Иммуноглобулины человека, характеристика. Сыворотки крови

Иммуноглобулины человека, характеристика. Сыворотки крови

Введение
Иммуноглобулины. Характеристика
Сыворотки крови
Вирусная безопасность препаратов крови
Иммуноглобулины. Производство иммуноглобулинов
Производство сыворотки крови
Заключение
Литература
Введение

Иммунобиотехнология — это раздел современной биотехно­логии, представленной как научными достижениями, так и ди­намично развивающимся технологическим производством диа­гностических, профилактических и лекарственных средств с при­менением в качестве действующего начала разных агентов и про­цессов иммунной системы.
В наше время очень важную роль играют препараты крови. Так как они имеют широкий спектр применения в медицине, очень важно иметь представление о их качестве, характеристиках и области их применения.

Цель работы: изучить препараты крови в частности Сыворотки крови и иммуноглобулины.

Задачи:
1. Изучить характеристики, строение и классификацию иммуноглобулинов.
2. Изучить характеристики и классификацию сыворотки крови.
3. Выяснить что такое вирусная безопасность препаратов крови и какими методами она достигается.
4. Разобрать способы производства иммуноглобулинов и сывороток крови.

Иммуноглобулины. Характеристика 

Иммуноглобулины – это группа близких по химической природе и свойствам глобулярных белков человека, которые обычно обладают свойствами антител, т.е. специфической способностью соединяться с антигеном, который стимулирует их образование. Иммуноглобулины продуцируются В-лимфоцитами и находятся либо в свободном виде в крови, либо в виде рецепторов на поверхностных мембранах клеток.

Иммуноглобулины. Классификация

Классификация иммуноглобулинов на основе типа тяжелой цепи:

  • 1. Иммуноглобулин G (IgG).
    Является основным иммуноглобулином сыворотки здорового человека (составляет 70-75 % всей фракции иммуноглобулинов), наиболее активен во вторичном иммунном ответе и антитоксическом иммунитете. Благодаря малым размерам (коэффициент седиментации 7S, молекулярная масса 146 кДа) является единственной фракцией иммуноглобулинов, способной к транспорту через плацентарный барьер и тем самым обеспечивающей иммунитет плода и новорожденного. В составе IgG 2-3 % углеводов; два антигенсвязывающих Fab-фрагмента и один FC-фрагмент. Fab-фрагмент (50-52 кДа) состоит из целой L-цепи и N-концевой половины H-цепи, соединённых между собой дисульфидной связью, тогда как FC-фрагмент (48 кДа) образован C-концевыми половинами H-цепей. Всего в молекуле IgG 12 доменов (участки, сформированные из β-структуры и α-спиралей полипептидных цепей Ig в виде неупорядоченных образований, связанных между собой дисульфидными мостиками аминокислотных остатков внутри каждой цепи): по 4 на тяжёлых и по 2 на лёгких цепях.
  • 2. Иммуноглобулин M (IgM).
    Представляют собой пентамер основной четырехцепочечной единицы, содержащей две μ-цепи. При этом каждый пентамер содержит одну копию полипептида с J-цепью (20 кДа), который синтезируется антителообразующей клеткой и ковалентно связывается между двумя соседними FC-фрагментами иммуноглобулина. Появляются при первичном иммунном ответе B-лимфоцитами на неизвестный антиген, составляют до 10 % фракции иммуноглобулинов. Являются наиболее крупными иммуноглобулинами (970 кДа). Содержат 10-12 % углеводов. Образование IgM происходит ещё в пре-B-лимфоцитах, в которых первично синтезируются из μ-цепи; синтез лёгких цепей в пре-B-клетках обеспечивает их связывание с μ-цепями, в результате образуются функционально активные IgM, которые встраиваются в поверхностные структуры плазматической мембраны, выполняя роль антиген распознающего рецептора; с этого момента клетки пре-B-лимфоцитов становятся зрелыми и способны участвовать в иммунном ответе.
  • 3. Иммуноглобулин A (IgA).
    Сывороточный IgA составляет 15-20 % всей фракции иммуноглобулинов, при этом 80 % молекул IgA представлено в мономерной форме у человека. Секреторный IgA представлен в димерной форме в комплексе секреторным компонентом, содержится в серозно-слизистых секретах (например в слюне, слезах, молозиве, молоке, отделяемом слизистой оболочки мочеполовой и респираторной системы). Содержит 10-12 % углеводов, молекулярная масса 500 кДа.
  • 4. Иммуноглобулин D (IgD).
    Составляет менее одного процента фракции иммуноглобулинов плазмы, содержится в основном на мембране некоторых В-лимфоцитов. Функции до конца не выяснены, предположительно является антигенным рецептором с высоким содержанием связанных с белком углеводов для В-лимфоцитов, еще не представлявшихся антигену. Молекулярная масса 175 кДа.
  • 5. Иммуноглобулин E (IgE).
    В свободном виде в плазме почти отсутствует. Способен осуществлять защитную функцию в организме от действия паразитарных инфекций, обуславливает многие аллергические реакции. Механизм действия IgE проявляется через связывание с высоким сродством (10−10М) с поверхностными структурами базофилов и тучных клеток, с последующим присоединением к ним антигена, вызывая дегрануляцию и выброс в кровь высоко активных аминов (гистамина и серотонина — медиаторов воспаления) 200 кДа.

Таблина1. Функции и содержание иммуноглобулинов в крови.

Иммуноглобулин

Содержание в крови, г/л

Функция

IgG

12

Поздние антитела

IgA

3,5

Антитела, защищающие слизистые оболочки

IgM

1,3

Ранние антитела

IgD

0,03

Рецепторы В-лимфоцитов

IgE

<0,01

Ответ на появление аллергена

Иммуноглобулины. Функции иммуноглобулинов.

Антитела синтезируются B-лимфоцитами в ответ на появление антигенов в организме позвоночных или человека. В работе иммунной системы антитела участвуют в нескольких процессах:

  • 1) предотвращение попадания чужеродных (в том числе и патогенных) молекул в клетки и их разрушение за счет образования комплексов с антителами,
  • 2) стимуляция уничтожения чужеродных объектов макрофагами и другими клетками путем взаимодействия антител с их поверхностными антигенами (опсонизация),
  • 3) запуск механизмов разрушения чужеродных частиц за счет стимуляции иммунного ответа (активация системы комплемента).

Иммунологические свойства
Иммуноглобулины содержат полноценные опсонизирующие и нейтрализирующие антитела против возбудителей различных инфекционных заболеваний. В первые 24 часа после внутривенного введения 30% антител из системы циркуляции распределяются в экстрациркулярных пространствах. Период полувыведения антител варьирует в зависимости от индивидуальных особенностей и составляет в среднем 3 недели.

Иммуноглобулины. Строение иммуноглобулинов
Молекулы иммуноглобулинов симметричны. Они построены из «легких» (около 220 аминокислотных остатков) и «тяжелых» (450-600 аминокислотных остатков) полипептидных цепей (соотвенно L-цепи и Н-цепи),  скрепленных  дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями.

В антителах человека обнаружено два вида легких цепей (с и l) и пять видов тяжелых цепей (g, m, a, d и e), отличающихся аминокислотной последовательностью. При обозначении иммуноглобулинов в ниж. Индексах греческих букв цифры показывают, сколько цепей содержится в молекуле. Тяжелые цепи, характерные для каждого из классов и подклассов иммуноглобулинов, содержат по одному или более олигосахаридному фрагменту.

Рис.1. Строение иммуноглобулина G.

Строение иммуноглобулина G. иммуноглобулины

1– легкая цепь; 2 – тяжелая цепь; 3 – гипервариабельные участки; 4 – шарнирная область; 5 – остаток олигосахарида; 6 – N-концы; 7 – С-концы; VL и VH – соотв. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей; CH1, CH2 и СH3 – постоянные домены тяжелой цепи; пунктиром обведены Fab- и Fc-фрагменты.

Легкие и тяжелые пептидные цепи каждого класса иммуноглобулинов построены из двух основных областей – вариабельной, в среднем она равна у легких цепей 108, а у тяжелых 120 аминокислотным остаткам.

Основные различия между вариабельными областями антител разной  специфичности сосредоточены в определенных положениях полипептидной цепи – гипервариабельных участках; их четыре в тяжелых и три в легких цепях. Эти участки принимают участие в контакте с антигеном, что и определяет специфичность антител. Постоянные области цепей иммуноглобулинов кодируются одним геном (для каждого класса и подкласса). Молекулы иммуноглобулинов связанные с поверхностью лимфоцитов, имеют дополнительные гидрофобные «хвосты» на С-концах тяжелых цепей, которые встроены в мембраны клеток. Пептидные цепи иммуноглобулинов и ряда белков клеточных мембран (антигены гистосовместимости, рецепторы для антигенов Т-лимфоцитов) по своей первичной структуре сходны между собой, что указывает на общее эволюционное происхождение всех этих белков. Отрезки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов примерно в ПО аминокислотных остатков свернуты в относительно независимые компактные глобулы (домены), каждый из которых содержит один дисульфидный мостик; легкие цепи содержат два домена (вариабельный и постоянный), тяжелые – четыре или пять (в зависимости от класса иммуноглобулинов), один из которых вариабельный.

По данным рентгеноструктурного анализа, основной тип укладки цепи в доменах соответствует антипараллельной b-структуре. Посредине тяжелых цепей иммуноглобулинов имеется так называемая шарнирная область с межцепьевыми дисульфидными связями (у IgG и IgA между первыми и вторыми доменами), длины которых неодинаковы у разных подклассов этих белков. Шарнирная область чувствительна к протеолитическим  ферментам.
При расщеплении ими иммуноглобулин распадается на два идентичных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент.

Fab-Фрагмент слагается из четырех доменов. Два из них принадлежат легкой цепи, два других – N-концу тяжелой цепи. Fab-Фрагменты сохраняют способность к связыванию с антигеном.
Fc-Фрагмент состоит из четырех или шести доменов  двух тяжелых цепей и определяет такие свойства иммуноглобулинов, как связывание им комплемента, возможность проникать через плаценту, присоединяться к клеткам и фиксироваться в коже.
Благодаря высокой подвижности в шарнирной области, Fab- и Fc-фрагменты обладают определенной свободой вращения относительно друг друга. Такая гибкость позволяет молекулам иммуноглобулинов оптимально присоединяться к антигенам, имеющим разное пространственное строение. Область, контактирующая с антигеном (паратоп, или активный, антигенсвязывающий центр), располагается на N-конце Fab-фрагментов; она представляет собой более или менее глубокую полость, стенки к-рой сформированы аминокислотными остатками гипервариабельных участков легкой и тяжелой цепей. У антител, связывающих белки и полисахариды, в полость может входить до 6-7 остатков аминокислот или моносахаров. У молекул IgG, IgD, IgE и IgA (молекула IgA построена подобно молекуле IgG) 2 активных центра, у молекул IgM – 10.

Комплекс с антигеном образуется в результате не ковалентных связей, характер, которых может варьировать в зависимости от специфичности антитела. Сила связывания с антигеном увеличивается на несколько порядков, если молекула антитела реагирует сразу с двумя областями связывания с одной молекулы антигена. Каждая молекула иммуноглобулина состоит из двух идентичных легких и двух тяжелых цепей. При расщеплении папаином молекула иммуноглобулина распадается на три части – два идентичных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент.

Сыворотки крови

Сыворотка крови – жидкая часть крови без форменных элементов и фибрина, образующаяся в процессе их отделения при свертывании крови вне организма. Сыворотка крови содержит агенты приобретенного иммунитета.
Фибриноген — бесцветный белок, растворённый в плазме крови. При активации системы свёртывания крови подвергается ферментативному расщеплению ферментом тромбином, образующийся фибрин-мономер под действием активного XIII фактора свёртывания крови полимеризуется и выпадает в осадок в виде белых нитей фибрина-полимера.
Эта группа препаратов предназначена для образования пассивно­го иммунитета (специфической иммуностимуляции), которые содержат поликлональные антитела против инфекционных агентов и микробных токсинов. При введении сыворотки больному его организм получает уже готовые анти­тела.

На сегодняшний день сыворотка крови широко используется в качестве основного действующего вещества лекарственных препаратах от большинства инфекционных заболеваний (гриппе, дифтерии, столбняке) и отравлениях (ботулотоксин, яды змей).  Сыворотка, которая иммунизирована антигенами, используемая для производства лекарств, может вызывать аллергию из-за содержания в ней чужеродных белков. В данном случае имеет место сывороточная болезнь. Для клинической практики используется как свежая сыворотка крови, как и заранее замороженная или высушенная.

Сывороточная болезнь — это состояние, развивающееся при лечении иммунными сыворотками животного происхождения. Представляет собой иммунную реакцию на введение чужеродных белков сыворотки, заключающуюся в образовании большого количества связывающих их антител плазмоцитами организма человека. Данная реакция является частным случаем гиперчувствительности III типа. Антитела человека связывают чужеродные белки, образуя иммунные комплексы. При этом фагоцитоз и комплемент-зависимый лизис комплексов антиген-антитело происходит медленно, позволяя им оказывать повреждающее действие на организм.
Основные области применения сывороток:
профилактика и лечение инфекционных заболеваний;
в случае отравления ядами микробов или животных — при столбняке, бутулизме, дифтерии;
при укусах змей — для инактивации экзотоксинов в ядах коб­ры, гадюки и др.;
для диагностических целей (создание разных диагностических наборов, например в тестах на определение беременности).

Классификация данных препаратов идет соответственно области их применения:
1. Дифтерийный анатоксин
2. Столбнячный анатоксин
3. Cыворотка крови против змеиного яда
4. Ботулиновый анатоксин
5. Антигангренозная сыворотка

Сыворотки иммунные диагностические (диагностические антисыворотки)  – иммунные сывороткики, содержащие антитела против одного (моновалентные, моноспецифические) или нескольких (поливалентные, полиспецифические) антигенов. Получают путем иммунизации животных (кроликов и др.) известными полноценными антителами. Технология изготовления зависит от типа сывороток (агглютинирующие, преципитирующие, иммунофлюоресцентные и др.) и вида антигена. По достижении необходимого титра животных обескровливают, получают с-ку, в случае необходимости адсорбируют групповые антитела, определяют титр, стерилизуют, контролируют. Лучше пользоваться С.и.д., изготовленными производственным путем и прошедшими государственный контроль. С.и.д. применяют для идентификации возбудителей, как тест-с-ки в серол. реакциях, для установления групп крови и т. д. Хранят в темном месте при +4 -+6°С.

Сыворотки иммунные лечебно-профилактические – сыворотки крови животных и человека, содержащие антитело против бактерий (антибактер.), вирусов (противовирусные), экзотоксинов (антитоксические), ядов змей, пауков и др. Готовят из крови гипериммунизированных животных (обычно лошадей, мулов, буйволов), здоровых людей, в прошлом перенесших инфекционное заболевание (в крови таких людей содержатся Ат против его возбудителя) или специально иммунизированных людей-доноров. Сыворотки животных в целях удаления балластных белков обрабатывают протеолитическими ферментами и диализуют (диаферм-с-ки) или из них получают препараты глобулина. Из сывороток людей в настоящее время изготовляют гамма-глобулины (см.) или др. препараты такого типа. Активность сывороток зависит от титра антитела и их авидности. Ее определяют в опытах защиты на животных или в пробирочных реакциях и выражают в ед. Хранят сыворотки в темноте при +3 -+10°С. Используют для лечения и предупреждения инфекционных заболеваний или токсикозов (при дифтерии, столбняке, ботулизме, анаэробной газовой инфекции, оспе, краснухе, гриппе, бешенстве, укусе змей, ядовитых пауков и др.). Вводят подогретыми до температуры тела внутримышечно, реже – подкожно; специальные препараты Можно использовать внутривенно. Перед введением сывороточные препараты осматривают. В норме они представляют собой прозрачную или слегка опалесцирующую желтоватого цвета жидкость. Сыворотки, содержащие осадок, хлопья, частицы, поврежденное стекло, не имеющие этикеток, с истекшим сроком годности, к употреблению непригодны.

Сыворотки монорецепторные – иммунные сыворотки, содержащие антитело к видовым или вариантным антигенам. Получают гибридомной технологией (моноклоналъные Ат) или из поливалентных сывороток путем адсорбции групповых антител (адсорбированные сыворотки). Применяют для идентификации микробных организмов.

Сывороточный агар – элективная среда для выращивания стрептококков и других бактерий. Для его приготовления к расплавленному и охлажденному до 48°С 2,5% МПА, рН 7,4, приливают 15 – 20% лошадиной или бычьей сыворотки, осторожно, предупреждая вспенивание, размешивают и разливают по чашкам Петри. Контролируют на стерильность.
Вирусная безопасность препаратов крови
Компоненты крови, применяемые для переливания в клиниках, а также используемые для производства препаратов, сохраняют опасность заражения больных вирусами инфекционных заболеваний. Это связано с тем, что скрытый период вирусоносительства невозможно определить даже современными методами исследования крови доноров.

С целью обеспечения вирусной безопасности гемокомпонентов можно применять такие методы как:

  • 1. Карантинизация свежезамороженной плазмы.
    Метод карантинизации заключается в хранении плазмы при температуре – 30 – 40С с запретом использования ее на протяжении 6 месяцев до повторного обследования крови донора на отсутствие инфекций.
    Абсолютной эффективности карантинизации для плазмы ожидать не приходится, поскольку диагностические методы не обеспечивают гарантированного выявления инфицированных доноров в период сероконверсии. Неизбежны также технические ошибки, нет уверенности, что каждый донор после кроводачи будет находиться в поле зрения медиков.
  • 2. Обработка с помощью растворителей с детергентами (C/D метод).
    Представляет собой химический процесс, при котором осуществляется инактивация вирусов посредством разрушения структуры липидной оболочки. Используемые в процессе растворители и детергенты разрушают липидный покров вируса, препятствуя сцеплению его с клеткой-мишенью и лишая инфектогенности. Для этой цели применяют растворитель три-Н-бутилфосфат (TNBP) в сочетании с детергентом (“Полисорбатом 80” и холатом натрия). Имеются обширные данные, которые доказывают эффективность использования этого метода против вирусов гепатита В, гепатита С и ВИЧ при производстве препаратов иммуноглобулина и антигемофилических факторов. Остаточные количества химических средств, используемых в этом процессе, удаляются из конечного продукта ультрафильтрацией, диафильтрацией или колоночной хроматографией.
  • 3. Инкубирование при низких значениях pH.
    Одна из стадий процесса производства препарата иммуноглобулина для внутривенного введения. Низкие значения pH, инкубирование в течение 21 суток при температуре от 210С до 270С приводит к инактивации вирусов, имеющих липидную оболочку, без повреждения иммуноглобулинов.
  • 4. Тепловая обработка.
    Способ инактивации, при котором инфекционность вирусов ликвидируется посредством их тепловой денатурации. Применяют нагревание в растворе (пастеризация при 600С в течение минимум 10 часов), так и нагревание в высушенном виде при 800С в течение 72 часов. Выбор способа зависит от термолабильности белкового продукта. Некоторые препараты подвергаются как влажной, так и сухой тепловой обработке в герметичной упаковке, что позволяет снизить риск контаминации. На эффективность сухой тепловой обработки оказывают влияние содержание остаточной влаги и присутствие инертных наполнителей.
  • 5. Фильтрования.
    Методы фильтрования обладают преимуществом снижения концентрации потенциальных вирусов ввиду отсутствия неблагоприятного воздействия на структуру белков. Метод глубинной фильтрации иммуноглобулина для внутривенного введения эффективен для удаления вирусов, имеющих оболочку, так и вирусов без оболочек.

Разработаны новые типы фильтров (“PALL”, ФРГ; “PLANOVA”, Япония), которые рекомендуются для удаления вирусов из биологических растворов.
Несомненный интерес представляет выпущенный на рынок фирмой “CUNO” фильтр ЗЕТА-ПЛЮС серии VR. Монолитный глубинный фильтрующий материал, несущий положительный электрокинетический заряд, задерживает вирусы, благодаря их анионобменной адсорбции на стенках структурных каналов и механическому удалению в микроскопических полостях.
Предложен новый процесс “BIOCIDE FILTRATION”, основанный на глубинной фильтрации биологических жидкостей через материал, содержащий иммобилизованный йод (поливинилпирролидонйод). Свободный иод активно воздействует на микроорганизмы в процессе прохождения через фильтр, резко снижая вирулентность обрабатываемого материала.
Йод давно известен в качестве средства, инактивирующего все типы микроорганизмов: бактерии, вирусы, грибы. Несмотря на то, что молекулярный йод плохо растворим в воде, йодсвязывающие полимеры, такие как крахмал или поливинилпирролидон, создают резервуар йода, постепенно освобождающегося в водную среду. Однако пропускающая способность таких полимеров невелика, и они мало пригодны для промышленной хроматографии.
Комплекс Йод/Сефадекс представляет новый эффективный путь для доставки антивирусного агента при хроматографии больших объемов белкового раствора. Процесс экономичен и легко воспроизводим при любом производственном объеме. Основное количество йодистого содержимого удаляется на захватывающей колонке, остаточные реактивы могут быть легко удалены с помощью диафильтрации или дополнительных хроматографических ступеней на дальнейших стадиях производственного процесса.
Другой подход к химической инактивации состоит в использовании таких агентов, как трицианат натрия. Этот метод удачно применен для концентрата фактора IX, который достаточно стабилен при такой обработке.

Безопасность препаратов является не только следствием использования методов удаления и инактивации вирусов, но и результатом сочетания таких мер, как тщательный отбор доноров, тестирование плазмы донорской крови, строгих требований к хранению запасов. Необходимо следование точному описанию регулируемых производственных процессов, содержащемуся в GMP.

Иммуноглобулины. Производство иммуноглобулинов

Иммуноглобулины получают из пула плазмы крови здоровых доноров, отбор которых, а также процедура взятия крови осуществляется в соответствии с рекомендациями ВОЗ и Европейскими требованиями.
Индивидуальные порции плазмы, используемые для производства Иммуноглобулина, тестируются на отсутствие антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вирусу гепатита С и поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg).
В основе технологии производства Иммуноглобулина лежит метод спиртового фракционирования по Кону. Проводится вирусная инактивация и удаление примесей в процессе преципитации, фильтрации, диафильтрации и ультрафильтрации. Последовательные этапы вирусной инактивации позволяют получить препарат, очищенный от известных оболочечных и безоболочечных вирусов.
Препарат содержит 9—11% белка, не менее 98% белка составляет гаммаглобулин, 90% которого находится в виде мономера. Распределение подклассов IgG в препарате такое же, как в нормальной плазме. IgA и IgM присутствуют в следовых количествах. Препарат представляет собой прозрачную или слабо опалесцирующую жидкость, бесцветную или слабо-желтой окраски.

Иммуноглобулины. Методы получения иммуноглобулинов.

1. Фракционирование этанолом.
Пять основных белков были сконцентрированы в пяти последовательных фракциях ступенчатым осаждением путем увеличения концентрации этилового спирта: фибриноген (фракция I), g-глобулины (фракция ІІ), обогащенные липидами b-глобулины (фракция ІІІ), a-глобулины (фракция IV) и альбумин (фракция V). Фракция II+III, полученная по методу E. J. Cohn, стала исходным материалом для большинства технологий выделения. Дальнейшее фракционирование фракции II+III может продолжаться при помощи этилового спирта или других осаждающих агентов, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или каприлат. H. F. Deutsch и др. удалось увеличить выход IgG во фракции ІІ при применении пониженной ионной силы для осаждения фракции III.
В общем, выход IgG при фракционировании этиловым спиртом составляет примерно 3,5–4,2 г/л плазмы, так как 40–50% IgG остается (теряется) в надосадочных фракциях, которые не содержат IgG, или соосаждаются, т.е. также теряются с примесями. Приблизительно 5–10% соосаждается с фракцией I, 5–10% обнаруживается в надосадочной фракции II+III (фракция альбумина) и приблизительно 20% теряется с фракцией ІІІ. В дальнейшем на этапах от фракции ІІ до конечного препарата IgG еще 5–10% утрачивается в зависимости от разработанного процесса.
Практически все этапы осаждения должны проводиться при температуре ниже точки замерзания, чтобы избежать денатурирования белков. Это рассматривается как главный недостаток технологии фракционирования этиловым спиртом в дополнение к весьма низкому выходу.

Рис.2. Схема спиртового фракционирования плазмы по методу Кона.

Схема спиртового фракционирования плазмы по методу Кона

Рис.3. Схема спиртового фракционирования по Онкли.

Схема спиртового фракционирования по Онкли

 

2. Хроматографическая очистка.

Наиболее часто встречающимся методом очистки IgG от сопутствующих белков плазмы крови, таких как IgA, IgM, альбумин, фибриноген и прекалликреин, является анионообменная хроматография. С ее помощью также можно удалить высокомолекулярные агрегаты.
Основное внимание уделяется IgG подкласса 4, которые имеют тенденцию связываться с активными группами сорбента. На этом этапе в оптимизированных условиях можно добиться достаточно высокого выхода IgG (~ 95%).
Главной целью этих процессов было превышение среднеотраслевого показателя выхода IgG 3,5 г/л плазмы, обеспечиваемого фракционированием спиртовым методом E. J. Cohn. Кроме того, использование этилового спирта, как необходимого агента, вызывало денатурацию белков и формирование агрегатов, а так же превращало весь процесс в потенциально пожаро- и взрывоопасный.

Применение анионообменной хроматографии, как первого этапа очистки IgG, позволило повысить выход белка на 32% и довести его до уровня 4,6г/л плазмы.
Катионообменная хроматография достаточно часто служит средством дополнительной очистки IgG в комбинации с анионообменной хроматографией, что обеспечивает умеренный выход целевого продукта.
Однако при непосредственном использовании плазмы в хроматографических процессах, рН и ионная сила самой плазмы мало соответствуют оптимальным условиям нанесения плазмы на анионо- или катионообменную колонку. В таком случае возможно использование двух путей оптимизации условий: мембранная диафильтрация с доведением рН и исключающей по размеру хроматографии в части полной замены буфера. Проведение мембранной диафильтрации цельной плазмы весьма затруднено из-за ее значительной вязкости.
Разбавление плазмы для ускорения процесса приводит к увеличению денатурации белков и существенному замедлению первого этапа, к значительному удорожанию процесса. Процесс замены буфера на исключающей по размеру хроматографической колоне достаточно дешевый, быстрый (один цикл составляет максимум 45 мин) и мало денатурирующий.
Исключающая по размеру хроматография является незаменимой для заключительной фазы разделения и обеспечивает разделение различных форм IgG (моно-, ди- и полимеров) по соответствующим им размерам, и поэтому важные для производства препарата IVIG-мономеры IgG могут быть практически полностью отделены от ди- и полимеров в стандартных условиях. Разделение исходного материала достигается в том случае, если выбран правильный хроматографический гель и он не перегружен белком. G. Iberer и соавт., например, использовали в полировочном этапе Superdex 200 («GE Healthcare AB», Швеция) для удаления полимеров из препарата IVIG [29].

В большинстве случаев сочетанное применение ионообменной и исключающей по размеру хроматографии способствует не только высокой степени очистки IgG (более 95%), но также и удалению реактивов, использованных для разрушения оболочечных вирусов методом растворитель-детергент [30]. После того, как IgG связывается с ионообменным сорбентом, указанные реактивы вымываются из колоны.
Правда, весьма низкая динамическая емкость катионообменных сорбентов не способствует полному удалению реагентов, хотя новое поколение сорбентов имеет улучшенную динамическую емкостьсвязующую способность, а исключающая по размеру хроматография служит дополнительным этапом удаления реагентов.

3. Смешанные методы.

Включение в схемы фракционирования осаждением IgG дополнительных хроматографических методов исторически было направлено прежде всего на удаление специфических агентов осаждения, например каприлата, полиэтиленгликоля (ПЭГ), окиси алюминия, спирта и т.д. Однако современные возросшие требования организаций, регулирующих выпуск лекарственных средств на рынок, обусловливают использование специализированных хроматографических методов для доведения чистоты и качества препаратов.
Фракционирование каприлатом. В 1960-х гг. было показано, что короткоцепочные жирные кислоты (C6-C12) формируют нерастворимые комплексы с a- и b-глобулинами, тогда как g-глобулины практически не осаждаются. М. Steinbuch с сотротрудниками описали процесс очистки IgG с помощью каприлата (т.е. октаноата С8-насыщенной жирной кислоты) как осаждающего агента. Неиммуноглобулиновые белки были осаждены из плазмы доноров разбавлением ацетатным буфером до конечного pH 4,8. Обогащенный раствор IgG был получен после дополнительного введения каприлата при энергичном перемешивании. Чистота и выход зависели от концентрации каприлата, pH, молярности буфера и фактора разведения.Авторы показали, что каприлат эффективно вводить в плазму в два приема с удалением осадков между ними.

Рис.4. Схема смешанного типа получение иммуноглобулина.

Схема смешанного типа получение иммуноглобулина

Получение сыворотки крови

Получают сыворотки путем иммунизации домашних животных (ослов, лошадей). Забор крови у этих животных производят в пе­риод максимального содержания антител, однако для этого необ­ходимо постоянно контролировать кровь по такому показателю, как титр антител, что представляет определенные технические трудности. Из крови животных выделяют плазму, затем из нее удаляют фибрин и получают сыворотку.
Приготовленные таким способом сывороточные препараты ха­рактеризуются относительно низкой активностью и существен­ным количеством примесей. Сыворотки можно получать также из культивируемых на искусственной питательной среде животных клеток. Однако главной проблемой в этом случае является обеспе­чение стабильного роста животных клеток вследствие их генети­ческой нестабильности, непостоянства генетических экспрессий и старения.

Способ получения сыворотки крови из животного включает два этапа.

  • На первом этапе получают нативную сыворотку крови взрослого крупного рогатого скота. При этом взятие крови проводят асептически только из сердца бычков в поликарбонатные бутыли, в которые предварительно наливают 5%-ный раствор натрия хлористого в объеме 100-200 мл. Бутыли наполняют кровью примерно наполовину их объема и переносят в холодильную камеру с температурой +1-+2°С, укладывают их под углом 35° на 72 часа. Затем проводят отсос сыворотки и предварительную очистку – фильтрами EKS при температуре +2-+6°С. После чего заполняют сывороткой полиэтиленовые канистры и выдерживают их при температуре -(15-20)°С не менее недельного срока.
  • Второй этап состоит в том, что из нативной сыворотки крови удаляют ингибирующие рост клеток вещества методом однократного замораживания и оттаивания. Проводят сбор верхних светлых слоев сыворотки, начиная сверху до границы раздела их с гемолизированными слоями, и осуществляют предварительную очистку через глубинные фильтры EKS. Затем проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры при температуре +2-+6°С. Способ позволяет получить сыворотку, пригодную для культивирования клеток животных и человека, в том числе гибридом, увеличить выход сыворотки к объему взятой крови, улучшить ее качество.

Заключение

В ходе своей работы изучила препараты крови такие как иммуноглобулина и сыворотки крови. Изучила их характеристики и классификации. Так же у иммуноглобулинов было изучено их строение и применение в медицине.
Подробно разобрала методы получения иммуноглобулинов и сывороток крови.
Было изучено понятие вирусной защищенности препаратов крови. Так же были изучены методы ее достижения.

Литература
1. «Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности», Е.П. Альтшулер, Д.В.Серебряная, А.Г.Катрухина;
2. Русланов В.М., Левин И., «Лечебные препараты крови», Москва 2004г;
3. «Технология получения иммуноглобулинов» Г.Л.Волков, киев 2008г;
4. Иванов А.В., Плотникова Э.М., Гурьянов Н.И., Хусаенов Р.Х., «Технология производства препаратов крови». Г.Казань 2007г;
5. А.Г.Исрафилов, М.М.Алсынбаев, В.А. Трофимов, Л.К. Лаптева, « Иммуноглобулин человека нормальный. Препараты для внутривенного и подкожного введения», Уфа 2008г;
6. Ю.О.Сазыкин, С.Н.Орехов, И.И.Чакалева, «Биотехнология», Москва 2008г.

А Вам помог наш сайт? Мы будем рады если Вы оставите несколько хороших слов о нас.
Категории
Рекомендации
Можно выбрать
Интересное
А знаете ли вы, что нажав сочетание клавиш Ctrl+F - можно воспользоваться поиском по сайту?
X
Copyrights © 2015: FARMF.RU - тесты, лекции, обзоры
Яндекс.Метрика
Рейтинг@Mail.ru

Пожалуйста поддержите наш сайт.

Скроее всего Вы знаете, что Google приостановил монетизацию сайтов в РФ. Для поддержки нашего сайта пожалуйста используйте VPN соединение из любой страны кроме РФ. Нам важна Ваша помощь для продолжения публикации новых лекций и статей.