеколил-L-аргинин-4-нитроанилида дигидрохлорид, 4-толуолсульфонил-глицил-пролил-L-аргинин-4-нитроанилид, H — D- циклогексилглицил-α-аминобутирил-L-аргинин-4-нитроанилид, D-циклогексилглицил-L-аланил- L-аргинин-4-нитроанилида диацетат) с образованием п-нитроанилина. Кинетику реакции исследуют фотометрическим методом при 405 нм. При этом значение оптической плотности пропорционально активности фактора II.

Определение фактора II хромогенным методом осуществляют с помощью специальных тестовых наборов. Анализ выполняется в соответствии с инструкцией к набору. Стандартный образец и препарат предварительно разводят плазмой, дефицитной по фактору II, до концентрации ~ 1 МЕ/мл (основное разведение). Из основного разведения готовят три разведения стандартного образца и три разведения препарата буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации. Каждое разведение стандартного образца определяют двукратно, полученные значения используют для построения калибровочного графика. Испытуемые образцы определяют трехкратно.

Испытания проводят в ручном режиме с использованием микропланшет и спектрофотометра, поддерживающего температуру в диапазоне (37 ± 0,5) °C или в автоматическом режиме с использованием коагулометра.

Для проведения испытаний в ручном режиме в лунки микропланшета вносят по 25 мкл каждого разведения испытуемого препарата или стандартного образца. В каждую лунку прибавляют по 125 мкл буферного раствора для разведения, по 25 мкл экарина и инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °C в течение 2 мин. По истечении времени инкубации в каждую лунку вносят по 25 мкл хромогенного субстрата фактора IIа.

Определяют скорость изменения оптической плотности при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 мин и рассчитывают среднюю скорость изменения оптической плотности (∆А/мин).

Если непрерывное измерение оптической плотности невозможно, определяют оптическую плотность при длине волны 405 нм через последовательные интервалы времени (например, через 40 с) и строят график зависимости оптической плотности от времени и рассчитывают ∆А/мин как угол наклона прямой. Из значений ∆А/мин каждого индивидуального разведения стандартного образца и испытуемого препаратов рассчитывают активность испытуемого препарата.

• Тест на отсутствие тромбина.

Определение проводят коагулометрическим методом.

Для испытаний готовят восстановленный раствор препарата в соответствии с инструкцией по применению. При наличии в препарате гепарина его нейтрализуют добавлением протамина сульфата из расчета 10 мкг протамина сульфата на 1 МЕ гепарина.

Методика определения

В две пробирки вносят равные объемы восстановленного препарата и раствора фибриногена. В третью пробирку (контрольная проба) вносят равные объемы раствора тромбина и раствора фибриногена, перемешивают содержимое пробирок вращательными движениями. Одну пробирку с восстановленным препаратом инкубируют в водяной бане с температурой 37 °C в течение 6 ч, другую пробирку с восстановленным препаратом – при комнатной температуре в течение 24 ч. Отмечают наличие или отсутствие коагуляции (сгустка).

Контрольную пробу инкубируют в водяной бане при температуре 37 °C и отмечают время образования сгустка.

Критерием приемлемости результатов является коагуляция в контрольной пробе через 30 с.

Примечания.

1. Приготовление раствора фибриногена. 0,3 г фибриногена растворяют в 100 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, перемешивают и выдерживают 15 – 20 мин при комнатной температуре. Раствор хранят в течение 1 мес при температуре от 2 до 8 ⁰С.
2. Приготовление раствора тромбина. Лиофилизат разводят 0,9 % раствором натрия хлорида до содержания тромбина 1 МЕ/мл и выдерживают 15 – 20 мин при комнатной температуре. Раствор хранят в течение 6 мес при температуре минус 20 °С. Раствор после оттаивания повторному замораживанию не подлежит.

Фактор VII

• Клоттинговый метод.

Определение активности фактора VII проводят с использованием человеческой плазмы, дефицитной по фактору VII. Процесс свертывания активируется добавления смеси кальций:тромбопластин.

Для разведения стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буферный раствор pH 7,3, содержащий 0,1 % бычьего или человеческого альбумина. Препарат разводят до концентрации менее 1 МЕ/мл. Анализируют три разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум два раза. Измерение проводят непосредственно после разведения препарата.

Анализ проводят при температуре (37 ± 0,5) °С. В пластиковую пробирку вносят 50 мкл плазмы, дефицитной по фактору VII и 50 мкл разведения стандарта или препарата. Смесь инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °С в течение 120 – 240 с. Время свертывания определяют с момента добавления к смеси 200 мкл предварительно прогретой до температуры (37 ± 0,5) °С смеси кальций:тромбопластин. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьироваться в соответствующей пропорции.

Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта образца фактора VII в интервале от 0,3 до 1 МЕ/мл. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора VII, по оси ординат – время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора VII для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность FVII (А) в МЕ в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

А = Ах * k

где:

Ax- активность соответствующего разведения исследуемого образца, найденная по калибровочному графику, в МЕ;

k- разведение исследуемого образца.

• Хромогенный метод.

В присутствие тканевого фактора (TF) и ионов Ca²⁺ происходит активация фактора VII (образование FVIIa). Комплекс FVIIa, TF, Ca²⁺ и фосфолипида активирует фактор X. Активированный фактор X (FXa) селективно расщепляет хромогенный субстрат FXa-1 метоксикарбонил-D-циклогексилаланил-глицил-L-аргинин-n-нитроанилид-ацетат с образованием п-нитроанилина. Исследование образца проводят фотометрическим методом при 405 нм. Значение оптической плотности (или увеличение поглощения) пропорционально количеству фактора VII.

Определение фактора VII хромогенным методом осуществляют с помощью специальных тестовых наборов. Анализ выполняется в соответствии с инструкцией к набору. Стандартный образец и препарат предварительно разводят плазмой, дефицитной по фактору VII, до концентрации ~ 1 МЕ/мл (основное разведение). Из основного разведения готовят три разведения стандартного образца и три разведения препарата трис-солевым буферным раствором рН 7,3 – 8,0, содержащим 0,1% бычьего или человеческого альбумина. Каждое разведение стандартного образца определяют двукратно, полученные значения используют для построения калибровочного графика. Испытуемые образцы определяют трехкратно.

Испытания проводят в ручном режиме с использованием пластиковых пробирок или микропланшет при температуре (37 ± 0,5) °C или в автоматическом режиме с использованием коагулометра.

В лунки микропланшет или вносят разведения испытуемого препарата или стандартного образца, добавляют кальций-тромбопластиновую смесь, раствор фактора Х и инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °C от 2 до 5 мин, после чего вносят раствор хромогенного субстрата фактора Ха.

Измеряют изменение оптической плотности при длине волны 405 нм либо в кинетическом режиме, либо прерывают реакцию гидролиза через 3 — 15 мин добавлением 20 % (об/об) раствора уксусной кислоты и измеряют оптическую плотность.

Фактор VIII

• Клоттинговый метод.

Определение фактора VIII проводят с использованием человеческой плазмы, дефицитной по фактору VIII. Источником фосфолипидов, необходимых для осуществления свертывания, является АЧТВ-реагент.

Для разведения стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буферный раствор pH 7,3 ± 0,1, содержащий 0,1 % бычьего или человеческого альбумина. Препарат разводят до концентрации ~ 0,5 – 2 МЕ/мл. Анализируют три разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум два раза. Измерение проводят в течение 1 ч после разведения препарата.

Анализ проводят при температуре (37 ± 0,5) °С. В пластиковую пробирку вносят 100 мкл плазмы, дефицитной по фактору VIII, 100 мкл разведения стандарта или препарата и 100 мкл АЧТВ-реагента и инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °С в течение 2 мин. Время свертывания фиксируют с момента прибавления к смеси 100 мкл предварительно прогретого до температуры (37 ± 0,5) °С 0,025 М раствора кальция хлорида. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьироваться в соответствующей пропорции.

Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта, начиная от концентрации 2 МЕ/мл. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора VIII, по оси ординат – время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора VIII для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность FVIII (А) в МЕ в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

А = Ах * k

где:

Ах- активность соответствующего разведения исследуемого препарата, найденная по калибровочному графику; в МЕ;

k — разведение исследуемого образца.

• Хромогенный метод.

В присутствии ионов Са²⁺ и фосфолипидов фактор Х под действием фактора IХа активируется в Ха. При избытке фактора Х и оптимальных количествах Са²⁺, фосфолипидов и фактора IХа скорость активации фактора Х линейно зависит от количества фактора VIII. Фактор Ха гидролизует хромогенный субстрат S-2765 (N-a-Z-DArg-Gly-Arg-pNA) с высвобождением хромогенной группы pNA, окраска которой регистрируют спектрофотометрически при 405 нм. Количество образовавшегося фактора Ха и следовательно, интесивность окрашивания, пропорционально активности фактора VIII в образце.

Количественное определение фактора VIII проводят с помощью набора реактивов, в котором фактор VIII является кофактором для фактора IХа при активации фактора Х в форму Ха, расщепляющего хромогенный субстрат.

Методика определения

Исследуемый образец перед определением разводят до ожидаемой активности 1 МЕ/мл.

Анализ проводят по инструкции производителя тестовой системы. Испытания проводят в ручном режиме с использованием пластиковых пробирок (макрометод) или микропланшет (микрометод) при температуре (37±0,5) °C или в автоматическом режиме с использованием коагулометра.

Определение можно проводить в кинетическом режиме или по конечной точке.

Определение в пробирках:

200 мкл разбавленного стандартного, контрольного или исследуемого образца вносят в пробирки и инкубируют в течение 3-4 мин при температуре 37 ^оС, прибавляют 50 мкл предварительно прогретого реактива факторов, инкубируют в течение 2-4 мин при той же температуре (37 ^оС) и прибавляют 50 мкл раствора хромогена.

Определение в микропланшетах:

В лунки микропланшета вносят по 50 мкл разбавленного стандартного, контрольного или исследуемого образца и инкубируют в течение 3-4 мин при температуре 37 ^оС, прибавляют 50 мкл предварительно прогретого реактива факторов, инкубируют в течение 2-4 мин при той же температуре (37 ^оС) и прибавляют 50 мкл раствора хромогена.

Кинетический метод определения:

После прибавления раствора хромогена в течение 2 — 10 мин измеряют изменение оптической плотности раствора при 405 нм.

Определение по конечной точке:

После прибавления раствора хромогена смесь продолжают инкубировать при температуре 37 ^оС в течение 2 — 10 мин, после чего для остановки реакции прибавляют 50 мкл 20 % уксусной или 2 % лимонной кислоты. Измеряют оптическую плотность раствора против буфера при 405 нм.

При проведении каждого определения проводят построение калибровочного графика. Разведение стандартного образца готовят в два этапа: предварительное разведение до активности 1 — 2 МЕ/мл и конечные разведения для построения калибровочной зависимости в диапазоне 0 – 2 МЕ/мл. После разведения определение следует провести в течение 30 мин.

Строят график зависимости изменения оптической плотности в минуту (для кинетического метода) или оптической плотности (для определения по конечной точке) разведений стандартного раствора от концентрации в них фактора VIII. Активность в исследуемом образце определяют по калибровочному графику с учетом предварительного разведения образца.

Фактор IX

• Клоттинговый метод.

Определение фактора IX проводят с использованием человеческой плазмы, дефицитной по фактору IX. Источником фосфолипидов, необходимых для осуществления свертывания, является АЧТВ-реагент.

Если в препарате присутствует гепарин, его нейтрализуют добавлением протамин сульфата (10 мкг протамин сульфата на 1 МЕ гепарина).

Для разведения стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буферный раствор pH 7,3, содержащий 0,1 % бычьего или человеческого альбумина. Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта в интервале от 0,3 до 1 МЕ/мл. Препарат разводят до концентрации менее 1 МЕ/мл. Анализируют три разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум два раза. Измерение проводят в течение 1 ч после разведения препарата.

Анализ проводят при температуре (37 ± 0,5) °С. В пластиковую пробирку вносят 100 мкл плазмы, дефицитной по фактору IX, 100 мкл разведения стандарта или препарата и 100 мкл АЧТВ-реагента и инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °С в течение 2 мин. Время свертывания фиксируют с момента прибавления к смеси 100 мкл предварительно прогретого до температуры ( 37 ± 0,5) °С 0,025 М раствора кальция хлорида. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьировать в соответствующей пропорции.

Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора IX, по оси ординат – время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора IX для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность FIX (А) в МЕ в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

А = Ах * k

где:

Ax — активность соответствующего разведения исследуемого образца найденная по калибровочному графику в МЕ;

k- разведение исследуемого образца.

Фактор X

• Клоттинговый метод.

Определение фактора X проводят с использованием человеческой плазмы, дефицитной по фактору X. Процесс свертывания активируется добавления смеси кальций:тромбопластин.

Для разведения стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буферный раствор pH 7,3, содержащий 0,1 % бычьего или человеческого альбумина. Препарат разводят до концентрации менее 1 МЕ/мл. Анализируют три разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум два раза. Измерение проводят непосредственно после разведения препарата.

Анализ проводят при температуре (37 ± 0,5) °С. В пластиковую пробирку вносят 50 мкл плазмы, дефицитной по фактору X и 50 мкл разведения стандарта или препарата. Смесь инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °С в течение 120 – 240 с. Время свертывания определяют с момента добавления к смеси 200 мкл предварительно прогретой до температуры (37 ± 0,5) °С смеси кальций:тромбопластин. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьироваться в соответствующей пропорции.

Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта фактора X в интервале от 0,3 до 1 МЕ/мл. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора X, по оси ординат – время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора X для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность фактора X (А) в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

А = Ах * k

где:

Ax- активность соответствующего разведения исследуемого образца, найденная по калибровочному графику, в МЕ;

k- разведение исследуемого образца.

• Хромогенный метод.

Фактор X активируют с помощью полученного из змеиного яда FX-активатора. Активированный фактор X (FXa) селективно расщепляет хромогенный субстрат FXa-1 N-α-бензилоксикарбонил-D-аргинил-L-глицил-L-аргинин-4-нитроанилида дигидрохлорид, N-бензоил-L-изолейцил-L-глутамил-глицил-L-аргинин-4-нитроанилида гидрохлорид, метансульфонил-D-лейил-глицил-L-аргинин-4-нитроанилид, метоксикарбонил-D-циклогексилаланил-глицил-L-аргинин-4-нитроанилида ацетат с образованием п-нитроанилина. Образцы исследуют фотометрическим методом при 405 нм. Количество фактора X пропорционально увеличению оптической плотности раствора.

Определение фактора X хромогенным методом осуществляют с помощью специальных тестовых наборов. Анализ выполняется в соответствии с инструкцией по применению. Стандартный образец и препарат предварительно разводят плазмой, дефицитной по фактору X, до концентрации ~ 1 МЕ/мл (основное разведение). Из основного разведения в соответствии с инструкцией по применению готовят три разведения стандартного образца и три разведения препарата буферным раствором для разведения образца. Каждое разведение стандартного образца определяют двукратно, полученные значения используют для построения калибровочного графика. Испытуемые образцы определяют трехкратно.

Испытания проводят в ручном режиме с использованием пластиковых пробирок или микропланшет при температуре (37 ± 0,5) °C или в автоматическом режиме с использованием коагулометра.

Для проведения испытаний в ручном режиме в лунки микропланшета вносят по 12,5 мкл каждого разведения испытуемого препарата или стандартного образца, в каждую лунку прибавляют по 25 мкл специфического активатора фактора Х из яда гадюки Рассела и инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °C в течение 90 с, после чего в каждую лунку вносят по 150 мкл рабочего разведения хромогенного субстрата фактора Х.

Определяют скорость изменения оптической плотности при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 мин и рассчитывают среднюю скорость изменения оптической плотности (∆А/мин) или измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм через последовательные интервалы времени (например, через 30 с) и строят график зависимости оптической плотности от времени и рассчитывают ∆А/мин как угол наклона прямой. Из значений ∆А/мин каждого индивидуального разведения стандартного образца и испытуемого препаратов рассчитывают активность испытуемого препарата.

Фактор XI

Клоттинговый метод.

Определение фактора XI проводят с использованием человеческой плазмы, дефицитной по фактору XI. Источником фосфолипидов для свертывания является АЧТВ-реагент.

Препарат используют непосредственно после восстановления. Если в препарате присутствует гепарин, его нейтрализуют добавлением протамин сульфата (10 мкг протамин сульфата на 1 МЕ гепарина). Восстановленный препарат предварительно разводят плазмой дефицитной по фактору XI до активности менее 2 МЕ/мл.

Для дальнейшего разведения стандарта и препарата используют NaCl -имидазоловый буферный раствор pH 7,3, содержащий 0,1 % бычьего или человеческого альбумина. Анализируют три разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум два раза.

Анализ проводят при температуре (37 ± 0,5) °С. В пластиковую пробирку вносят 100 мкл плазмы, дефицитной по фактору XI, 100 мкл разведения стандарта или препарата и 100 мкл АЧТВ-реагента и инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °С в течение 2 — 3 мин. Время свертывания фиксируют с момента прибавления к смеси 100 мкл предварительно прогретого до температуры (37 ± 0,5) °С 0,025 М раствора кальция хлорида. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьировать в соответствующей пропорции.

Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта в интервале от 0,5 до 2 МЕ/мл. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора XI, по оси ординат – время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора XI для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность F XI (А) в МЕ в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

А = Ах * k

где:

Ax- активность соответствующего разведения исследуемого образца, найденная по калибровочному графику, в МЕ;

k- разведение исследуемого образца.

Активность фактора Виллебранда

Определение проводят методом агглютинации или иммуноферментным методом.

Активность фактора Виллебранда определяется путем сравнения его активности с активностью стандартного образца.

Метод агглютинации.

Метод основан на определении коферментной активности фактора Виллебранда при агглютинации суспензии тромбоцитов в присутствии ристоцетина А.

Испытание может проводиться количественными методами с использованием автоматизированного оборудования или полуколичественным методом путем визуальной оценки агглютинации в серии разведений.

Полуколичественный метод.

Из стандартного образца и восстановленного раствора препарата готовят последовательные разведения в 0,9 % растворе натрия хлорида, содержащем 1 – 5 % альбумина человека до ожидаемого содержания фактора Виллебранда 0,5, 1,0 и 2,0 МЕ/мл. По 0,05 мл каждого разведения стандартного образца и исследуемого препарата наносят на предметное стекло, добавляют по 0,1 мл суспензии тромбоцитов с ристоцетином и смешивают в течение 1 мин. В качестве отрицательного контроля используют раствор разведения. После 1 мин инкубации при комнатной температуре визуально оценивают агглютинацию тромбоцитов. Максимальное разведение, при котором происходит агглютинация тромбоцитов, является титром ристоцетиновой коферментной активности образца.

Количественный метод.

Готовят не менее 2-х серий последовательных разведений стандартного и испытуемого образцов буферным раствором для разведения до ожидаемого содержания фактора Виллебранда 0,5, 1,0 и 2,0 МЕ/мл.

Определение проводят в соответствии с инструкцией производителя по применению автоматизированного оборудования. Получают значения зависимости изменения оптического поглощения (степени мутности раствора) от активности фактора Виллебранда.

Определение содержания фактора Виллебранда в испытуемом препарате осуществляют с использованием коэффициентов линейного уравнения зависимости оптической плотности раствора от содержания фактора Виллебранда в стандартном образце.

Иммуноферментный метод.

Метод основан на определении коллаген-связывающей активности фактора Виллебранда. При специфическом связывании фактора Виллебранда с фибриллами коллагена и последующем связывании поликлональных антител к фактору Виллебранда, конъюгированных с ферментом, после добавления хромогенного субстрата образуется хромофор, который может быть количественно определен спектрофотометрическим методом. Существует линейная зависимость между связыванием коллагена с фактором Виллебранда и оптической плотностью.

Определение проводят с использованием тест-систем, разрешенных к применению в практике здравоохранения России в соответствии с инструкциями по применению.

Для испытаний готовят не менее трех последовательных серий разведений стандартного и испытуемого образцов буферным раствором для разведения до ожидаемого содержания фактора Виллебранда 1,0 МЕ/мл. Далее проводят испытания в соответствии с инструкцией производителя используемой тест-системы.

Активированные факторы свертывания крови.

Определение проводят коагулометрическим методом.

Для испытаний готовят восстановленный раствор препарата. При наличии в препарате гепарина его нейтрализуют добавлением протамина сульфата из расчета 10 мкг протамина сульфата на 1 МЕ гепарина. Готовят разведения препарата 1:10 и 1:100 0,05 М трис-гидрохлорида буферным раствором рН 7,5.

В три пробирки вносят по 0,1 мл стандартной плазмы человека и по 0,1 мл раствора фосфолипидов и помещают в водяную баню с температурой (37 ± 0,5) °C на 60 с, после чего в первую пробирку добавляют 0,1 мл 0,05 М трис-гидрохлорида буферный раствор (контрольная проба), во вторую — 0,1 мл испытуемого препарата в разведении 1:10, в третью пробирку — 0,1 мл испытуемого препарата в разведении 1:100. Далее к содержимому каждой пробирки немедленно добавляют по 0,1 мл нагретого до температуры 37 ^оС раствора кальция хлорида 3,7 г/л. Отмечают время формирования сгустка от момента добавления раствора кальция хлорида.

Критерием приемлемости результатов является время коагуляции в контрольной пробе в интервале от 200 до 350 с.

Специфическая удельная активность

Специфическую активность факторов свертывания рассчитывают по формуле:

Определение активности антитромбина III

Хромогенный метод

Метод определения активности ATIII основан на его способности нейтрализовать тромбин в присутствии гепарина. К образцу, содержащему ATIII, добавляют избыточные количества гепарина и тромбина. Образующийся комплекс ATIII-гепарин нейтрализует количество тромбина, пропорциональное количеству ATIII. Оставшийся тромбин селективно расщепляет хромогенный субстрат с образованием п-нитроанилина, абсорбцию которого определяют при 405 нм. Таким образом, количество ATIII обратно пропорционально величине поглощения свободного п-нитроанилина в образце.

Определение активности ATIII проводят с помощью коммерческих тестовых систем. Для построения калибровочного графика используют стандартный образец ATIII или плазму-калибратор, аттестованную по международному стандарту. Стандартный образец или плазму-калибратор растворяют в воде очищенной согласно указаниям в инструкции. Зависимость величины оптической плотности от активности ATIII линейна в интервале активности ATIII от 0,1 до 1,0 МЕ/мл. Используя буферный раствор с гепарином, готовят 4 разведения стандартного образца или плазмы-калибратора с активностью ATIII от 0,1 до 1,0 МЕ/мл. Анализ проводят при температуре 37 °С согласно схеме, приведенной в инструкции к набору. Для каждого разведения трижды определяют величину оптической плотности при 405 нм и в линейных координатах строят калибровочный график зависимости абсорбции от активности ATIII.

Готовят два разведения исследуемого образца с ориентировочной активностью ATIII менее 1,0 МЕ/мл. Определение активности ATIII в испытуемых образцах проводят при температуре 37 °С согласно указаниям в инструкции к набору. Активность ATIII в испытуемых разведениях находят по калибровочному графику. Активность ATIII в МЕ в исследуемом образце определяют как:

А = Ах * k

где:

A_x – активность ATIII в соответствующем разведении, в МЕ;

k – разведение образца.

Количественное определение гепарина

• Клоттинговый метод

Метод основан на способности гепарина за счет ингибирования ряда факторов удлинять время свертывания нормальной плазмы.

Для проведения анализа используют нормальную человеческую плазму, стандартный образец гепарина, АЧТВ-реагент и 0,025 М раствор кальция хлорида. В качестве разбавителя стандартного и испытуемых образцов используют 0,9 % раствор натрия хлорида. Стандартный образец гепарина растворяют в воде очищенной согласно указаниям в инструкции по применению. Готовят три разведения стандартного образца с активностью гепарина 0,3, 0,4 и 0,5 МЕ/мл. Образцы стандарта с данными активностями должны удлинять время свертывания нормальной плазмы минимум в 1,5 раза, в противном случае следует использовать разведения с большей активностью гепарина. Параллельно готовят три разведения исследуемого образца таким образом, чтобы ориентировочно активность гепарина в данных разведениях попадала в интервал активности гепарина в разведениях стандартного образца.

Анализ проводят с помощью автоматического или полуавтоматического коагулометра в пластиковых пробирках при температуре 37 °С. В пробирку вносят 100 мкл нормальной человеческой плазмы, 100 мкл разведенного стандартного или исследуемого образца или 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида (холостой опыт), добавляют по 100 мкл АЧТВ-реагента и инкубируют смесь в течение 120 – 240 с при температуре (37 ± 0,1) °С. Затем в пробирку вносят 100 мкл предварительно прогретого до температуры 37 °С 0,025 М раствора кальция хлорида и фиксируют время свертывания образца. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут быть изменены с соблюдением пропорции. Время свертывания нормальной плазмы (холостой опыт) должно составлять 25 – 40 с. Для каждого разведения стандартного и исследуемого образцов время свертывания определяют трижды.

2.Хромогенный метод

Метод основан на расщеплении хромогенного субстрата, специфического для активированного фактора Х (FXa). При внесении в образец, содержащий гепарин, избыточных количеств ATIII и FXa происходит ингибирование количества FXа, пропорционального количеству гепарина. Оставшийся FXa отщепляет от специфического хромогенного субстрата п-нитроанилин, абсорбцию которого определяют при 405 нм. Таким образом, величина абсорбции обратно пропорциональна количеству гепарина. Данным методом определяют содержание как нефранкционированного, так и низкомолекулярного гепарина в анти-Xa единицах.

Количество гепарина хромогенным методом определяют с помощью коммерческих тестовых систем. Для построения калибровочного графика используют стандартный образец гепарина или плазму-калибратор, аттестованную по международному стандарту. Стандартный образец или плазму-калибратор разводят в воде очищенной согласно инструкции. Готовят 4 разведения стандартного образца с концентрацией гепарина менее 1 анти-Xa ед/мл, используя буферный раствор, указанный в фармакопейной статье или нормативной документации.

Анализ проводят при температуре 37 °С в соответствии с инструкцией к набору. Для каждого разведения трижды определяют абсорбцию при 405 нм, после чего в линейных координатах строят калибровочный график зависимости величины поглощения от концентрации гепарина. Зависимость линейна в диапазоне концентраций гепарина 0 – 1,0 анти-Xa ед/мл.

Для исследуемого образца готовят два разведения с концентрацией гепарина менее 1 анти-Xa ед/мл. Анализ проводят согласно инструкции к набору при температуре 37 °С. Для каждого разведения величину абсорбции определяют трижды.

Определение проводят в ручном режиме с использованием пластиковых пробирок, микропланшет или в автоматическом режиме с использованием коагулометра.

Для проведения испытаний в ручном режиме в лунки микропланшета вносят по 20 мкл стандартной плазмы человека и 20 мкл раствора антитромбина III. Далее в эти лунки вносят, соответственно, по 20 мкл, 60 мкл, 100 мкл и 140 мкл испытуемого препарата или стандартного препарата и доводят объем раствора в каждой лунке до 200 мкл буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации (активность гепарина в конечной реакционной смеси 0,02 — 0,08 ME/мл).

По 40 мкл из каждой лунки планшета переносят во вторую серию лунок, в которые добавляют по 20 мкл раствора бычьего фактора Ха и инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °C в течение 30 с, после чего в лунки добавляют по 40 мкл раствора хромогенного субстрата фактора Ха и вновь инкубируют при температуре (37 ± 0,5) °C в течение 3 – 15 мин, измеряя скорость расщепления субстрата путем постоянного измерения оптической плотности при длине волны 405 нм (кинетический режим) или после остановки реакции добавлением 20 % (об/об) раствора уксусной кислоты ледяной (конечная точка определения).

Содержание гепарина в испытуемом разведении определяют по калибровочному графику с учетом разведения.

При проведении исследований в автоматическом режиме с использованием коагулометра получают значения зависимости изменения оптической плотности от концентрации гепарина.