Метод спектроскопии ЯМР для определения подлинности вакцин

Метод спектроскопии ЯМР для определения подлинности полисахаридных вакцин (ОФС.1.7.2.0014.15)

Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОФС.1.7.2.0014.15 Метод спектроскопии ЯМР для определения подлинности полисахаридных вакцин

ОФС вводится впервые

Метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) предназначен для идентификации и контроля подлинности полисахаридных вакцин.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса физический метод анализа, основанный на регистрации переходов между ядерными магнитными энергетическими уровнями молекул вещества, находящегося в постоянном магнитном поле. Переходы между ядерными магнитными уровнями возможны для ядер, обладающих ненулевым магнитным моментом, то есть для ядер со спиновым квантовым числом l, не равным нулю. Практическое значение с точки зрения распространённости и чувствительности имеет наблюдение ЯМР на ядрах ¹H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁹F и ³¹P. Все перечисленные магнитно-активные ядра имеют спин, равный ½. Набор переходов между всевозможными магнитными энергетическими состояниями магнитно активных ядер в молекуле составляет спектр ЯМР. Спектр ЯМР является характеристическим для каждого вещества и поэтому может применяться для его идентификации. На результирующий спектр ЯМР оказывают влияние условия регистрации: агрегатное состояние вещества, температура, наличие других веществ в анализируемом образце.

Основными характеристиками спектров ЯМР являются химический сдвиг, измеряемый в миллионных долях (м.д.), мультиплетность, интегральная интенсивность сигналов, а также константы спин-спинового взаимодействия, определяющие расщепление сигналов ЯМР и измеряемые в герцах (Гц). Эти характеристики зависят от химического окружения данного ядра или группы ядер, от типа и числа соседних ядер, обладающих магнитным моментом, от их пространственного расположения, а также от условий, в которых регистрируется спектр ЯМР.

С целью идентификации и контроля подлинности полисахаридных вакцин регистрируются спектры ЯМР на ядрах углерода 13 (ЯМР ¹³С) в контролируемых условиях. Спектроскопия ЯМР на ядрах ¹Н для образцов полисахаридов не является характеристической из-за сильного перекрывания сигналов.

Регистрация спектра ЯМР ¹³С

Предварительно в датчике спектрометра ЯМР устанавливают температуру 35 °С. В случае исследования вязких растворов температура может быть увеличена до 70 °С. Перед началом регистрации спектра исследуемый образец выдерживают в датчике спектрометра для установления необходимой температуры не менее 5 мин. Для калибровки шкалы химических сдвигов спектрометра регистрируют спектр ЯМР ¹³С 20 % раствора 1,4-диоксана в дейтерия оксида (D₂O). Химический сдвиг сигнала 1,4-диоксана устанавливают как 67,4 м.д. Спектры ЯМР ¹³С образцов полисахаридных вакцин регистрируют в тех же условиях.

Параметры регистрации спектров ЯМР ¹³С образцов полисахаридных вакцин:

• Величина импульса: 45 °;
• Спектральное разрешение: < 1 Гц/точка;
• Время между импульсами: не менее 1 с;
• Температура регистрации: 35 °С.

Параметры обработки спектров ЯМР ¹³С:

• Взвешивающая функция: экспонента;
• Параметр уширения взвешивающей функции: 2 Гц;
• Коррекция базовой линии: полиноминальная.

Критерии пригодности спектров ЯМР ¹³С для анализа:

• Отношение сигнал/шум: ≥10:1;
• Результирующая ширина спектральных линий: <20 Гц.

Анализ спектров ¹³С образцов полисахаридных вакцин:

• выделяется спектральный диапазон аномерных атомов углерода 95–105 м.д.;
• в выделенном спектральном диапазоне идентифицируются характеристические сигналы для полисахаридов вакцины. Эти сигналы должны быть охарактеризованы определёнными химическими сдвигами, уникальными для данного полисахарида, с соответствующими доверительными интервалами;
• в выделенном спектральном диапазоне определяется отсутствие других сигналов, не относящихся к полисахаридам вакцины;
• записывается ¹³С спектр, соответствующий спектральному диапазону аномерных атомов углерода, с указанием цифровых значений химических сдвигов всех характеристических сигналов. Также приводится запись полного спектра (0 – 210 м.д.) с указанием цифровых значений химических сдвигов характеристических сигналов.

Для идентификации и определения подлинности полисахаридной вакцины требуется одновременное выполнение условий как наличия всех характеристических сигналов с определёнными химическими сдвигами, находящихся в границах доверительных интервалов, так и отсутствия любых других сигналов, не относящихся к целевому полисахариду.

Конкретный набор характеристических сигналов с соответствующими доверительными интервалами приводится в фармакопейной статье и нормативной документации.

Примечания.

1. Испытуемый образец. Образец массой от 10 до 20 мг (количество должно быть достаточным для регистрации спектра ¹³С, пригодного для анализа в соответствии с критерием пригодности по соотношению сигнал/шум) растворяют в 0,6 мл дейтерия оксида (D₂O) 99,9 ат. % D, раствор центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в помеченную ампулу для регистрации спектров.
2. Раствор для калибровки. В ампулу для спектроскопии ЯМР помещают 480 мкл D₂O, добавляют 120 мкл 1,4-диоксана и перемешивают.