Интерфероны и интерлейкины, перспективы их получения.
Синтез различных классов интерферона человека в генетически сконструированных клетках микроорганизмов

Содержание
Введение
1. Иммунобиотехнология как один из разделов биотехнологии
2. Интерфероны. Структура и свойства интерферонов
3. Интерфероны. Роль ИНФ в системе иммунного ответа
4. Интерфероны. Применение ИНФ в медицинской практике
5. Структура и свойства интерлейкинов
6. Интерфероны. Синтез различных классов интерферона человека в генетически сконструированных клетках микроорганизмов
Заключение
Список литературы

Введение

В 1957 г. сотрудники Лондонского национального института вирусологи англичанин А. Айзек и швейцарец Дж. Линдеман случайно во время опытов открыли интерферон (ИФН) – первое противовирусное вещество, первый и наиболее детально изученный цитокин, первый биологически активный препарат, обладающий универсально широким диапазоном эффектов.
Изучение ИФН претерпело стремительную эволюцию от простого экспериментального наблюдения до научного объяснения и последующего познания нового феномена, завершившегося созданием весьма представительного поколения медицинских препаратов, которые широко применяются сейчас при инфекционных заболеваниях, в онкологии, неврологии, офтальмологии, дерматологии и т.д.

За прошедшие 50 лет накоплена обширная информация о физико-химических и биологических свойствах ИФН, изучена локализация интерфероновых и регуляторных генов в клетках, определены нуклеотидная и белковая последовательности всех основных типов и субтипов ИФН и в основном установлены роль и место ИФН в норме и при различных видах патологии. Это решило проблему производства интерферонов в необходимых для здравоохранения количествах и стало поворотным событием в биологии и медицине, ознаменовавшим первый этап создания нового поколения биопрепаратов.
Другой значимой группой цитокинов являются интерлейкины (ИЛ), обладающие разнообразными функциями, но большинство их стимулирует другие клетки для деления или дифференцировки, при этом каждый из них действует на отдельную, ограниченную группу клеток, экспрессирующих специфичные для данного интерлейкина рецепторы.
Многообразие физиологических функций ИФН и ИЛ указывает на их контрольно-регулирующую роль в сохранении гомеостаза. Система ИФН и ИЛ относится к числу быстрореагирующих и является одной из важнейших составляющих естественного (врожденного) иммунитета, поэтому данная тема актуальна на сегодняшний день.
Целью данной работы является: изучить свойства, области применения и направления использования интерферонов и интерлейкинов, а также методы их получения и открывающиеся перспективы в технологии производства.

Поставленная цель позволила выделить основные задачи:
1. ознакомиться с иммунобиотехнологией как разделом биотехнологии;
2. изучить структуру и свойства интерферонов;
3. выделить основные эффекты интерферонов и их значение в организме человека;
4. определить роль интерферонов в системе иммунного ответа;
5. рассмотреть применение интерферонов в медицинской практике;
6. изучить структуру и свойства интерлейкинов;
7. рассмотреть синтез различных классов интерферона человека в генетически сконструированных клетках микроорганизмов.

1. Иммунобиотехнология как один из разделов биотехнологии

В течение последних 10–15 лет текущего столетия происходит бурное развитие биотехнологии, определились сферы приоритетного внедрения конкретных результатов биотехнологических разработок, и как следствие появился такой раздел как иммунобиотехнология.
Иммунобиотехнология – новое направление иммунологии, разрабатывающее получение высокоэффективных диагностических и лечебных средств на основе биотехнологии.
Иммунобиотехнология – это раздел современной биотехнологии, представленной как научными достижениями, так и динамично развивающимися технологическими производствами диагностических, профилактических и лекарственных средств с применением в качестве действующего начала разных агентов и процессов иммунной системы.
Иммунобиотехнология объединяет производство вакцин, иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, иммуномедиаторов, моноклональных антител и некоторых других. Сюда относится индустрия диагностических тест-систем (диагностикумов) для широкого обследования распространенности инфекций, получение поликлональных и моноклональных антител. Такие белки как лимфокины, к которым относятся интерфероны, интерлейкины, фактор, стимулирующий колониеобразование гранулоцитов и макрофагов, фактор некроза опухолей и некоторые другие секретируются клетками иммунной системы в ответ на появление внешнего антигена. Их используют в качестве противовирусных и противоопухолевых препаратов.
Можно заметить, что на основе иммунобиотехнологических процессов создаются также профилактические и лечебные средства. Производство некоторых лимфокинов отлажено на основе бактериальной системы.
Таким образом, иммунобиотехнология представляется частным случаем медицинской биотехнологии. [4, стр 18-19]

2. Интерфероны. Структура и свойства интерферонов

Интерфероны (ИФН) относятся к цитокинам (медиаторам иммунитета) и представлены семейством белков, обладающих антивирусной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью, что позволяет отнести их полифункциональным биорегуляторам широкого спектра действия и гомеостатическим агентам.
Система интерферонов не имеет ни специализированных клеток, ни тем более органов, она существует в каждой клетке, т.к. каждая клетка может быть заражена вирусом и должна иметь систему распознавания и элиминации чужеродной генетической информации.
Интерферон действует не прямо на геном клетки, а через клеточные мембраны, т.е. дистанционно. Многообразие обнаруженных и изученных к настоящему времени физиологических функций интерферонов указывает на их контрольно-регуляторную роль в сохранение гомеостаза. По весомости эта система сравнима с системой иммунитета, а по универсальности превосходит её, делая интерфероны важнейшим фактором врождённого (естественного) иммунитета, играющим одну из первых ролей в противовоспалительном каскаде цитокинов.

В настоящее время наиболее изучены три класса интерферонов:  ИНФ-альфа, ИНФ-бета, ИНФ-гамма.
ИНФ-альфа и ИНФ-бета относятся к интерферонам первого типа. К ним относятся также ИНФ-дельта, ИНФ-омега, ИНФ-тау. К ИНФ второго типа относится ИНФ-гамма. ИНФ 1-ого типа представляют собой полиморфное семейство белков с высокой гомологией первичной структуры и близким спектром биологической активности. Если ИНФ-альфа кодируется семейством, включающим более 20 генов, то ИНФ-бета в хромосомах человека представлен единичной копией и, соответственно, одним протеином в периферической крови и тканях. ИНФ-альфа также называется лейкоцитарным интерфероном, что подчёркивает его первичный источник выделения. ИНФ-бета получил название фибробластного интерферона, по этой же причине. ИНФ-гамма отнесён к иммунным интерферонам, что соответствует его происхождению и основным функциям.

Таким образом, ИНФ представляют собой обширную группу белков, представляющих собой, в первую очередь, антивирусные свойства и все три основных ИНФ в той или иной степени вносят вклад в формирование в формирование первичной противовирусной защиты и в последующее развитие специфического иммунного ответа.
Активация системы ИНФ происходит в результате прикрепления к специфическим рецепторам на поверхности клеток. Существует два типа клеточных рецепторов для ИНФ – один тип для ИНФ-альфа/бета и второй тип – для ИНФ-гамма.

ИНФ 1-ого типа относятся к цитокинам, синтез которых свойственен большинству клеток и тканей организма. ИНФ-гамма синтезируется только централизованными клетками иммунной системы, включающими натуральные киллеры (NK-клетки), Т-хелперы и Т-супрессоры.
Наиболее обширным подклассом ИНФ 1-ого типа являются ИНФ-альфа, которые представляют собой целое семейство белков, кодирующихся классом генов, локализующихся в 9-ой хромосоме клеток человека. Общее число генов, кодирующих ИНФ-альфа, включая псевдогены, составляет 13. Гены ИНФ-бета представлены в геноме человека по 1 копии. ИНФ-гамма кодируется одним геном, локализованных в 21 хромосоме.

Молекула ИНФ-альфа2, включающая последовательность длиной 165 аминокислотных остатков, состоит из 7-альфа-спиральных доменов, 20 участков -структуры и -поворотов спирали, 2-х дисульфидных мостов.
Сердцевину молекулы ИНФ-альфа2 составляют 5 протяженных альфа-спиральных доменов. Рецепторсвязывающий сайт молекулы ИНФ-альфа2 локализуется преимущественно в N-концевой части молекулы, а ключевые аминокислотные остатки этого сайта идентифицированы в участке последовательности от 30 до 35 положения. Несмотря на точную локализацию рецепторсвязывающего сайта в молекуле ИНФ-альфа2, функционально активные пептидные аналоги этого цитокина до настоящего времени не испытывались и все отечественные и зарубежные препараты основаны на применении полноразмерного рекомбинантного ИНФ.
Для ИНФ-альфа2 характерны три типа фармакологической активности: противовирусная, антипролиферативная и противораковая, иммуномодулирующая. Рецепторсвязывающая и противовирусная активности ИНФ-альфа локализованы в N-концевой части молекулы. Антипролиферативная активность связана с С-концевой последовательностью пептидной связи.

Ннтерферон-бета оказывает множественные эффекты в организме и активирует ряд факторов и клеток, которые играют важную роль в развитии и становлении противовирусного иммунного ответа:
– повышение антигенной презентации молекул МНС 1 класса;
– ингибирование трансляции вирусных белков и угнетение вирусной репликации, за счёт индукции двух белков – дцРНК-зависимой протеинкиназы 2,5-олигоаденилатциклазы;
– активация НК-клеток;
– участие в процессах клеточной миграции;
– предотвращение развития механизмов, ведущих к апоптозу Т-клеток;
– повышение цитотоксичности Т-клеток;
– повышение активности других генов, таких как компоненты комплемента.

Среди семейства ИНФ, одним из наиболее важных представляется ИНФ-гамма в плане использования его для лечения и профилактики вирусных инфекций, учитывая тот факт, что многие особо патогенные вирусы являются сильными ингибиторами ИНФ 1-ого типа. Специфичные к ИНФ-гамма рецепторы локализуются на поверхности большинства клеток организма, но экспрессия этих рецепторов варьирует в различных клетках. Рецепторы с высокой степенью сродства локализованы на Т- и В-лимфоцитах, натуральных киллерах, моноцитах, макрофагах, фибробластов, нейтрофилах, эндотелиальных клетках и клетках гладкой мускулатуры.

Под влиянием вируса происходит активация макрофагов и Т-хелперов, что запускает процессы продукции ИНФ-гамма. В свою очередь, активированный ИНФ-гамма стимулирует выработку ряда факторов и цитокинов, необходимых для реализации противовирусного ответа.

Функции некоторых факторов:

• 1. Оксид азота играет ключевую роль в иммунологической защите как антимикробный и вирусный агент.
• 2. Хемокины выполняют функции «очищения» организма от вируса, так продукция ряда хемокинов стимулирует активацию натуральных киллеров и Т-клеток и их привлечение к сайтам репликации вируса.
• 3. Цитокины, такие как ИНФ-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12, определяют резистентность организма к вирусным инфекциям и участвуют в становлении потенциального цитотоксического ответа на ранних стадиях инфекции.

Усиление выработки ИНФ-гамма вызывает эффекты, направленные на нейтрализацию внутриклеточных вирусных и бактериальных антигенов. В табл. 1 систематизированы основные мишени и эффекты антивирусного действия ИНФ-гамма. [2 стр.97-102]
Таким образом, интерфероны обладают комбинированным эффектом: противовирусным широкого спектра действия и мощным иммуномодулирующим (иммуностимулирующим и индуцирующим неспецифическую защиту).

Суммируя вышесказанное, можно выделить основные биологические эффекты интерферонов в противовирусной защите:
1. Антивирусная защита, которая реализуется в результате активации двух основных белков:
– 2,5-олиго-А-синтетаза – деструкция вирусной матричной РНК.
– протеинкиназа – ингибирование синтеза белков.
2. Другие биологические эффекты ИНФ, которые позволяют организму противостоять инфекции или участвуют в процессе элиминации вируса и выздоровлении:
– повышение экспрессии молекул МНС 1 класса повышает антигенную презентацию и способность Тс-клеток распознавать и уничтожать инфицированные вирусом клетки;
– повышение экспрессии молекул МНС 2 класса, что увеличивает презентацию вирусных антигенов для СD4+ Т-хелперов;
– активация НК-клеток, которые уничтожают вирусинфицированные клетки;
– активация специфической и неспецифической активности макрофагов, что повышает резистентность к инфекции (специфическая активность) и способность уничтожать вирусинфицированные клетки (неспецифическая активность). [2 стр.102-103]

Таблица 1. Основные мишени и эффекты антивирусного действия ИНФ-гамма

Клетки-продуценты	Мишени	Эффекты	Результат
Th 1, Тс-клетки, НК-клетки	Все клетки	Ингибирование вирусной репликации	Иммунитет к вирусной инфекции
Th 1, Тс-клетки, НК-клетки	Иммунные клетки	Повышение экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости 1 и 2 классов.	Повышение антигенной презентации
Th 1, Тс-клетки, НК-клетки	В-клетки	Продукция IgG	Созревание антител
Th 1, Тс-клетки, НК-клетки	Тh2 клетки	Ингибирование пролиферации	Переключение на Th 1 ответ
Th 1, Тс-клетки, НК-клетки	Лейкоциты	Индукция миграции	Клеточная инфильтрация в очаге воспаления

В табл. 2 приводятся основные биологические эффекты интерферонов.

Таблица 2

Эффекты	ИНФ альфа и бета	ИНФ гамма
Индукция антивирусной защиты	+	+
Ингибирование клеточного роста	+	+
Индукция антигенов МНС 1 класса	+	+
Индукция антигенов МНС 2 класса	+/–	+
Активация моноцитов/макрофагов	+	+
Активация НК-клеток	+	+
Активация цитотоксических Т-клеток	+	+
Модуляция синтеза иммуноглобулинов	+	+
Индукция Fc рецепторов на моноцитах	–	+
Ингибирование невирусных внутриклеточных патогенов	–	+
Пирогенные эффекты	+	+

«+» – положительный эффект; «+/–»– слабый или непостоянный эффект;
«–» – отрицательный эффект.

3. Интерфероны. Роль ИНФ в системе иммунного ответа

Функционирование системы ИНФ складывается из строго следующих друг за другом этапов, представляющих своеобразную цепную реакцию организма в ответ на внедрение чужеродной информации.

Основные звенья данной цепочки:

• индукция или «включение» системы, приводящей к дерепрессии генов ИНФ, транскрипции их и-РНК с их последующей трансляцией;
• продукция – синтез клетками ИНФ-альфа, бета, гамма и секреция их в окружающую среду;
  действие – защита окружающих клеток от чужеродной информации (вирусы, бактерии и т.д.) вновь образованными ИНФ;
• эффекты – антивирусные, иммуномодулирующие, антитуморогенные, радиопротективные.

Основные биологические эффекты:

• подавление размножения внутриклеточных инфекционных агентов вирусной и невирусной природы (хламидии, риккетсии, бактерии, простейшие);
• антипролиферативная активность;
• антитуморогеннный эффект;
• антитоксическое действие;
• радиопротективный эффект;
• регуляция продукции антител;
• стимуляция макрофагов, усиление фагоцитоза;
• усиление цитотоксического действия сенсибилизированных лимфоцитов на клетки-мишени;
• активация естественных киллерных клеток;
• стимуляция освобождения гистамина базофилами;
• усиление синтеза простагландинами;
• усиление формирования антигенов главного комплекса гистосовместимости;
• усиление или ингибирование активности ряда клеточных ферментов;
• усиление цитотоксического действия двухнитевых РНК;
• подавление гиперчувствительности замедленного типа;
• многочисленные изменения клеточных мембран;
• стимуляция выработки факторов и молекул адгезии;
• индукция процессов дифференцировки и пролиферации лимфоцитов и макрофагов.

Существуют прямые связи интерферонов и иммунной системы. Интерфероны стимулируют фагоцитоз, активность естественных киллеров, экспрессию главного комплекса гистосовместимости. С другой стороны, они регулируют образование антител, развитие анафилактического шока, воспаление, гиперчувствительность замедленного типа, пролиферацию лимфоцитов, реакцию на трансплантат, реакцию связывания комплимента. [2 стр.104-105]
Также интерфероны можно рассматривать как своеобразные гормоны иммунной системы, не имеющие отличие от классических гормонов. Особенно много общего у ИНФ с пептидными гормонами, близкими к ним и по механизму действия (существования клеток-мишеней, прикрепление к определённым рецепторам, передача сигналов мембран, образование вторичных мессенджеров, феномен гипореактивности и т.д.), и по функциям (эндокринные эффекты, подобные адренокортикотропному гормону, лютеинезирующему гормону и др.) [3 стр.141]
Каскад внутриклеточных событий, наблюдающихся после внедрения вирусов, обусловлен индукцией образования ИНФ и последующим разрушением вирусных геномных и мРНК, связанных с действием 2,5-олигоаденилсинтетазы, приводящей к активации эндонуклеазы. Параллельно активированная протеинкиназа фосфорилирует альфа-субъединицу фактора инициации трансляции, после чего блокируется синтез вирусных белков. Всё это приводит к подавлению репродукции широкого спектра большинства ДНК- и РНК-содержащих вирусов за счёт прямого внутриклеточного антивирусного эффекта. Интерфероны обладают способностью ЕК и цитотоксические Т-лимфоциты.

В результате на первом этапе вирусного инфицирования локально осуществляются три взаимосвязанных события:

• 1. внутриклеточная ингибиция ИНФ репродукции вирусов;
• 2. удаление с помощью ЕК и ЦТЛ инфицированного материала;
• 3. защита вновь образованным ИНФ окружающих незаражённых клеток от возможного заражения;
• 4. в простейших случаях, когда болезнь вообще не развивается, РЦР ограничиваются этим первым этапом.

Однако далеко не всегда исход может быть столь быстрым и благоприятным, и описанные эффекты интерферонов оказываются явно недостаточными для прекращения инфекционного процесса. Подобное имеет место при большой множественности заражения, действии стрессов и пр. В результате развивается острое или хроническое инфекционное заболевание, сопровождающееся продукцией каскада цитокинов, активацией Т-клеток с последующим развитием специфического Т- и В-клеточного опосредованного иммунитета. Синтезируются фактор некроза опухолей, интерлейкины 1, 6, 10, 15 и 18, а также трансформирующий фактор роста.

Тогда второй этап РЦР представлен следующими механизмами:
1. продукция ИНФ альфа и бета;
2. активация ЕК- и ЦТЛ-клеток;
3. продукция ИНФ-гамма;
4. перераспределение лимфоцитов;
5. экспрессия генов ИЛ-1 и ФНО;
6. каскадная реакция продукции других цитокинов.

Совокупность описанных реакций может оказаться достаточной для прерывания инфекционного процесса. Всё это составляет важный механизм активации врождённого естественного иммунитета в ответ на вирусное заражение и принципиально отличается от реакции организма на действие других патогенов невирусной природы. [2 стр.107-108]

4. Интерфероны. Применение ИНФ в медицинской практике

Опыт клинического использования ИНФ выявил бесспорную эффективность данных препаратов, особенно для профилактики и лечения вирусных и некоторых онкологических заболеваний.
В последние годы отмечается стремительное расширение масштабов использования рекомбинантных ИНФ и сокращение применения природных препаратов, что связано с дефицитом и неоднородностью сырья для производства последних (донорская кровь) и дороговизной конечного продукта. [2 стр.115]

Таблица 3 Классификация наиболее широко используемых препаратов ИНФ

Типы ИНФ	Препараты
Природные (1 поколение)
Альфафероны	Человеческий лейкоцитарный ИФН (ЧЛИ), эгиферон, виллферон, лейкинферон
Бетафероны	Человеческий фибробластный ИНФ, ферон
Гаммафероны	Человеческий иммунный ИНФ (гамма ИНФ)
Рекомбинантные (2 поколение)
Альфа-2А	Реаферон, Роферон А, Виферо, Реальдирон
Альфа-2В	Интрон А, Инрек
Альфа-2С	Берофор
Альфа-2А-пэгилированный	Пегасис
Бета-ИНФ	Рекомбинантные бета-ИНФ (бета-фероны)
Гамма-ИНФ	Рекомбинантные гамма-ИНФ (гамма-фероны)

 

Иммуномодуляторная активность интерферонов проявляется, прежде всего, через его пространственную структуру: через первичную, вторичную, третичную. Изменение четвертичной структуры интерферонов приводит к тому, что организм воспринимает его как чужеродный агент и отвечает выработке антител, что снижает активность интерферонов. Инактивация в ЖКТ делает невозможным пероральное применение интерферонов. Препараты для парентерального введения получают методом лиофильной сушки, в качестве криопротектора используют сывороточный альбумин человека. Мазевые формы интерферонов в качестве гидрофильного носителя содержат гель алюминия гидроксида, в качестве загустителя и пленкообразователя – поливиниловый спирт, стабилизатора – сульфат декстарана. В суппозитории и мази с рекомбинантным интерферонами включены препараты антиоксидантного действия – альфа-токоферола ацетат и аскорбиновая кислота.
Существенным недостатком длительного применения рекомбинантных интерферонов является формирование антиинтерфероновых антител, появление которых сводит на нет трудоёмкую и дорогостоящую терапию. Кроме того, при индивидуальной непереносимости, передозировке или длительном применении интерферонов могут возникать побочные эффекты:

• гриппоподобный синдром (ухудшение общего состояния, повышение температуры тела, озноб, слабость и др.);
• транзиторная гипо- и гипертензия, отёчность, цианоз, аритмии и тахикардия;
  диспептические явления (потеря аппетита, тошнота, рвота, боли в животе);
• кожные высыпания и зуд кожи, крапивница, выпадение волос;
• лейко- и тромбоцитопения, снижение гемоглобина;
• расстройства периферической нервной системы и др.

Перечисленные побочные эффекты носят, как правило, транзиторный характер и быстро исчезают после отмены ИНФ.
Более серьёзный характер имеют осложнения при длительном применении препаратов ИНФ. Они связаны с нарушением функций щитовидной железы, угнетением костномозгового кроветворения, ишемическим колитом, ухудшением слуха, депрессивным синдромом. [2 стр. 116-118], [8], [10]

Таблица 4. Эффективность клинического использования препаратов ИНФ
при некоторых вирусных инфекциях

Нозологическая форма	Эффективность лечения
Герпес генитальный. Опоясывающий лишай	Заметное сокращение сроков рецидива, уменьшение болей, увеличение межрецидивных периодов.
Кератиты и кератоконъюктивиты (герпетические и аденовирусные). Цитомегаловирусная инфекция при СПИДе и после трансплантации почек и костного мозга	Местное назначение препаратов ИНФ снижает тяжесть и сокращает длительности заболевания. Профилактика цитомегаловирусных пневмоний и гепатитов.
ОРВИ	Для экстренной профилактики ОРВИ, особенно в группах риска (дети, лица пожилого возраста).
Вирусные гепатиты (острые и хронические формы гепатита В, С и D)	Выраженный клинический эффект. В тяжёлых случаях уменьшение интенсивности и продолжительности интоксикации. Снижение частоты летальных исходов до 60 %, неисчезновение маркеров вирусной репликации, нормализация показателей активности сывороточных трансаминаз.
Папилломавирусные инфекции	При местном использовании ИНФ наблюдается достоверный клинический эффект (исчезновение папиллом)
Генитальные бородавки и остроконечные кондиломы	Полное рассасывание бородавок через 6–10 недель после начала лечения (50–100 % случаев)
СПИД	Нормализация иммунологических параметров, снижение остроты течения инфекции.

5. Структура и свойства интерлейкинов

Интерлейкины – сравнительно короткие (около 150 аминокислотных остатков) полипептиды, участвующие в организации иммунного ответа. ИЛ представляют собой большую группу цитокинов (от ИЛ-1 до ИЛ-18), синтезируемых в основном T-клетками, но в некоторых случаях также мононуклеарными фагоцитами или другими тканевыми клетками. Интерлейкины обладают разнообразными функциями, но большинство их стимулирует другие клетки для деления или дифференцировки, при этом каждый из них действует на отдельную, ограниченную группу клеток, экспрессирующих специфичные для данного интерлейкина рецепторы. Функции интерлейкинов связаны с активностью других физиологически активных пептидов и гормонов: эндотелина, пролактина, брадикинина ИЛ активны при очень низких концентрациях и служат медиаторами иммунных и воспалительных реакций, обладают аутокринной, паракринной и эндокринной активностью, а также действуют как факторы роста и дифференцировки клеток, обладают полифункциональной активностью.
В настоящее время выделено более 20 ИЛ. На сегодняшний день наиболее изучены:

• ИЛ-1 – синтезируется макрофагами и другими антигенпрезентирующими клетками, естественными киллерами.
  – Является фактором роста и активации Т- и В-лимфоцитов, естественных киллеров, усиливает хемотаксис нейтрофилов и макрофагов.
  – Участвует в воспалении и гемопоэзе. К настоящему времени установлено влияние ИЛ-1 не только в отношении иммунокомпетентных клеток, но и в отношении адипоцитов, хондроцитов, эпителиальных клеток, ткани мозга, эндотелия сосудов, гепатоцитов, надпочечников (стимуляция выработки глюкокортикоицов), фибробласто.
• ИЛ-2 – фактор роста и созревания Т-лимфоцитов, синтезируется активированными Т-хелперами I типа.
  – Способствует активации Т-лимфоцитов и естественных киллеров;
• ИЛ-3 – гемопоэтический ростовой фактор, промотор ранних миелоидных клеток, синтезируемый Т-лимфоцитами;
• ИЛ-4 – Т- и В-клеточный ростовой фактор, промотор IgE-опосредованных реакций и роста тучных клеток. Синтезируется Т-хелперами II типа.
• ИЛ-5 – оказывает стимулирующее действие на В-лимфоциты и эозинофилы, синтезируется Т-хелперами II типа;
• ИЛ-6 – ростовой фактор В-лимфоцитов, активатор поликлональной продукции Ig.
  – Усиливает воспаление, синтезируется фибробластами;
• Ил-7 – синтезируется стромальными клетками, относится к лимфопоэтинам.
  – Стимулирует генерацию пре-В- и пре-Т-лимфоцитов;
• Ил-8 – усиливает хемотаксис нейтрофилов и Т-лимфоцитов, синтезируется макрофагами и др. антигенпрезентирующими клетками.

ИЛ реализуют эффект через рецепторы на поверхности соответствующих клеток-мишеней. Многие ИЛ проходят стадию клинического изучения, другие – нашли разнообразное применение в лечении инфекций, воспалительных, аутоиммунных и неопластических расстройств. Так, ИЛ-1 показан для лечения воспалений и септического шока, ИЛ-2 включен в схемы лечения имуногенных опухолей (меланомы, почечноклеточного рака, рака мочевого пузыря). [3 стр. 142], [7].

6. Интерфероны. Синтез различных классов интерферона человека в генетически сконструированных клетках микроорганизмов

Препараты интерферонов по способу получения классифицируют на:
а) природные: Интерферон альфа, интерферон бета, интерферон альфаNl;
б) рекомбинантные: Интерферон альфа2а, интерферон альфа2b, интерферон бета1b.

Рекомбинантные интерфероны получают генно-инженерным методом путем культивирования бактериальных штаммов, содержащих в своем генетическом аппарате встроенную рекомбинантную плазмиду гена интерферона человека.

Природные интерфероны получают в культуре клеток лейкоцитов донорской крови (в культуре лимфобластоидных и других клеток) под воздействием вируса-индуктора. [6 стр. 107].

Интерфероны. Получение рекомбинантных ИНФ.

Опыты по переносу генов ИФН человека в бактериальные клетки были начаты в конце 70-х годов почти одновременно в 3 научно- исследовательских группах.
Для клонирования гена ИНФ- альфа в качестве исходного материала использовали фракцию 12S поли (А) мРНК (информационная аденилированная РНК), полученную из клеток лейкоцитов, индуциро­ванных вирусом Сендай. На базе информационной РНК получена ком­плиментарная ей ДНК, состоящая из 2 цепей. Полученная двухслиральная ДНК была расцеплена с помощью рестритаз с образованием липкого конца олиго-dG. Аналогичная операция была проведена с плазмидой с образованием липкого олиго-дс-конца. С помощью лигаз осуществле­но встраивание комплиментарной ДНК, содержащей информацию о структуре а-ИФН в плазмиду pBR322 (рис. 3 2).

Эта плазмида несет в своем составе гены, определяющие устойчи­вость к двум антибиотикам: тетрациклину и ампицилину. Вставка ДНК интерферона инактивирует ген, ответственный за устойчивость к ампи­цилину, поэтому первичный отбор клеток, получивших гибридные плазмиды, идет по устойчивости к тетрациклину. [5 стр. 89-90].
В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.
В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.
Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.
Дрожжи рода Saccharomyces не патогенны для человека, имеют многовековой опыт их использования. Дрожжи не подвержены лизису, легко сепарируются, используют дешевые субстраты. Биомасса дрож­жей не содержит токсичных и пирогенных факторов. Весьма важным обстоятельством является также сходство секреторных механизмов дрожжей и высших эукариот, это позволяет предположить, что клониро­ванные гены смогут давать зрелый интерферон в результате правильно­го процессинга.

Отработана технология массового культивирования клеток- продуцентов рекомбинантного ИФН. Так для отечественного препа­рата « Реаферона» она включает: культивирование бактериального штамма-продуцента в ферментерах объемом 100 л с выходом 5-7×103 ME из 1 л культуральной жидкости, разрушение биомассы методом, по­зволяющим увеличить процесс с 60-70 %-ным выходом целевого про­дукта, предварительную очистку реаферона на иониообменнике и очи­стку препарата на иммуносорбенте с моноклональными антителами к лейкоцитарному ИФН-а типа 5АС. [5 стр. 90-91].

Экзогенный человеческий интерферон получают, используя технологию рекомбинантных ДНК.

Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем:

• – из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды;
• – полученным продуктом трансформируют E. coli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют;
• – каждую группу клонов гибридизируют с ИФН;
• – из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и РНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка;
• – определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН — мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН — кДНК человека.

Далее следуют:

• – осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим центрифугированием,
• – высаливание интерферона из супернатанта аммония сульфатом,
• – диализ осадка интерферона,
• – растворение интерферона, пропускание раствора через колонку с иммуносорбентом (пришитыми моноклональными антителами).
• – элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном катионообменнике.

После на­копления в специальных ферментерах достаточно высокой концентра­ции клеток их удаляют из ферментера и разрушают (лизируют). В каче­стве основных методов лизиса используют: осмотический шок, замора­живание-оттаивание, гомогенизирование, обработка детергентами. За­тем с помощью последовательных процедур фильтрования, центрифу­гирования, ионообменной хроматографии и гель-хроматографии проис­ходит предварительная очистка ИФН, дающая в итоге прозрачный бак­териальный экстракт, в котором ИФН все еще составляет не более 1-2% от общего количества белка. Окончательную очистку препарата проводят на им­муносорбенте с моноклональными антителами к ИФН.

Моноклональные антитела к ИФН » пришивают» к гранулам но­сителя и помещают в хроматографическую колонку (А). Затем наносят на колонку бактериальный экстракт, содержащий рекомбинантный интерферон. С антителами связывается лишь ИФН, другие же компоненты экс­тракта, в том числе все бактериальные токсины, свободно проходят че­рез колонку и удаляются промывным раствором (В). Для извлечения из колонки адсорбировавшийся на антителах рекомбинантный ИФН через нее пропускают элюирующий буферный раствор, имеющий слабо­кислую реакцию. При этом связь между молекулами ИФН и антителами нарушается . ИФН переходит с поверхности частиц сорбента в буфер­ный раствор и может быть собран в виде чистого вещества, не содержа­щего загрязняющих белков.

Бактерии с генами интерферона человека продуцируют специфический белок в количестве 200–250 мкг/л бактериальной суспензии. Кроме E. coli удается получать человеческий интерферон с помощью В. subtilis, способную секретировать синтезируемые белки в окружающую среду (у E. coli они накапливаются в периплазматическом пространстве), а такте с помощью Saccharomyces cerevisiae, растущих на средах с более дешевыми субстратами, на них не действуют фаги, они крупнее бактерий и преинтерферонов. Применяют также культуры бактерий из родов Methylomonas, Pseudomonas, Salmonella. Все названные микроорганизмы конструктивно (не адаптивно) образуют интерфероны, не отличающиеся от природных.

Стремительное расширение использования рекомбинантных ИФН и параллельное сокращение в последнее время применения природных препаратов связано, главным образом, с дефицитом сырья для производства последних (донорская кровь). Однако, на современном уровне рекомбинантные ИФН — это лишь воспроизведенные отдельные субтипы ИФН (продукты) одного гена, что сказывается на потенциале терапевти­ческой активности. Идеальный препарат должен, подобно природному, иметь их физиологически сбалансированное сочетание. [4 стр. 560-562].

Современные рекомбинантные препараты ИНФ.

• 1. Реаферон (человеческий рекомбинанттный ИНФ – альфа2)
  Получен при культивировании бактериального штамма Pseudomonas sporogenosa, содержащего в своём генетическом аппарате встроенную рекомбинантную плазмиду гена ИНФ-альфа2 человека. Предназначен для внутримышечного и местного применения. Порошок в ампулах.
• 2. Интрон А (человеческий рекомбинантный ИНФ – алюфа 2b)
  Получен по рекомбинантной ДНК- технологии с использованием бактериальных штаммов Е.coli, содержащих встроенный генно-инженерным путём ген, кодирующий этот человеческий белок. Во флаконах объемом по 1 мл/10 млн МЕ (1 доза), 3 мл/18 млн МЕ (6 доз по 3 млн МЕ), 2,5 мл/25 млн МЕ (5 доз по 5 млн МЕ); в пачке картонной 1 флакон.
• 3. Виферон.
  В состав препарата Виферон-суппозитории входят человеческий рекомбинантный (без использования компонентов донорской крови) интерферон-альфа-2b, витамины Е и С, основа (масло какао). Мазь для наружного и местного применения, Гель для местного применения, суппозитории для ректального применения. [5 стр. 97-97], [10].

интерфероны. Получение лейкоцитарных ИНФ.

Препарат ИНФ лейкоцитарный выпускается по Регламенту производства человеческого лейкоцитарного интерферона N ЗОЕ-82 и ряда изменений к нему. В качестве клеток-продуцентов интерферона используются лейкоциты человека, выделенные из донорской крови, лейкоцитарной или эритроцитарной массы. Для индукции интерферона используется вирус болезни Ньюкасла, вакцинный штамм «Н», в виде неочищенной вируссодержащей аллантоиеной жидкости. Весь технологический процесс проводят в колбах, матрацах или бутылях. Регламентом не предусмотрена очистка интерферона от балластных белков. Как показывает практика работы объединений и предприятий с большими объемами выпуска препарата, действующий Регламент более приемлем при производстве интерферона в малых объемах.

Технологическая схема получения ИНФ – альфа.

• ТП-1. Получение чистых лейкоцитов.
  Отделение плазмы от лейкоэритромассы центрифугированием, фракционирование лейкомассы в присутствие осадителя – метилцеллюлозы с последующим гемолизом. При этом образуется 3 слоя: раствор метилцеллюлозы с лейкоцитами (верхний слой), лейкоплёнка (средний слой) и осадок эритроцитов (нижний слой). 2 верхних слоя подвергают центрифугированию и ресуспендированию осадка в питательной среде.
• ТП-2. Прайминг (активирование метаболизма лейкоцитов) – 2-10 ч, 37,5оС.
  Лейкоциты 10-20 млн/мл в среде №199 с 5% плазмы донорской крови, 3 ед/мл гепарина, 0,0015 ед/мл инсулина, 200 МЕ/мл нативного ИНФ.
• ТП-3. Получение вируса индуктора. В качестве интерфероногенеза используют вакцинный штамм вируса Сендай. Предварительное культивирование вирусов проводят в развивающихся 9-11 суточных куриных эмбрионах. Основные технологические операции: овоскопия, отбраковка, инкубирование куриных эмбрионов, введение инфекционной взвеси в аллонтоинскую полость с последующим инкубированием в течение 48-72 ч и стягиванием инфицированной жидкости с погибших эмбрионов. Вируссодержащую аллантоинскую жидкость центрифугируют.
• ТП-4. Введение вируса- индуктора. Индукция 1 ч, 37,5оС.
  Введение вируса болезни Ньюкасла в дозе 5РЦД50 на 1 лейкоцит в реактор с лейкоцитами с последующим центрифугированием.
• ТП-5. Биосинтез. 18 ч, 37,5оС.
  Суспензионная культура в взвешенном слое. Оптимальные условия для получения высоких титров ИНФ создаются при культивировании лейкоцитов круглодонных колбах, накрытых фольгой, заполненных клеточной взвесью наполовину, при постоянном перемешивании. Инактивацию вируса-интерфероногена осуществляют доведением рН среды до 2,2-2,4 и экспозицией полуфабриката не менее 7 суток.
• ТП-6. Очистка ИНФ.
  Поэтапно: осветляющая, ультрафильтрация, стерильзующая фильтрация.
• ТП-7. Контроль полуфабриката ИНФ.
  Контроль на стерильность, противовирусную активность, специфическую безвредность, анализ на специфические примеси, токсичность, отсутствие микоплазм.
• ТП-8. Стандартизация препарата.
  Разведение препарата до требуемой специфической активности и доведения значения РН.
• ТП-9. Розлив препарата в ампулы.
  С помощью полуавтоматических дозаторов.
• ТП-10. Сублимационное высушивание.
  Замораживание препарата и сублимация. Запайка ампул с препаратом в атмосфере азота.
• ТП-11. Контроль готового препарата.
  Контроль на стерильность, противовирусную активность, токсичность, рН, растворимость, специфическую безвредность.

Очень важной операцией, определяющей качество готового препарата, является удаление из лейкоконцентрата примесей эритроцитов, которое осуществляется на стадии 1. На стадии прайминга ( стадия 2) лейкоконцентрат ресуспендируют в культуральной жидкости, которая помимо основных компонентов содержит некоторые белки сыворотки крови, без которых биосинтез ИФН практически не происходит.
После ресуспендирования лейкоциты индуцируют аллантоисными (без оболочки) вирусами болезни Сендай, добавляемыми из расчета 100-150 ГАЕ/мл (стадия 4). После инкубации при температуре 37,5°С, во время которой преимущественное значение имеет поддержание жиз­неспособности культур и высокого метаболизма клетки при постоянстве рН, клетки отделяют низкоскоростным центрифугированием (2 ООО об/мин.) в течение 40 минут. Осадок лейкоцитов ресуспендируют в пи­тательной среде и передают на стадию биосинтеза.
Оптимальные условия при выработке ИФН-а ( стадия 5) создают­ся при культивировании лейкоцитов при 37-37,5°С. Снижение темпера­туры инкубирования до 35°С и ниже, или, напротив, повышение ее до 38°С и выше приводило значительному ослаблению продукции ИФН- а.
ИФН-а может продуцироваться как в стационарных условиях культивирования, так и в культурах с постоянным перемешиванием кле­ток. Считается, что клетки во взвешенном состоянии более интенсивно вырабатывают ИФН-а. Большое значение для выживания клеток в сус­пензионных культурах имеет форма сосудов, высота слоя жидкости и достаточные количества кислорода в воздушной среде. Оптимальные условия для получения титров ИФН создаются при культивировании лейкоцитов в круглодонных колбах, накрытых фольгой, заполненных клеточной взвесью наполовину, при постоянном перемешивании. Пред­варительная обработка лейкоцитов малыми дозами ИФН-а приводила к увеличению выхода ИФН-а в 3-10 раз.
Активность интерферона в препаратах, полученных по вышеопи­санной технологической схеме, составляет 30-200 ООО ЕД/мл.
Аналогичные биотехиологические приемы лежат в основе получе­ния других препаратов природных ИФН, которые отличаются по приро­де клеток-продуцентов и индукторов:
ИФН-Р — клетки-продуценты Индукторы актиномицин
фибробласты циклогексимид
ИФН-у — лейкоциты от здоро­вых доноров Специфические антигены
стафилоккоковый энтеротоксин

В культуральиой жидкости, собранной с клеточной культурой и представляющей полуфабрикат ИФН, содержится значительное количе­ство примесей, в том числе и гетерологичных для человека (антигены вируса — индуктора, белки алантоисной жидкости и другие компоненты клеток-продуцентов), которые способны при введении вызвать побоч­ные реакции и осложнения (особенно при парентеральном введении). Отсюда становится очевидной необходимость очистки ИФН.

В последние годы для очистки природных ИФН, как для клиниче­ских испытаний, так и для изучения биологических свойств, широко ис­пользуется высокоэффективный метод жидкостной хроматографии. При этом смесь белков адсорбируются на каком-либо твердом носителе, а затем элюируются растворителем, при этом различные компоненты сме­си элюируются с разной скоростью. Все активнее для очистки ИФН внедряются методики афинной хроматографии.
Донорская кровь, компоненты которой — лейкоциты, плазма, предназна­чена для получения природных препаратов ИФН допускается к перера­ботке только при отрицательных результатах контроля на СПИД, гепа­титы В и С, сифилис и другие инфекционные заболевания. Для повышения безопасности препаратов ИФН на базе донорской крови в процессе производства используются методы химической инактива­ции, при чем она должна строиться на использовании не менее двух дезинфектантов с различным механизмом действия. [5 стр. 85-89]

Полученный препарат после высушивания имеет вид пористого порошка серовато-белого цвета, хорошо растворимый в воде. Тот и другой интерфероны должны быть стерильными.
Семейство ИФН-а содержит около 20 подтипов, поэтому природ­ные препараты — Человеческий лейкоцитарный интерферон, Эгиферон, Вэлферон многокомпонентны и содержат все или по крайней мере большинство из подтипов. Кроме того, природные ИФН не обладают антигенными свойствами и не вызывают сенсибилизации при длитель­ном многократном введении. Некоторые рекомбинантные ИФН, напро­тив, при введении инъекционным путем могут вызвать образование ней­трализующих или связывающих антител.

Наиболее часто используются рекомбинантные ИФН-а2а (Реафе- рон, Роферон), ИФН-а2Ь (Интрон А, Реальдирон) и ИФН-а2с (Берофор), являющиеся аналогами природных подтипов с точечными мутациями в белковой структуре lis-his, arg-his, arg-arg, соответственно, которые мало влияют на активность, но существенны с точки зрения сенсибилизации. Так препараты ИФН-а2а, не являющиеся характерными для человече­ской популяции, имеют большой риск вызвать сенсибилизацию и обра­зование антител, которые в высоких титрах будут снижать их терапев­тический потенциал. [10], [7], [9],

Заключение
В настоящее время описано более десятка цитокинов, включая интерфероны и интерлейкины. На примере рассмотренных видов ИНФ и ИЛ видна сложность регуляторных механизмов, включающихся в управление взаимодействиями клеток иммунной системы.
К числу используемых в качестве лекарственных средств видоспецифических белков относятся интерфероны – факторы врождённого иммунитета, открытые в своё время как белки, вырабатываемые клетками, заражёнными вирусами. Они индуцируют локальные и системные противовирусные реакции в других клетках и, соответственно, используются как противовирусные препараты. Различают альфа-, бета-, гамма- интерфероны, образуемые соответственно лейкоцитами, фибробластами соединительной ткани и Т-лимфоцитами. Интерфероны обладают видотканевой специфичностью. Это означает, что интерферон человека действует только в организме человека, но неактивен в организме других биологических видов. Интерфероны оказывают антивирусное, противоопухолевое, иммуномодулирующее и многие другие действия. Интерфероны применяются для профилактики и лечения ряда вирусных инфекций. Их эффект определяется дозой препарата, однако высокие дозы интерферона оказывают токсическое действие.
Как медицинский препарат использовался, главным образом, лейкоцитарный интерферон. Его источником служила кровь, получаемая из родильных домов. В настоящее время ген лейкоцитарного интерферона получен химическим синтезом. Затем он был включен в плазмиды, которые в свою очередь были введены в клетки кишечной палочки и дрожжей, ставшие таким образом продуцентами лейкоцитарного интерферона человека.

Список литературы
1. Биотехнология. Принципы и применение / Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джойса. – М: Мир, 1988. – 480 с.
2. Деева Э.Г. Иммуно- и нанобиотехнология: Учебное пособие / Э.Г. Деева, В.А. Галынкин, О.И. Киселев, Н.А. Заикина, Н.Д. Бунятян, В.И. Кочеровец, А.В. Гарабаджиу. – СПб.: «Проспект Науки», 2008. – 216 с.
3. Егоров Н.С, Олескин А.В, Биотехнология. Проблемы и перспективы. Учеб. пособие для вузов, М.:, 1987. – 159 с.
4. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. / Н.П. Елинов. – СПб.: «Наука», 1995. – 600 с.
5. Основы биотехнологии лекарственных препаратов. Учебное пособие для студентов, обучающихся по специальности 060108 (04050000) «Фармация». Пермь,2006. — 257 с.
6. Прищеп Т.П. Основы фармацевтической биотехнологии: учебное пособие / Т.П. Прищеп, B.C., Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева, Л.С. Белова. – Ростов на Дону: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006. – 256 с.