Моноклональные антитела: понятие, применение.

Моноклональные антитела: понятие, область применения в медицине. Гибридомные технологии, основные этапы получения гибридом. Возможности использования гибридом для производства современных диагностических препаратов. Технология получения моноклональных антител.

Содержание:
1.Введение
2. Иммунобиотехнология
3. Моноклональные антитела.
3.1. Что такое моноклональные антитела?
3.2. Область применения моноклональных антител.
3.3. Способы получения моноклональных антител.
4. Гибридомная технология.
4.1. Понятие о гибридной технологии
4.2. Основные этапы получения гибридом
4.3. Возможности использования гибридом для производства современных диагностических препаратов.
5. Заключение
6. Список литературы

1.Введение.

Микробиологические исследования включают комплекс иммунологических методов (иммунные реакции in vitro и in vivo), которые применяют для индикации и идентификации микробов. Кроме того, микробиология пользуется иммунологическими методами для получения и стандартизации иммунореагентов (специфических сывороток, антигенов, вакцин), а иммунология, точнее иммунобиотехнология, использует микроорганизмы как сырье для получения многих медицинских препаратов (вакцин, антибиотиков, адъювантов, пробиотиков и др.).
Развитие технологии рекомбинантных ДНК, разработка способов получения моноклональных антител, установление структуры и функ­ции иммуноглобулинов привело к использованию специфических анти­тел для лечения различных заболеваний. Работа с генами антител облегчается тем, что отдельные молекулы антитела выполняют разные функции. Привлекательность применения в качестве терапевтических средств специфических антител объясняется тем, что их можно исполь­зовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями, вирусами, для лечения онкологических заболеваний.

Цель работы: Рассмотреть аспекты иммунобиотехнологии, ознакомится с методами получения моноклональных антител. Так же более подробно разобрать один из методов получения антител, на примере гибридомных технологий.

Задачи работы:
1) Изучить научную, медицинскую литературу по теме курсовой работы;
2) Узнать где и как применяются моноклональные антитела;
3) Изучить основные этапы получения гибридом (гибридомная технология);
4) Рассмотреть какие моноклональные антитела получены для диагностических препаратов;
5) Сделать вывод по работе.

2. Иммунобиотехнология

Иммунобиотехнология — это раздел современной биотехно­логии, представленной как научными достижениями, так и ди­намично развивающимся технологическим производством диа­гностических, профилактических и лекарственных средств с при­менением в качестве действующего начала разных агентов и про­цессов иммунной системы. Известно, что человек обладает им­мунной системой для защиты от воздействия внешних неблаго­приятных факторов, биологически активных агентов. В качестве таких агентов выступают клетки микроорганизмов, вирусы, бел­ки, нуклеиновые кислоты, антибиотики, пестициды, объединен­ные под общим названием антигенов. Понятие «антиген» является общим, так как обозначает определенную химическую структуру, против которой могут быть получены антитела.
На самом деле антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившим название антигенных детерми­нант (эпитопов). Например, в случае белковых молекул антиген­ными детерминантами являются участки поверхности, содержа­щие всего около пяти аминокислотных остатков. В случае бактери­альных клеток в качестве антигенных детерминант часто выступа­ют короткие цепочки из трех—пяти остатков сахаров, образу­ющих стенку бактерий.
Антигены внешней среды поступают в организм человека с воздухом, водой, пишей, через слизистые и кожные покровы. Часть антигенов может попадать к человеку в виде вакцин и им­муномодулирующих лекарственных средств (агентов). Иммуно­модуляторы либо усиливают, либо ослабляют иммунный ответ организма, поэтому в зависимости от свойств их подразделяют на иммуностимуляторы и иммуносупрессоры. Иммунный ответ — сложный процесс межклеточного взаимодействия лимфоидных клеток разных типов с участием специфических гормонов, в ре­зультате чего так называемые В-клетки активно синтезируют специфические антитела против данного антигена. Антитела, однородные по структуре и специфичности, производимые в неограниченных количествах, называются моноклональными антителами. [1]

Способы усиления иммунного ответа по типу воздействия под­разделяют :

  • активные
  • пассивные:

— на специфи­ческие
— неспецифические

Способы усиления иммунного ответ с помощью иммунобиопрепаратов.

Активное воздействие

Пассивное воздействие

специфическое

неспецифическое

Вакцины на основе рекомбинантных протективных анти­генов, живые гиб­ридные носители

Поликлональные антитела — на инфекционных агентов, микроб­ных токсинов

Рекомбинантные интер­лейкины,

интерфероны и другие цитокины. Тими­ческие факторы. Транс­плантация костного мозга

Так же существует группа препаратов с иммуносупрессивной активностью, появление которых в клинической практи­ке в 1960-х гг. было связано с необходимостью подавления реак­ции отторжения тканей при трансплантации органов и лечения аутоиммунных заболеваний.

Способы супрессии иммунного ответа с помощью иммунобиолрепаратов

Специфическое воздействие

Неспецифическое воздействие

активное

пассивное

Рекомбинантные антигены, lgE-связующие мо­лекулы и созданные на их основе толерогены

Иммунотокси­ны, антиидиоти­пические антите­ла в качестве мишени для ауто- антител. Специ­фическая плазмо- иммуносорбция

Моноклональные антитела против цитокинов. Неспецифическая гемосорбция и иммуно- плазмофорез

3. Моноклональные антитела.

В этой главе более подробно познакомимся с неспецифическим способом супресси – моноклональные антитела

3.1. Что такое моноклональные антитела?

У млекопитающих в ходе эволюции выработался сложный набор клеточных систем, защищаю­щих организм от токсичных веществ и инфек­ционных агентов. Составной частью защитной реакции является индуцированная выработка клетками лимфатической системы специфиче­ских белков (антител), которые соединяются с чужеродными веществами (антигенами) и при помощи других белков иммунной системы, включая системы комплемента, нейтрализуют их эффект. В ответ на иммунологический сти­мул каждая антителопродуцирующая клетка синтезирует и выделяет единственный вид анти­тел, которые с высоким сродством распознают отдельный участок (эпитоп, антигенную детер­минанту) молекулы антигена. Поскольку в мо­лекуле антигена обычно присутствует несколько разных эпитопов, антитела против каждого из них вырабатываются отдельными клетками им­мунной системы. Такие антитела, каждое из ко­торых взаимодействует с данным антигеном, на­зывают поликлональными.

Уже в начале нынешнего века, когда о поликлональности антител ничего не знали, было яс­но, что их специфичность можно использовать для подавления инфекций. Позже антитела ста­ли применять в качестве диагностического ин­струмента для выявления токсичных соедине­ний в клинических образцах. К сожалению, эффективность препаратов поликлональных ан­тител варьирует от одной партии к другой, по­скольку в одних случаях при проведении имму­низации антителопродуцирующие клетки сильнее стимулируются одними детерминанта­ми данного антигена, а в других иммунная сис­тема активнее отвечает на другие эпитопы того же антигена. Это может влиять на способность разных препаратов нейтрализовать антигены, поскольку отдельные эпитопы обладают разной эффективностью (стимулируюшей способно­стью).

Следовательно, в данной партии поли­клональных антител может содержаться мало молекул, направленных против основного эпи­топа, и в результате она будет менее эффектив­ной, чем предыдущая. Моноклональные антитела, в отличие от поликлональных, являются продуктом секреции одной антителопродуцирующей клетки, либо ее потомков (клона), образовавшихся в процессе деления этой клетки.

Следовательно, для практического примене­ния антител в качестве диагностического инст­румента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуци­ровала антитела одного типа, обладающие высо­ким сродством к специфическому антигену-ми­шени, — моноклональные антитела. [2]
Процесс получения моноклональных антител был изобретён  Жоржем Кёлером и Сезаром Мильштейном в 1975 годах. За это изобретение в 1984 году они получили Нобелевскую премию по физиологии.

Идея состояла в том, чтобы взять линию миеломных клеток, которые потеряли способность синтезировать свои собственные антитела и слить такую клетку с нормальным B-лимфоцитом, синтезирующим антитела, с тем, чтобы после слияния отобрать образовавшиеся гибридные клетки, синтезирующие нужное антитело. Эта идея была успешно реализована и уже к началу 1980-х годов началось коммерческое получение различных гибридом и очистка антител против заданных антигенов.

Все моноклональные антитела, являющиеся продуктом одного клона, представлены идентичными молекулами, отсюда вытекают основные свойства моноклональных антител:

  • а) Все молекулы моноклональных антител, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковую специфичность, то есть, направлены против одинаковых мест связывания (антигенных детерминант) на  каком-либо конкретном антигене, тогда как поликлональная сыворотка имеет в своем составе антитела к разным участкам связывания с антигенам и даже к разным антигенам.
  • б) Все молекулы моноклональные антитела, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковое сродство к связываемому антигену (аффинность), то есть моноклональные антитела бывают высокоаффинными («прочно» связывающие антиген) и низкоаффинные (образующие легко диссоциирующий комплекс с антигеном). Поликлональная сыворотка всегда представлена антителами разной аффинности.
  • в) Все молекулы моноклональных антител, являющиеся продуктом одного клона, имеют один изотип и субизотип иммуноглобулинов, чего нельзя сказать о поликлональной сыворотке.

3.2. Область применения моноклональных антител.

Моноклональные антитела нашли широкое применение в медицине благодаря преимуществам перед поликлональными антителами. Они используются в таких областях как:

1. Терапии.
Наиболее перспективным направлением для использования моноклональных антител в терапии — это нейтрализация токсинов и терапия опухолей, где антитела против опухолеассоциированных антигенов пытаются использовать в целенаправленной транспортировке лекарственных средств к раковым клеткам. В последнее время появились сообщения о получении человеческих моноклональных антител, избирательно вызывающих апоптоз опухолевых клеток, и не действующих на здоровые клетки.
Помимо этого ведутся работы по разработке вакцин на основе моноклональных антител. Теоретическая основа существования таких вакцин основана на концепции антиидиотипических антител «внутреннего образа»: если моноклональные антитела направлены против антигенсвязывающего участка других моноклональных антител, они иногда  копируют участок антигена, то есть несут «внутренний образ» этого антигена и способны вызывать антиген-специфический иммунный ответ. (Рис. 3). Именно такие антитела или их Fv-фрагменты и предложено использовать в составе вакцин вместо антигена.

схема образования антител.

Еще одним возможным аспектом применения моноклональных антител в терапии является использование антител, обладающих самостоятельной ферментативной активностью, либо способных влиять на активность различных ферментов.

Механизм действия таких антител (иначе их называют абзимы) заключается в том, что:

  • а) антитело может быть направлено к активному участку фермента и мешать (помогать) осуществлению ферментом своей функции;
  • б) антитело может быть направлено против молекулы субстрата или к переходному от субстрата к продукту соединению и таким образом может понижать (или повышать) энергетический барьер превращения субстрата в продукт (то есть фактически самостоятельно выполнять функции фермента).

При использовании моноклональных антител в терапии возникают проблемы:

  • а) Подавляющее большинство получаемых моноклональных антител имеет животное происхождение (мышиные или крысиные), в результате чего иммунная система человека воспринимает их как чужеродный белок и быстро разрушает. Моноклональные антитела при этом не успевают проявить свое лекарственное действие.
  • б) Некоторые моноклональные антитела нечеловеческого происхождения могут связывать и выводить из строя жизненно важные молекулы в организме человека, иногда это может привести к летальному исходу (например, агглютинация (склеивание) клеток крови под воздействием антител против поверхностных антигенов).
  • в) Мышиные и крысиные моноклональные антитела являются для человека сильным иммуногеном, и введение их в терапевтических дозах может вызывать аллергические реакции вплоть до анафилактического шока.

Во избежание всех этих неприятностей необходимо использовать для лечения антитела не животного, а человеческого происхождения.[3]
На текущий момент 18 терапевтических моноклональных антител одобрено FDA (управлением по питанию и лекарствам в США). Большенство из них – антитела, полученные от грызунов, или химерные антитела.

Существуют определенные правила наименования моноклональных антител:

  • Название всех моноклональных антител оканчиваются на «mab».
  • Если антитело получено из мыши, добавляется буква «о» («omab»).
  • Химерные антитела добовляют к нозванию «xi» («ximab»).
  • Гуманизированные антитела (в антитела от грызунов, в которых большенство структур Fc-фрагмента заменены человеческим) дабавляют к нозванию «zu» («zumab»). [4]

Например: Одним из наиболее изученных противоопухолевых препаратов антител является Герцептин (Трастузумаб — Trastuzumab) – рекомбинантные моноклональные антитела, которые связываются с рецептором HER2/neu на поверхности клеток многих солидных опухолей. Герцептин высокоэффективен при запущенном раке молочной железы. Интенсивно изучается совместное применение Герцептина и химиотерапии при метастазах рака молочной железы.

2. Использование моноклональных антител в препаративных целях.

С развитием методов генной инженерии особенно остро встал вопрос о необходимости наладить выделение генноинженерных продуктов из их источников (бактериальных и дрожжевых клеток и др.). Часто генноинженерные (или их еще называют рекомбинантные) белки используются в качестве компонентов фармакологических препаратов, производимых в промышленных масштабах, поэтому предъявляются особые требования к их чистоте и к стоимости их очистки. В этом случае выделение белков и пептидов с помощью моноклональных антител практически не имеет конкурентов, так как может производиться в один этап и с высокой степенью очистки.
Наиболее распространенным методом выделения белков с использованием моноклональных антител стала аффинная хроматография.

Основной ее принцип заключается в следующем:
На полимерные гранулы (например, сефароза), называемые иначе сорбентом, химически пришивают молекулы моноклональных антител, и эти гранулы помещают в хроматографические колонки. Далее через эти колонки пропускают растворы (экстракты), из которых хотят выделить нужное вещество, при этом используют такие условия (величина ионной силы раствора, рН, температура и др.), когда с монАТ связываются только требуемые компоненты раствора, а все остальные вымываются. После тщательной промывки колонки от несвязавшихся веществ производят элюцию (смыв) тех веществ, которые специфически связались с монАТ на сорбенте, используя для этого предварительно подобранные условия элюции (изменяют рН раствора, ионную силу и др.). В результате относительно несложной процедуры получают практически чистый препарат белка или пептида. Примерно такой же подход применяют и в исследовательских целях, когда хотят обогатить образец конкретным веществом для последующего его использования в других методиках.

3. Диагностике:

Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний вклю­чает выделение и идентификацию возбудителя. Для идентифика­ции используют комплекс методов с определением культуральных, морфологических, биохимических, антигенных и других свойств микроорганизма. Антигенные свойства устанавливаются с по­мощью специфических антисывороток. Существующие до сих пор сыворотки, хотя и считаются моноспецифическими, содержат раз­ные антитела. Кроме того, с их помощью невозможна идентифи­кация отдельных антигенов возбудителя.
Получение моноклональных антител не только полностью ре­шило вопрос идентификации микроорганизма, но и открыло воз­можность изучения различных физиологических и биохимических процессов жизнедеятельности возбудителя путем определения от­дельных белков-ферментов и т. д.
Основным преимуществом моноклональных антител является их высокая специфичность. Это связано с тем, что моноклональ­ные антитела продуцируются одним лимфоцитом, который рас­познает лишь одну антигенную детерминанту. Поэтому монокло­нальные антитела способны различать очень сходные антигены.
Это является неоценимым качеством в серологии, где необхо­дима точная дифференциация родственных антигенов.

Персональные диагностические наборы. Наиболее широко сейчас используются персональные наборы для определения беременности в домашних условиях. В их основе лежит цветная реакция взаимодействия хорионического гонадотропина мочи с соответствующими моноклональными антителами.
Принцип работы тестов на беременность основывается на имунохроматографическом анализе (ИХА) — это метод определения наличия определенных концентраций веществ в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА — сравнительно молодой метод анализа, он часто обозначается в литературе также как метод сухой иммунохимии, стрип-тест, QuikStrip cassette, QuikStrip dipstick, экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения этого метода анализа.

Принцип действия иммунохроматографического теста состоит в том, что при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер), то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Несвязавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Взаимодействие (и темная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости. Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой отсканированного изображения.

Иммунологический метод анализа основан на реакции между антигеном и соответствующим ему антителом. Антиген — это вещество, которое чужеродное для организма человека и которое может запустить иммунную систему (защитную реакцию). Антитела — это белки, которые выделяются клетками нашего организма при внедрении в него антигена. Метод иммунной хроматографии основан на особенном свойстве антител, связываться с антигеном специфическим (то есть избирательным) образом. Это означает, что каждое антитело узнает и связывается только с определенным антигеном. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа в том числе и ИХА.

В ИХА- тестах используется три типа антител:

  • 1. Растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные («сшитые») с коллоидным золотом — красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (мочу, кровь).
  • 2. Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски.
  • 3. Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.

Несомненно, большую перспективу могли бы иметь подобные наборы для ранней диагностики опухолевых и инфекционных заболеваний, для определения нежелательных примесей в воде, пищевых продуктах, лекарствах и парфюмерных товарах.
Диагностика поверхностных антигенов эукариотических клеток, в частности CD антигенов.
В настоящее время только CD антигенов известно порядка сотни, кроме них на поверхности клеток имеются молекулы адгезии и разнообразные рецепторы. Качественный и количественный состав поверхностных антигенов может дать ценную информацию о функциях конкретной клетки, о ее принадлежности к опухолевым или вирус-инфицированным. Исследование поверхностных молекул клеток позволяет диагностировать ряд заболеваний человека или животного. И вновь моноклональные антитела оказываются незаменимыми в такой диагностике, так как направлены против конкретных поверхностных антигенов.

Определение поверхностных антигенов лимфоцитов CD широко применяется при обследовании ВИЧ-инфицированных, в диагностике гемоблатозов, и других заболеваний, а также для контроля за приживлением трансплантата и эффективностью иммунотерапии. В настоящее время для определения поверхностных антигенов лимфоцитов применяются моноклональные антитела, меченные флюорохромом, и проточный цитофлюориметр.
Моноклональные антитела вырабатываются гибридомами, которые образуются при слиянии миеломных клеток с нормальными плазматическими клетками. Для фенотипирования лимфоцитов человека используют мышиные моноклональные антитела. Моноклональные антитела используют не только для выявления разных типов клеток, но и изучения процессов дифференцировки, созревания, межклеточного взаимодействия и активации лимфоцитов. [3]

4. Использование моноклональных антител для целевой доставки лекарствен­ных веществ. [1]

Лекарственные вещества, проявляющие высокую активность при тестировании in vitro (обычно в культуре клеток), зачастую оказываются значительно менее эффективными in vivo. Кажущее­ся снижение их активности объясняется тем, что они не достига­ют органа или клетки-мишени в нужной концентрации. Увеличе­ние дозы принимаемого препарата не решает проблему, посколь­ку при этом часто возникают побочные эффекты. Более того, что­бы избежать этих эффектов, многие терапевтические средства за­ведомо вводят в дозах, не достигающих оптимальных, что допол­нительно снижает их эффективность.

Для облегчения доставки лекарственного вещества к месту его действия используют несколь­ко приемов:

  • заключают его в липосомы, липидная оболочка которых име­ет высокое сродство к нужным органам;
  • встраивают гены специфических токсинов в инфильтрующие опухоль лимфоциты, которые высвобождают эти токсины непо­средственно в опухоли;
  • присоединяют молекулы лекарственных веществ к монокло­нальным антителам, специфичным по отношению к белкам, на­ходящимся на поверхности строго определенных клеток, напри­мер опухолевых); (рис. а)
  • используют лекарственные вещества в неактивной форме, переводя их в активное состояние при помощи ферментов. Чтобы такое превращение происходило только вблизи клетки-мишени, фермент присоединяют к моноклональному антителу, специфич­ному к поверхностному антигену этой клетки мишени (рис. б)
    1 — лекарственное вещество;
    2 — инертная форма лекарственного вещества;
    3 — моно­клональное антитело,
    4 — фермент;
    5 — поверхностный белок;
    6 — клетка-мишень

присоединяют молекулы лекарственных веществ к монокло­нальным антителам

Несмотря на весьма существенные достижения применения моноклональных антител в терапии разных заболеваний, имеют­ся все-таки и некоторые ограничения их использования в клини­ках. Прежде всего они как гибрндомные продукты могут быть кон- таминированы генетическим материалом ретровирусов, так как все миеломы как опухолевые партнеры гибридизации имеют в геноме гены ретровирусов, являющиеся онкогенными и соответ­ственно опасными для человека. Поэтому все препараты моно­клональных антител обязательно тестируются на отсутствие ви­русного генетического материала.

3.3. Способы получения моноклональных антител.

На данный момент существует два способа получения моноклональных антител:

  • 1. Классический способ получения.
    Классический способ (или традиционная биотехнология) полу­чения антител заключается в гипериммунизации лабораторных жи­вотных заданным антигеном. Полученные антитела используются для специфического лечения заболевания или серологической диаг­ностики соответствующего антигена.
    Однако полученные класси­ческим путем сыворотки обладают ря­дом существенных недостатков:
    на­личие в сыворотке антител не только к заданному антигену, но и к другим.
    для получения чистых антител необходима очистка антигена, что для дефицитных антигенов (гормонов, фер­ментов и др.) технически сложно.
    Кроме того, любой антиген — это не биополимер в целом: антигенной специфичностью обладают лишь определенные участки, так называемые детерминаптные группы. Их выделение в необходимом для иммунизации живот­ного количестве связано с большими технологическими труднос­тями.
  • 2. Гибридомная технология.
    В 70-е гг. произошел переворот в методах иммунологии. На­чалась новая эра в иммунологических исследованиях — была раз­работана методика получения моноклональных антител — высо­коспецифических гомогенных антител к разнообразным антигенам в неограниченном количестве. Моноклональные антитела являются идентичными по всем параметрам — по классу молекулы иммуно­глобулина, его типу, специфичности, авидности, аффинности. На сложные макромолекулы может быть получено несколько моно­клональных антител на разные антигенные детерминанты.
    Авторами метода являются Кёлер и Мильштейн, которые в 1975 г. открыли возможность использования гибридизации сома­тических клеток и получения гибридных клеток (гибридом) для продукции моноклональных антител.

Из соматических гибридов клеток селезенки иммунизирован­ных мышей и злокачественных клеток мышиной миеломы были изолированы клоны, продуцирующие моноклональные антитела. От клеток селезенки гибриды унаследовали способность к синтезу и продукции антител, а от клеток миеломы — способность к не­ограниченному росту и туморогенность.
Клетки миеломы человека и мышей интенсивно изучались уже с конца 60-х гг., так как представляют собой уникальную модель клона антителопродуцирующих клеток. Однако эта система ока­залась неиспользуемой для синтеза определенных антител к за­данному антигену, которым производилась иммунизация.

В 1970 г. появились первые сообщения о получении мышиных гибридом путем слияния миеломных клеток, вырабатывающих различные типы нормальных и вариантных молекул иммуноглобу­линов. Большинство гибридов продолжало продуцировать все полииептидные цепи иммуноглобулинов, которые синтезирова­лись каждой из родительских клеток. Это привело к заключению, что в гибридных клетках гены иммуноглобулинов экспрессируются кодоминантно.
Многие секретируемые гибридомами иммуноглобулины пред­ставляют собой смешанные молекулы, состоящие из тяжелых и (или) легких цепей, синтезируемых обеими родительскими клет­ками. Кроме того, если гибрид получен путем слияния одной непродуцирующей линии с продуцирующей иммуноглобулины ли­нией, синтез антител продолжается, не подавляется. Гибрид про­дуцирует антитела лишь продуцирующего родителя. [5]

Однако, так как лимфоциты были мышиные и синтезировали мышиный иммуноглобулин, введение таких моноклональных антител человеку вызывало иммунную реакцию отторжения. В 1988 Грег Винтер разработал специальную методику «очеловечивания» моноклональных антител, что в основном снимало проблему иммунного ответа на введение антител больному с терапевтическими или диагностическими целями. Антитела, в которых некоторая часть белков заменялась белковыми компонентами человека, получили название химерных антител.
Из сказанного выше я хотела бы более подробно разобраться в гибридомной технологии получения моноклональных антител, так как классический способ получения является более технически затратным и сложным. Так же мне кажется, что он в меньшей мере специфичен по сравнению с гибридомной технологией.

4.Гибридомная технология.

Получение гибридом на сегодняш­ний день — наиболее перспективное направление клеточной ин­женерии.

4.1. Понятие о гибридной технологии
Основная цель гибридомной технологии— «обессмертить» клетку, продуцирующую ценные вещества путем слияния с раковой клеткой и клонирования полученной гибри- домной клеточной линии.

Гибридома — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния клеток двух видов: способных к образованию антител B-лимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного (чаще всего мыши), и раковых клеток миеломы.
Такая гибридома обладает свойством секретировать антитела, взятой у В-лимфоцита, и способностью к бесконечному делению, взятой у опухолевой клетки.
При попадании в организм животного или человека чужерод­ного агента — бактерий, вирусов, «чужих» клеток или просто сложных органических соединений — лимфоциты мобилизуются для обезвреживания введенного агента. Имеется несколько попу­ляций лимфоцитов, функции которых различаются.

Существуют:

  • Т-лимфоциты, среди которых выделяются Т-киллеры («убийцы»), непосредственно атакующие чужеродный агент с целью его инактивации.
    Слияние Т-лимфоцита-киллера с опухолевой клеткой дает клон неограниченно размножающихся клеток, выслеживающих определенный антиген — тот, к которому был специфичен взятый Т-лимфоцит
  • В-лимфоциты, основная функция которых состоит в продукции иммунных белков (иммуноглобу­линов), обезвреживающих чужеродный агент путем связывания с его поверхностными участками (антигенными детерминантами), иными словами, В-лимфоциты вырабатывают иммунные белки, представляющие собой антитела к чужеродному агенту — анти­гену.

При слиянии В-лимфоцита с миеломной клеткой получаются В-гибридомные клоны, широко применяемые как продуценты антител, нацеленных на тот же антиген, что и антитела, синтези­руемые породившим клон В-лимфоцитом, т. е. моноклональных антител. [6].
Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить моноклональные антитела. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа.

Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки, лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10-14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом илиплазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител).

В результате процедуры гибридизации (слияния) образуется гетерогенная популяция клеток, состоящая:

  • во-первых, из неслившихся клеток лимфоидного органа;
  • во-вторых, изнеслившихся клеток миеломы;
  • в-третьих, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома;
  • в четвертых, из гибридов лимфоцит+миелома, из которых лишь часть (часто весьма небольшая) стабильно продуцирует антитела нужной специфичности.

Понятно, что необходимо отделить интересующие клетки от всех остальных:

  • от неслившихся лимфоцитов и гибридов лимфоцит+лимфоцит избавляться не нужно: через несколько дней они умрут сами;
  • от неслившихся опухолевых клеток и гибридов миелома+ миелома избавляются с помощью селективных сред (подробности ниже);
  • среди оставшихся клеток (гибридов лимфоцит+миелома) отбирают нужные путем клонирования, когда из одной клетки выращивают популяцию клеток (клеточный клон) и отбирают среди таких клонов лишь те, которые стабильно продуцируют антитела требуемой специфичности.

Секрецию антител определяют различными методами скрининга супернатантов гибридом, другими словами, проводят анализ той культуральной среды, в которой рос конкретный клон.
При наличии в супернатанте желаемых антител проводят еще одно или несколько клонирований, затем клетки нарабатывают для получения большего количества антител либо в культуре, либо в перитонеальной полости мышей (крыс). Далее антитела выделяют из культуральной или асцитной жидкости и проводят более детальные исследования на предмет их пригодности для использования в тех целях, для которых монАТ были получены. Клетки–продуценты можно заморозить и хранить в жидком азоте долгое время.

4.2. Основные этапы получения гибридом.

В этом разделе познакомимся с основными этапами получения гибридом и более подробно рассмотрим каждый этап.

Получение гибридом состоит из нескольких эта­пов и занимает 3-4 месяца. [5]

  • 1. иммунизация животного;
  • 2. выделение клеток селезен­ки;
  • 3. подготовка миеломных клеток;
  • 4. слияние миеломных и селезеночных клеток;.
  • 5. выращивание гибридных клонов;
  • 6. отбор позитивных, гибридом;
  • 7. получение мас­совых культур гибридомных клеток;
  • 8. концентрирование и очистка мопоклональных ан­тител;
  • 9. анализ антител и определение их специфичности.

1. Иммунизация животного.
Иммунизация — самый «творческий» этап в процессе получения моноклональных антител, именно эффективностью иммунизации определяется в наибольшей степени конечный успех всего предприятия. Тут невозможно дать какой-то единый рецепт, поскольку выбор схемы иммунизации и использование различных приемов, повышающих эффективность иммунизации, целиком зависят от свойств конкретного антигена.
Для первичной иммунизации используют внутримышечное и внутрибрюшинное введение очищенного, связанного с адъювантом антигена в дозе 50—200 мг в расчете на чистый белок. Реиммуни­зацию проводят через 3—4 недели, когда внутривенно вводят 10— 100 мкг антигена. В течение последующих 2—4 недель проверяют титр антител в сыворотке. Животным с наивысшими титрами антител в течение нескольких дней перед забором селезенки до­полнительно внутривенно вводят небольшие дозы антигена с целью активации В-лимфоцитов.
Так же необходимо учесть, что гипериммунизация не всегда оптимальна, так как в некоторых случаях приводит к отрицательным результатом.

Выбор объекта иммунизации.
В первую очередь необходимо выбрать объект иммунизации. На сегодняшний день известны три вида гибридомных систем:
мышиная,
крысиная
человеческая.

Самой распространенной сегодня является мышиная гибридома, а самая редкая -человеческая, чему имеется ряд причин:

  • а) Мыши — наиболее хорошо изученный и доступный объект для работы в лаборатории, то же относится и к линиям мышиных миелом, используемых для слияния.
  • б) Все линии крысиных миелом, адаптированные для гибридомных работ, запатентованы, поэтому коммерческое использование крысиных гибридом регламентируется соответствующими патентами. Все мышиные линии миелом свободны от патентных ограничений.
  • в) Гипериммунизацию грызунов провести проще, чем иммунизацию человека. В большинстве случаев гипериммунизация человека вообще невозможна по этическим соображениям.
  • г) Источником иммунных В-лимфоцитов грызунов могут служить ткани любых лимфоидных органов, тогда как у человека возможно лишь взять периферическую кровь, где общее содержание В-лимфоцитов не превышает 20% от всех клеток. В редких случаях можно использовать удаленные миндалины пациентов, где содержание В-лимфоцитов может достигать 60%, но они, как правило, инфицированы и секретируют антитела именно против этого инфекционного агента.
  • ) При получении человеческой гибридомы существует проблема гистосовместимости клеток миеломы и В-лимфоцитов: у грызунов для слияния берутся В-лимфоциты и клетки миеломы, полученные от одной линии животных, и поэтому имеющих сходный репертуар антигенов гистосовместимости на клеточных поверхностях. Для человека это условие недостижимо, что в конечном итоге выражается очень низкой эффективностью слияния и крайне нестабильной антителопродукцией человеческих гибридом.
  • е) Мышиные и крысиные антитела достаточно просто нарабатывать в асцитных жидкостях; для человеческих гибридом возможна наработка лишь в культуре, либо с применением генноинженерных методов.

В качестве мышиных миеломных клеток в большинстве лабора­торий применяют миеломы мышей линии BALB/c. Наиболее по­пулярной является перевиваемая миелома МОРС-21 (mineral oil induced plasmocytoma 21), которая была получена после интра- перитонеального введения минерального масла самкам мышей BALB/c. Опухолевые клетки были адаптированы к условиям in vitro и дали начало целому ряду клеточных штаммов.

2. Выделение клеток селезенки

Через 3—4 дня после последнего введения мышам антигена выделяют селезеночные клетки. Селезенку помещают в чашку Петри со средой, содержа­щей сыворотку, и перфузируют. Клетки отделяют центрифугиро­ванием, лизируют эритроциты, лимфоциты суспендируют в среде Дальбекко без сыворотки и проверяют на жизнеспособность.

3. Слияние клеток селезенки с миеломными клетками.

Методы слияния клеток разнообразны. В начале 70-х гг. для получения симпластов использовали вирус Сендай, относящийся к парамиксовирусам. С 80-х гг. основная масса работ была прове­дена с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1500—4000 Да.
Наиболее часто применяемым является ме­тод слияния путем центрифуригования клеток, взвешенных в ПЭГ. Кроме того, слияние клеток под действием ПЭГ можно произвести и в монослое . или же использовать слияние клеток в суспен­зии и выращивание гибридов в кондиционированной среде.

108 селезе­ночных клеток смешивают с 107 миеломных клеток. Клетки в среде без сыворотки центрифугируют в конических пробирках. После удаления супернатанта осадок клеток взбалтывают и до­бавляют 2 мл 40%-ного ПЭГ. Процедуры осуществляют при тем­пературе 37°С, ПЭГ добавляют к бессывороточной среде с pH 7,6—7,8. В течение последующих 5—8 мин добавляют среду Даль­бекко с фетальной телячьей сывороткой. Клетки в разведенном ПЭГ осаждают, ресуспендируют в 30 мл гибридомной среды с сы­вороткой и распределяют в лунки объемом 2 мл для микротит­рования. При необходимости среду меняют на свежую. Лунки инкубируют в среде с гипоксантином и тимидином.

Клетки, используемые для улучшения роста клонов, называют клетками-кормилками. Они весьма положительно влияют на обра­зование гибридомных клонов.
В качестве клеток-кормилок используют нормальные клетки селезенки мыши, перитонеальные макрофаги мыши, индуцирован­ные минеральными маслами, эндотелиальные клетки человека, об­лученные фибробласты мыши и человека и др. Особенно перспективно использование макрофагов, так как они кроме ос­новной функции фидера еще осуществляют очищение культуры от клеточного детрита. Образованию гибридомных клопов спо­собствуют также факторы роста и стимуляторы, продуцируемые макрофагальными клетками. Кроме того, положительный эффект оказывает 1%-ная карбоксиметилцеллюлоза, применяемая как совместно с фидером, так и без него.

Для стимулирования эффективности слияния клеток в послед­нее время рекомендуется так называемое электрослияние.
Электрический импульс индуцирует обратимое нарушение це­лостности клеточной мембраны. При этом образуются трансмем­бранные поры, в результате чего мембрана разряжается и сжима­ется. Нарушение целостности мембраны способствует слиянию клеток. В местах контакта между клетками образуются каналы цитоплазматических мембран, по которым происходит обмен ци­топлазматическим коллоидом. В результате из двух клеток фор­мируется одна. Неиспользованный мембранный материал оказы­вается включенным в цитоплазматические вакуоли.

Практически процедуру электрослияния производят следующим образом. Смесь клеток помещают между двумя платиновыми элек­тродами на расстоянии 500 мкм друг от друга. Обработку прово­дят при температуре 4°С. Электрический импульс одновременно действует на все клетки, находящиеся в камере. Метод способст­вует слиянию различного количества и разных клеток. Могут об­разовываться гибриды, гетерокарионы, синкарионы.
Преимущество гибридов, полученных методом электрослияния, заключается в том, что они отличаются высокой жизнеспособно­стью. После слияния быстро возобновляется синтез ДНК, клетки начинают пролиферировать и хорошо подвергаются клонированию.
Таким образом, слияние клеток является одним из первых эта­пов в многостадийном процессе получения моноклональных анти­тел. Получение высокого процента стабильных гибридов гаранти­рует успех на дальнейших этапах — клонирования и выращива­ния клонов.

4. Выращивание гибридных клонов.

При выращивании гибридомных клонов следует учесть сле­дующее обстоятельство. Неслитые клетки селезенки не продол­жают расти, так как не обладают способностью длительно куль­тивироваться. Однако клетки миеломы обладают выраженной по­тенцией роста in vitro и даже могут вытеснить гибридомные клетки. Чтобы этого не случилось, необходимо создать условия, препятствующие размножению родительских миеломных клеток. Для этого используют селективные среды. Наиболее популярным приемом является отбор миеломного родителя с генетическим де­фектом по определенному ферменту—например, гипоксантингуа- нинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ).

Практически вышесказанное реализуется следующим образом.
Через 24 ч инкубации 50% объема среды заменяют на среду ХАТ, содержащую гипоксантин (10~4 М.), аминоптерин (10-5 М) и тимидин (4-10-5 М). Замену среды повторяют в течение двух последующих дней подряд, а далее — через каждые двое суток. Активный рост гибридом наблюдается примерно через 2 недели. Необходимо следить, чтобы клоны не давали слишком большой густоты или не были слишком разведенными. Для этого необхо­димо учитывать соотношение плотности и объема высеваемой кле­точной смеси после слияния.
Лучший рост даст высев взвеси с большим количеством клеток в большом объеме. Однако при таких условиях имеется сущест­венный недостаток — популяция чаще всего является поликло­нальной. Моноклональность обеспечивает высев в небольшом объ­еме негустой клеточной суспензии. В лунках растет клон — по­томки одной гибридной клетки. Понятно, что выживаемость клеток невысокая и должны быть обеспечены все условия для сохране­ния жизнеспособности клеток.

Одним из таких условий является содержание и качество сы­воротки в среде. Обычно гибридомная среда содержит 5—15% фе­тальной телячьей сыворотки. Избыточное количество сыворотки в среде затрудняет продукцию антител и связывает и разрушает готовые иммуноглобулины. С другой стороны, снижение процента сыворотки в среде может повлиять на выживаемость клеток.

Показано, что возможно также использование 2%-ной кро­личьей сыворотки или 5—10%-ной агамма-глобулиновой лошади­ной сыворотки. Оптимальными являются диализованные сыво­ротки, свободные от высокомолекулярных компонентов.
Во время культивирования в течение 10—14 дней элиминиру­ются дефектные клетки. Клетки миеломы, отобранные по устойчи­вости к бромдезоксиуридину, дефектны по тимидинкиназе и обо­значаются символом ТК-. Клетки, устойчивые к 6-тиогуанину или 8-азогуанину, не содержат гипоксантингуанинфосфорибозилтранс- феразу (ГГФРТ-). Эти клетки не имеют обходного метаболиче­ского пути для синтеза пуринов или пиримидинов, но способны синтезировать основания для ДНК и РНК, используя путь, бло­кируемый аминоптерином.
Селективная среда ХАТ содержит аминоптерин, гипоксантин, тимидин. Нормальные клетки на ней живут, но клетки ТК~ и ГГФРТ- не способны жить и погибают.
Гибридные клетки выживают на среде ХАТ при условии, если имеют гены, кодирующие ТК и ГГФРТ, заключенные в Х-хромо- соме.
Гибридная клетка должна содержать Х-хромосому, а также аутосомные хромосомы, кодирующие легкие и тяжелые цепи им­муноглобулинов. Так, известно, что цепи X и х кодируются 6-й хромосомой, а тяжелые цепи — 12-й.

5. Отбор позитивных гибридом.

В случае продукции гибридомой антител они дают поло­жительную реакцию со специфическим антигеном. Поэтому для скрининга положительных, т. е. продуцирующих желаемые имму­ноглобулины, клонов применяют различные серологические реак­ции. Они основаны на аффинности моноклональных антител к ан­тигенным детерминантам. При эквивалентных отношениях и пол­ном насыщении реагирующих детерминант происходит образование комплексов антиген—антитело.

Наибольшей популярностью пользуются два метода:

  • радиоплшунологический — метод основывается на использовании меченных 1251 кроличьих или козьих антител к иммуноглобулину мыши. Меченые антитела прибавляют в лунки к клеткам, смеши­вают, после инкубации клетки отмывают и определяют радиоак­тивную метку, связанную в лунках клетками.
  • изоферментиый. При изоферментиом определении моноклональных антител используют конъю­гированный с пероксидазой иммуноглобулин G к иммуноглобули­нам мыши.

Скрининг на образование антител является самым важным, но и трудоемким этапом во всем процессе получения моноклональных антител. В короткий срок необходимо проверить большое число проб культуральной жидкости из лунок с засеянными гибридом- ными клетками. Только часть клеток обладает способностью к про­дукции антител.
Существуют и другие проблемы. Часть положительных гибри­дом ревертируют, т. е. теряют способность к синтезу антител. При первом скрининге был получен положительный результат, но да­лее образовавшиеся ревертанты уже не продуцируют антитела. Поэтому положительные гибриды должны быть сразу же клони­рованы, а в дальнейшем реклонированы.

6. Получение массовых культур гибидомной клетки.

Положительные клоны гибридом, продуцирующие моно­клональные антитела, могут быть размножены в условиях in vitro в необходимых объемов и служить источником получения неограниченного количества антител.
Оказывается, что в культуре ткани могут быть получены более чистые препараты антител, чем в ферментаторах с выращиванием- суспензионных культур.

7. Концентрация и очистка моноклональных антител.

Моноклональные антитела выделяются в культуральную среду. Большие объемы среды невозможно длительно хранить в незамороженном виде. Для выделения антител из культуральной среды чаще всего используют преципитацию с сульфатом аммония. Этот метод позволяет получать антитела без существенной потери активности.
Продуцирующие гибридомы для поддержания могут быть за­морожены. Работают с культурой в логарифмической фазе.. Клетки суспендируют в смеси 5% диметилсульфоксида и 95% сы­воротки в концентрации 106—107 клеток/мл. Замораживают при температуре — 70°С, хранят в жидком азоте.

8. Анализ антител и определение их специфичности.

После получения очищенных и концентрированных препа­ратов антител повторно в серологических реакциях определяют их специфическое действие. Проводят как качественные, так и ко­личественные проверки.
В последнее время предлагаются существенные изменения от­дельных этапов получения моноклональных антител.
Перспектив­ными являются методы генной инженерии:
1) активация или вве­дение мышиного активированного онкогена туе в миеломные- клетки, выделенные от человека;
2) использование мышиных сек­ретирующих В-лимфоцитов, в которых ген константного района заменен соответствующим геном человека при сохранении гена антигенспецифичного вариабельного района;
3) селекция вариан­тов гибридом по идиотипу, аффинитету и субклассу секретируемых антител.

4.3. Возможности использования гибридом для производства современных диагностических препаратов.

Имеются сведения об успешном использовании моноклональ­ных антител с серологической идентификации различных бактерий. Так, данный метод дал возможность точной дифференциации ми­кобактерий Mycobacterium tuberculosis, М. bouis, М. avium, М. kansasii и др.
Широко моноклональные антитела используются в диагностике кокковых инфекций. Это относится к патогенным для человека гемолитическим стрептококкам групп А, В и к стрептококкам других групп. С использованием реакции преципитации и непря­мой иммунофлуоресценции возможна идентификация различных штаммов стрептококков.
Получены сыворотки к различным антигенам возбудителя го­нореи Neisseria gonorrhoae. Антитела выявляют как типоспецифи­ческие, так и характерные для других бактерий рода Neisseria антигенные детерминанты. Используют радиоиммунологический метод, преципитацию и другие методы.

Получены антитела к поверхностному оболоченному антигену гонококков PrIA и PrIB. Новинский и соавт. показали воз­можности создания эффективных комбинированных препаратов с моноклональными противонейссерийпыми антителами.
В диагностике используются также антитела против липополи­сахаридных антигенов холерного вибриона серотипа Икаба. Они дают перекрестные реакции и с другими серотипами, с вибрионами Огава и др.

Моноклональные антитела сейчас получены и используются в идентификации целого ряда бактерий и их токсинов — синегнойной палочки, Haetnophylus ducreyi, токсина столбняка и др.
Метод успешно применяется не только для идентификации воз­будителя в чистой культуре, но также для обнаружения его анти­генов в биологических жидкостях. Данный метод по чувствитель­ности во много раз превосходит применяемую до сих пор самую чувствительную реакцию преципитации с поликлональными сыво­ротками.
Как уже говорилось, моноклональные антитела дали возмож­ность обнаружить в бактериальных клетках различные антигены — белки, ферменты и, вместе с тем, расшифровать процессы жизне­деятельности микроорганизмов. Так, с помощью моноклональных антител был идентифицирован белок-переносчик лактозы из цито­плазматической мембраны кишечной палочки. Антитела позитив­ных клонов обладали способностью тормозить активный транспорт лактозы в клетку.

Изучены и другие антигенные детерминанты бактерийных кле­ток: например, тейхоевые кислоты, термолабильный энтеротоксиц Е. coli [64, 133].
Аналогичная работа с применением моноклональных антител проводится и в области паразитарных инфекций, т. е. за­болеваний, вызванных патогенными простейшими.
Серьезной проблемой медицины до сих пор является малярия. Получены сыворотки с антителами к различным возбудителям ма­лярии — Plasmodium falciparium, P. vivax, P. cynomolgi, P. berg- hei. Моноспецифические антитела к структурным компонентам спо- розоигов являются решающими в развитии иммунитета. Трудности представляет культивирование спорозоитсв и получение антигена. Проблема решается генно-инженерным методом, т. е. получением рекомбинантного бактериального клона, экспрессирующего инфор­мацию для синтеза поверхностного антигена спорозоита.

В ряде тропических стран распространены и другие паразитар­ные инфекции — трипаносомиаз, лейшманиоз, часто встречается в vrHpe токсоплазмоз. К настоящему времени получены монокло­нальные антитела к ряду возбудителей: к различным видам трнианосом — Trypanosoma cruzi, Tr. brucei, к токсоплазмам, к лейшманиям, к антигенам шистосом и др. [56, 134, 1671.
Моноклональные антитела используются для изучения антиген­ного состава представителей также и других групп микроорганиз­мов, в частности грибков, хламидий. Так, получены моноспецифи­ческие сыворотки к поверхностным антигенам Кандид. Получены антитела и к Chlamidia trachomatis.
Уже созданы диагностические препараты на основе использования гибридом:

Как на пример:
Сотрудниками Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных совместно с МНИИ фтизиатрии и пульмонологии Минздравмедпрома России получены моноклональные антитела, специфично взаимодействующие с поверхностными антигенами микобактерий туберкулеза бычьего вида. Ими разработана иммуноферментная тест-система для проведения идентификации микобактерий туберкулеза бычьего вида и дифференциация их от микобактерий человеческого вида и атипичных, медленно растущих микобактерий. Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности моноклональных антител и корреляции результатов, полученных методами ИФА и общепринятыми бактериологическими методами исследований. В то же время иммуноферментный, метод является высоковоспроизводимым, требует для обнаружения антигена малое количество микробной массы и, самое главное, он непродолжителен, что позволяет оперативно принимать меры по оздоровлению выявленных неблагополучных по туберкулезу пунктов.

Сотрудниками волгоградского научно-исследовательского противочумного института Прохватилова Е.В.; Храпова Н.П.; Тихонов Н.Г. за потентовали изобретение «ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО MUS. MUSCULUS — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ТЕРМОСТАБИЛЬНОМУ ПОВЕРХНОСТНОМУ АНТИГЕНУ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА» Преимуществами использования моноклональных антител в качестве основы для конструирования диагностических флуоресцирующих мелиоидозных препаратов являются стабильность, гомогенность иммуноглобулинового сырья, более высокая удельная активность на 1 мг белка, при котором возможна достоверная индикация возбудителя мелиоидоза, практически 100%-ная воспроизводимость результатов опытов. Использование стабильных гибридных клеточных линий, депонированных во Всероссийской специализированной коллекции клеточных культур РАН (г. Санкт-Петербург), обеспечивает получение специфических иммуноглобулинов в необходимых количествах для производства стандартных иммунодиагностических препаратов для МФА.
Сатрудники ЗАО «Вектор-Бест» и Института биоинженерии ГНЦВБ «Вектор»Порываева В. А., Аборнева И. В., Кандрушина М. П., Карпенко Л. И., Веремейко Т. А., Вторушина И. А., Гришаев М. П. предложили использовать Моноклональные антитела против HBcAg для выявления серологических маркеров вируса гепатита B.
Выявление антител против HBcAg, а также циркулирующего HBeAg в крови больных гепатитом В играет важную роль в серодиагностике при определении стадии этого заболевания.
Целью их работы являлось получение панели моноклональных антител (МКА) против HBcAg и HBeAg и отбор МКА для диагностики.

В качестве антигена для иммунизации мышей линии BALB/c использовали генноинженерный HBcAg (rHBcAg), который демонстрирует типичные для HBcAg антигенные свойства и собран в капсидоподобные частицы. Первичный скрининг специфической антителопродукции гибридом проводили в ИФА с помощью rHBcAg, а дальнейший анализ МКА вели с использованием генноинженерного HBeAg (rHBeAg), денатурированного (d) rHBcAg и сывороток больных, в которых содержался природный HBeAg.
В результате полученная коллекция из 105 гибридом была разделена на группы по специфичности антител в отношении разных антигенов и согласно конкурентным взаимодействиям. Высокое сродство МКА к rHBcAg и слабое связывание или его отсутствие в реакции с drHBcAg и rHBeAg в ИФА показывали 43 % МКА. Эти МКА связываются с конформационными эпитопами rHBcAg и могут быть использованы для дифференцированного выявления антител против HBcAg (но не HBeAg) в конкурентном методе ИФА. Около 25 % МКА выявляют общую для rHBcAg, drHBcAg и HBeAg линейную антигенную детерминанту. В этой группе были найдены МКА, реагирующие с нативным HBeAg и способные выявлять HBeAg в сыворотках больных.

5. Заключение

Почти все новации в получении моноклональных антител имели своей целью создание человеческих терапевтических антител. Впервые моноклональные антитела стали использоваться в терапии в 1986 году, но из-за своего мышиного происхождения их применение было очень ограничено. Спустя почти два десятка лет использование моноклональных антител в терапии остается в зачаточном состоянии, несмотря на очевидные успехи в этом направлении. Большим сдерживающим фактором здесь является высокая стоимость производства терапевтических количеств моноклональных антител.
На основании ранее изложенного можно сделать вывод, что моноклональные антитела представляют собой новую группу лекарственных и диагностических препаратов, обладающих высокой эффективностью при лечении и диагностики рака, аутоиммунных и воспалительных процессов, а также ряда других заболеваний. Уже сейчас они позволяют помочь больным с такой патологией, которую раньше не удавалось контролировать.
Разработка новых препаратов многочисленными биотехнологическими компаниями позволяет ожидать появления в ближайшем будущем еще более разнообразных и эффективных лекарственных средств данной группы.

Гуманизированные моноклональные антитела составляют значительную и быстро растущую часть общего рынка фармацевтических препаратов.
Производством моноклональных антител в настоящее время занимаются около 200 биотехнологических компаний, реализующих сотни новых проектов.
Ежегодный рост продаж препаратов моноклональных антител составляет более 20%. Это позволяет надеяться, что наиболее востребованные препараты моноклональных антител получат еще более широкое применение для лечения нуждающихся в них больных.

6.Список литературы.
Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н. «Биотехнология»- 3е издание/ М. «Академия» — 219-222
Б. Глик, Дж. Пастернак «Молекулярная биотехнология. Принципы и применение»/ перевод с английского М. «Мир», 2002 – 184-187.
Виестур У.Э., Шмите И.А. «Биотехнология: Биологические агенты, технология, аппаратура»/ Рига «Зинатие» 1987 – 63-81.
Егоров Н.С, Олескин А.В., Самуилов В.Д. «Биотехнология: проблемы и преспективы»/ М. «Высшая школа» — 1987 – 33-37.

А Вам помог наш сайт? Мы будем рады если Вы оставите несколько хороших слов о нас.
Категории
Рекомендации
Можно выбрать
Интересное
А знаете ли вы, что нажав сочетание клавиш Ctrl+F - можно воспользоваться поиском по сайту?
X
Copyrights © 2015: FARMF.RU - тесты, лекции, обзоры
Яндекс.Метрика
Рейтинг@Mail.ru