Лактосодержащие пробиотики (ОФС.1.7.1.0006.15)
Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
ОФС.1.7.1.0006.15 Лактосодержащие пробиотики
ОФС вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на группу иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) – пробиотики, содержащие лактобактерии (далее по тексту «лактосодержащие пробиотики»).
Лактосодержащие пробиотики представляют собой биомассу живых бактерий рода Lactobacillus, лиофильно высушенную в защитной среде (сахарозо-желатиновой, сахарозо-желатино-молочной или иной).
Лактосодержащие пробиотики по составу подразделяются на:
- Монокомпонентные, – полученные на основе одного производственного штамма лактобактерий (например, L.plantarum 8Р-А3 или L.acidophilus La CH-2);
- Поликомпонентные, – полученные на основе нескольких производственных штаммов бактерий рода Lactobacillus, принадлежащих к одному виду (например, L.acidophilus 100аш, L.acidophilus NK и L.acidophilus К3Ш24) или к разным видам (например, L.plantarum и L.acidophilus), или на основе нескольких производственных штаммов бактерий разных родов или семейств (например, Lactobacillus fermentum 90Т-С4 и Bifidobacterium bifidum 1), дополняющих или потенцирующих друг друга по ферментативным свойствам, антагонистической активности, продукции биологически активных веществ, механизму действия или другим свойствам.
- Комбинированные, – полученные на основе одного или нескольких производственных штаммов бактерий рода Lactobacillus, или на основе нескольких производственных штаммов бактерий разных родов или семейств и содержащие, помимо живых микроорганизмов-представителей нормофлоры, другие активные компоненты (например, L.fermentum 90Т-С4, B. bifidum 1 и Силимар экстракт сухой или L.rhamnosus, витамины и микроэлементы).
Производственные штаммы бактерий рода Lactobacillus
Штаммы бактерий рода Lactobacillus, используемые для производства лактосодержащих пробиотиков, депонируют в официальных коллекциях (табл. 1).
Таблица 1. Производственные штаммы бактерий рода Lactobacillus, используемые в производстве лактосодержащих пробиотиков в РФ
| Название производственного штамма бактерий рода Lactobacillus | Место депонирования,
коллекционный номер штамма-депозита |
| L.acidophilus 100аш | Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ № В-3190 |
| Lacidophilus К3Ш24 | Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ № В-3090 |
| Lacidophilus NK1 | Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ № В-8957 (В центральной лаборатории ВНИМИ № 22/10) |
| Lacidophilus NK2 | Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ № В-8958 |
| L.acidophilus NK5 | Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ № В-8959 |
| Lacidophilus NK12 | Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ № В-8960 |
| L.plantarum 8Р-А3 | Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, Россия (ГКПМ), № 900811 |
| Lfermentum 90Т-С4 | Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, Россия (ГКПМ), № 900812 |
| Lplantarum 7-19 (38) | Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, Россия (ГКПМ), №790038 |
| L.fermentum 1-20 (39) | Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, Россия (ГКПМ), №790039 |
Производственные штаммы бактерий рода Lactobacillus проверяют по культуральным, тинкториальным, морфологическим и биохимическим свойствам (табл. 2 и 3), безопасности (in vitro и in vivo) (табл. 4). Определение проводят в соответствии с ОФС «Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков» и ОФС «Безопасность пробиотиков in vivo».
Штаммы ацидофильных лактобацилл среднеустойчивы к колистину, триметоприму, азтреонаму, канамицину, суфадиазину, норфлоксацину. Они чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов.
Таблица 2. Морфологические, тинкториальные и культуральные свойства производственных штаммов бактерий рода Lactobacillus
| Название штамма | Описание морфологических и культуральных свойств |
| L.acidophilus 100аш
L.acidophilus К3Ш24 |
Факультативные анаэробы, микроаэрофилы растут в присутствии азота и углекислого газа в атмосфере. Грамположительные прямые бесспоровые палочки, располагающиеся поодиночке или в виде цепочек из 2 – 4 и более клеток. Штаммы, применяемые для изготовления препарата, могут находиться в S и R-форме. Размер клеток 18-часовой культуры, выращенной в молоке, составляет 10–20 мкм. Клетки равномерно окрашиваются метиленовой синью.
При выращивании на агаре с гидролизованным молоком через 48–72 ч роста штаммы образуют «локонообразные» колонии на поверхности агара и колонии в виде «паучков» в глубине агара. Диаметр колоний – 1–2 мм. Штаммы обладают высокой активностью свертывания молока. При оптимальной для роста температуре и внесении 3–5% посевного материала должны свертывать молоко за 1–12 ч, снижая рН молока до уровня 3,8 – 4,2. |
| L.acidophilus NK1
Lacidophilus NK2 L.acidophilus NK5 L.acidophilus NK12 |
Факультативные анаэробы, микроаэрофилы; растут в присутствии азота и углекислого газа в атмосфере. Грамположительные прямые бесспоровые палочки, располагающиеся поодиночке или в виде цепочек из 2–4 и более клеток или поодиночке. Штаммы, применяемые для изготовления препарата, могут находиться в S- и R-форме. Величина клеток 18-часовой культуры в молоке составляет 10–20 мкм. Клетки равномерно окрашиваются по Граму. При выращивании на агаре с гидролизованным молоком через 48–72 ч роста штаммы образуют «локонообразные» колонии на поверхности агара и колонии в виде «паучков» в глубине агара. Диаметр колоний – 1–2 мм.
При культивировании на среде МРС-5 в анаэробных или микроаэрофильных условиях через 48–72 ч штаммы образуют круглые без четких границ колонии. |
| L.plantarum 8Р-А3
L.plantarum 7-19 |
Факультативные анаэробы, растут в атмосфере углекислого газа и азота, а также в присутствии кислорода. На жидкой среде МРС-1 вырастают в виде равномерной мути и гомогенного белого осадка на дне пробирки; на полужидкой среде МРС-2 образуют изолированные колонии в виде тяжей. На плотной среде МРС-4 образуют выпуклые, непрозрачные, белые колонии |
| L.fermentum 90Т-С4 Lfermentum 1-20 | Факультативные анаэробы, растут в атмосфере углекислого газа и азота, а также в присутствии кислорода. На жидкой среде МРС-1 дают равномерное помутнение и образуют гомогенный белый осадок на дне пробирки; на полужидкой среде МРС-2 образуют изолированные колонии в виде тяжей. На плотной среде МРС-4 образуют слабовыпуклые, полупрозрачные, сероватые колонии |
Таблица 3. Физиолого-биохимические свойства производственных штаммов бактерий рода Lactobacillus
| Свойства | Штаммы бактерий рода Lactobacillus | |||
| L.acidophilus
100аш, К3Ш24 |
L.acidophilus NK1, NK2 NK5, NK12 | L. plantarum
8Р-А3, 7-19 |
L.fermentum 90Т-С4,
1-20 |
|
| Ферментация: | ||||
| — глюкоза | + | + | + | + |
| — лактоза | + | + | + | + |
| — галактоза | + | + | + | + |
| — манноза | + | + | + | + |
| — декстроза | + | + | + | + |
| — фруктоза | + | + | + | + |
| — мальтоза | + | + | + | + |
| — сахароза | + | + | + | + |
| — целлобиоза | + | + | + | в |
| — салицин | + | + | + | — |
| — маннит | — | — | + | — |
| — рамноза | — | — | — | — |
| — ксилоза | — | — | в | в |
| — сорбит | — | — | + | — |
| — арабиноза | — | — | в | в |
| — эскулин | + | + | + | — |
| — меллибиоза | + | в | + | + |
| — трегалоза | в | в | + | в |
| — мелецитоза | — | — | в | — |
| Образование газа из глюкозы | — | — | — | +. |
| Образование кислоты
из глюкозы |
+ | + | + | + |
| Каталаза | — | — | — | — |
| Лизоцимная активность | — | + | ||
| Оптимальная температура
роста, оС |
(381) | (381) | (371) | (371) |
| Рост при температуре 61 оС | + | + | ||
| Рост при температуре 20 оС | + | + | + | + |
| Рост при температуре 15 оС | — | — | + | — |
| Сквашивание молока | +
L(+)-DL- молочная кислота |
+
L(+)-DL- молочная кислота |
+ | + |
| Рост в щелочной среде (рН=8) | + | + | ± | ± |
| Рост в присутствии 0,4–0,6 % растворе фенола | + | + | ± | ± |
| Рост в присутствии
солей желчи (до 20 %) |
+ | + | ± | ± |
| Рост в 2% растворе NaCl | + | + | ± | ± |
| Адгезивная активность | — | — | + | + |
| Активность
кислотообразования, оТ |
не ниже
230 |
не ниже
230 |
не ниже
230 |
не ниже
230 |
| Антагонистическая активность (зоны задержки роста тест-штаммов, мм) | не менее
20 |
не менее
20 |
не менее
20 |
не менее
20 |
Примечание: «+» положительный тест: «-» отрицательный тест
Таблица 4. Изучение безопасности штаммов бактерий рода Lactobacillus
| Название
микроорганизма (род, штамм) |
Безвредность | Вирулентность | Токсичность | Токсигенность | ||||
| Вводи-мая доза,
х1010 КОЕ/ 0,5мл |
Кол-во живых/ павших мышей | Вводи-мая доза,
х109 КОЕ/ 0,5мл |
Кол-во живых/ павших мышей | Вводи-мая доза, х109 КОЕ/мл | Кол-во живых/ павших мышей | Вводи-мая доза,
мл |
Кол-во живых/ павших мышей | |
| L. acidophilus 100аш
К3Ш24 NK1 NK2 NK5 NK12 |
1 | 10/0 | 1 | 10/0 | 1 | 10/0 | 0,5 | 10/0 |
| 5 | 10/0 | 5 | 10/0 | 5 | 10/0 | 1,0 | 10/0 | |
| 10 | 10/0 | 10 | 10/0 | 10 | 10/0 | |||
| L. plantarum
8Р-А3,7-19 (38) |
1 | 10/0 | 1 | 10/0 | 1 | 10/0 | 0,5 | 10/0 |
| 5 | 10/0 | 5 | 10/0 | 5 | 10/0 | |||
| 10 | 10/0 | 10 | 10/0 | 10 | 10/0 | 1,0 | 10/0 | |
| L.fermentum
90Т-С4, 1-20 (39) |
1 | 10/0 | 1 | 10/0 | 1 | 10/0 | 0,5 | 10/0 |
| 5 | 10/0 | 5 | 10/0 | 5 | 10/0 | |||
| 10 | 10/0 | 10 | 10/0 | 10 | 10/0 | 1,0 | 10/0 | |
ПРОИЗВОДСТВО
Производство лактосодержащих пробиотиков основано на выращивании/культивировании производственного штамма или штаммов бактерий рода Lactobacillus на оптимальной питательной среде в адекватных условиях методом глубинного культивирования с последующей лиофилизацией биомассы в защитной среде.
При производстве лактосодержащих пробиотиков проводят валидацию технологического процесса и методов контроля, которые в соответствии с требованиями правил организации производства и контроля качества лекарственных средств доказывают, что конкретная методика, процесс, оборудование, исходное сырье, деятельность персонала или система действительно приводят к ожидаемым результатам и гарантируют, что лекарственное средство соответствует своему составу, не содержит контаминантов, маркировано надлежащим образом, упаковано и сохраняет свои свойства в течение всего срока годности.
При производстве лактосодержащих пробиотиков особое значение имеет постоянное выполнение на всех этапах производства внутрипроизводственного анализа основных показателей качества для оценки их воспроизводимости и анализа качества готовой продукции при выпуске и в течение всего срока хранения.
Лактосодержащие пробиотики для медицинского применения выпускают в следующих лекарственных формах: лиофилизаты (флаконы), порошки, таблетки, капсулы (пероральные, вагинальные, капсула в капсуле), суппозитории и мази. Показатели качества лекарственного средства оценивают в соответствии с лекарственной формой.
ИСПЫТАНИЯ
Показатели качества лекарственного средства лекарственных форм лиофилизаты, таблетки и капсулы, порошки, суппозитории и мази оценивают в соответствии с требованиями ОФС «Таблетки» и «Капсулы», «Порошки», «Суппозитории» и «Мази».
Описание. Приводится описание внешнего вида соответствующей лекарственной формы лекарственного средства.
Подлинность. Подлинность подтверждают следующими методами – микроскопическим (окраской мазков по Граму), бактериологическим (описание вида колоний, выросших на адекватных питательных средах, и подтверждается специфической активностью). Испытание проводят в соответствии с ОФС «Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков», если в нормативной документации не указаны другие требования.
Время восстановления препарата (для лиофилизатов и порошков). Испытание проводят в соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты» либо по методике, описанной в нормативной документации, с указанием времени получения восстановленного препарата (для лиофилизатов – не более 5 мин, для порошков – не более 20 мин, если в нормативной документации нет других указаний).
Время распадаемости (для таблеток и капсул). Испытание проводят в соответствии с ОФС «Распадаемость таблеток и капсул».
Указывают применяемый растворитель (среда распадаемости), его объем и, при необходимости, условия растворения (температуру растворителя, перемешивание, встряхивание, использование водяной бани).
Время распадаемости для таблеток не должно превышать 15 мин, для капсул – 20 мин, если в нормативной документации не указаны другие требования.
Температура плавления или время полной деформации (для суппозиториев и мазей). Для суппозиториев, изготовленных на липофильной основе, определяют температуру плавления в соответствии с ОФС «Суппозитории», «Мази» и «Температура плавления» (метод 2), которая не должна превышать температуру 37 0С, если нет других указаний в нормативной документации. Если определение температуры плавления затруднительно, то определяют время полной деформации.
Для суппозиториев на липофильной основе определяют время полной деформации в соответствии с ОФС «Определение времени полной деформации суппозиториев на липофильной основе». Время полной деформации не должно превышать 20 мин, если нет других указаний в нормативной документации.
рН (для лиофилизатов, порошков, капсул, таблеток). Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия». Указывается допустимый интервал значений рН; в случае определения рН после растворения следует указать растворитель и его объем.
Потеря в массе при высушивании (для лиофилизатов, капсул, таблеток). Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с ОФС «Потеря в массе при высушивании» или другим валидированным методом.
Показатель потери в массе при высушивании должен составлять (если нет других указаний в нормативной документации) для:
- лиофилизатов – не более 3,5 %;
- капсул – не более 3,5 %;
- таблеток – не более 4,5 %;
- порошков – не более 5,0 %.
Средняя масса и отклонения от средней массы (для порошков, таблеток, содержимого капсул, суппозиториев и мазей). Приводятся требования к средней массе и максимально допустимые отклонения от средней массы в соответствии с ОФС «Однородность массы дозированных лекарственных форм».
Специфическая безвредность. Определение проводят в соответствии с ОФС «Безопасность пробиотиков в тестах in vivo». Указываются требования и критерии специфической безвредности; требования к животным, используемым для контроля (порода/линия, пол), их количество, групповая масса животных перед введением препарата и после окончания срока наблюдения; дозы, условия разведения и методы введения лекарственного средства; продолжительность наблюдения и учитываемые показатели. Лекарственное средство должно быть безвредным.
Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов (микробиологическая чистота). Определение возможной контаминации испытуемого препарата проводят в соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота» методом прямого посева. Лактосодержащие пробиотики должны соответствовать нормативным требованиям, изложенным в ОФС «Микробиологическая чистота» (если в нормативной документации не приведены другие требования):
- категории 5.3.А (лиофилизаты, порошки);
- категории 5.3.Б (таблетки, капсулы, суппозитории, мази*).
* Дополнительно для лекарственной формы мази: в единице препарата (г) должны отсутствовать представители рода Bacillus.
В нормативных документах на пробиотики для детей введены более строгие нормы, а именно:
- для детей (от 3 мес до 1 года) для приема внутрь (таблетки, капсулы и др.), ректально (суппозитории) – не более 10 аэробных бактерий в 1 единице препарата/г; при отсутствии в 1 единице препарата энтеробактерий, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, дрожжевых и плесневых грибов;
- для детей (от 1 года) для приема внутрь (таблетки, капсулы), ректально (суппозитории) – не более 50 аэробных бактерий в 1 г препарата; при отсутствии в 1 единице препарата энтеробактерий, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, дрожжевых и плесневых грибов.
Указывают используемые питательные среды, количество и объем испытуемого материала, условия инкубации и ее продолжительность, особенности учета результатов.
Специфическая активность. Специфическая активность определяется количеством жизнеспособных бактерий в 1 дозе лекарственного средства и активностью кислотообразования (или антагонистической активностью) в соответствии с ОФС «Определение специфической активности пробиотиков».
В 1 дозе (таблетке, капсуле и т.д.) препарата должно содержаться:
- лактобактерий вида L.acidophilus – не менее 107 КОЕ;
- лактобактерий вида L.plantarum – не менее 109 КОЕ.
Активность кислотообразования штамма-продуцента, входящего в испытуемый препарат, должна быть не менее 220оТ (если нет других указаний в нормативной документации).
Производственные штаммы и штаммы для контроля. Определение проводят в соответствии с ОФС «Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков».
В разделе должна содержаться информация:
1. Наименование производственных штаммов и штаммов для контроля, обоснование для включения в производство (депонирование в официальных коллекциях).
2. Производственные штаммы и штаммы для контроля должны быть проверены на отсутствие контаминации и соответствующим образом охарактеризованы по биологическим и биохимическим свойствам.
Контроль качества производственных пробиотических штаммов и штаммов для контроля пробиотиков рекомендуется проводить не реже 1 раза в год, если в нормативной документации нет других указаний.
Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».
Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8 оС, если нет других указаний в нормативной документации. Указывают условия транспортирования и хранения, обеспечивающие стабильность лекарственного средства.