Элеутерококка колючего корневища и корни (ФС.2.5.0053.15)

Государственная фармакопея 13 издание (ГФ XIII)

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ФС.2.5.0053.15 Элеутерококка колючего корневища и корни — Еleutherococci senticosi rhizomata et radices

Взамен ФС 42-0191-06

Собранные осенью, тщательно очищенные от земли, разрубленные на куски и высушенные корневища и корни дикорастущего кустарника элеутерококка колючего Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.), сем. аралиевых – Araliaceae.

ПОДЛИННОСТЬ

Внешние признаки. Цельное сырье. Куски корневищ и корней, цельные или расщепленные вдоль, длиной до 8 см, толщиной до 4 см, деревянистые, твердые, прямые или изогнутые, иногда разветвленные. Кора тонкая, плотно прилегает к древесине. Корневища с поверхности гладкие или слабо-продольно-морщинистые с пазушными почками и следами отмерших стеблей и обломанных корней. Поверхность корней более гладкая со светлыми поперечными бугорками. Излом длинноволокнистый, светло-желтого или бледно-коричневого цвета. Корневища с поверхности светло-коричневые, корни – более темные. Запах слабый, ароматный. Вкус водного извлечения слегка жгучий.

Измельченное сырье. Кусочки корневищ и корней различной формы, светло-желтого или кремового цвета с коричневыми вкраплениями, проходящие сквозь сито с отверстиями размером 5 мм. Запах слабый, ароматный. Вкус водного извлечения слегка жгучий.

Порошок. Кусочки корневищ и корней различной формы, светло-желтого или кремового цвета с коричневыми вкраплениями, проходящие сквозь сито с отверстиями размером 2 мм. Запах слабый, ароматный. Вкус водного извлечения слегка жгучий.

Микроскопические признаки. Цельное сырье. При рассмотрении поперечного среза корневища или корня должна быть видна перидерма с многослойной коричневой пробкой, среди крупных клеток паренхимы коры, содержащих друзы оксалата кальция, расположены секреторные каналы, лубяные волокна и сердцевинные лучи. Сердцевинные лучи многорядные, как правило, шириной в 2 – 3 клетки, в древесине прямые, в коре извилистые. Клетки центральной части сердцевинных лучей, расположенных в коре, нередко содержат мелкие друзы оксалата кальция. Кора отделена от древесины слоем камбия. Древесина широкая, как правило, кольцесосудистая.

Секреторные каналы многочисленные, выстланы 4 – 5 эпителиальными клетками, просветы их заполнены коричневым или оранжево-коричневым содержимым. В корне каналы мелкие, диаметр каналов не меняется по всей ширине коры. В корневище каналы 2 типов: более крупные каналы располагаются на границе феллодермы и лубяной части коры, мелкие (как у корня) – находятся в лубяной части коры.

Лубяные волокна с толстыми одревесневшими стенками располагают­ся, как правило, группами.

В клетках паренхимы коры должны быть видны многочисленные друзы оксалата кальция; крахмальные зерна содержатся только в клетках паренхимы, окружающих секреторные каналы, и в клетках сердцевинных лучей (в отличие от других представителей семейства Аралиевых, у которых крахмальные зерна заполняют все клетки паренхимы коры).

Древесина состоит из крупных сосудов и склеренхимных волокон (либ-риформ). Клетки сердцевинных лучей, реже либриформа, заполнены крах­мальными зернами, могут быть видны капли эфирного масла.

Корневище, в отличие от корня, имеет сердцевину, состоящую из крупных неодревесневших паренхимных клеток.

Измельченное сырье и порошок. При рассмотрении давленого микропрепарата должны быть видны группы сетчатых сосудов с окаймленными порами, редко фрагменты спиральных сосудов; многочисленные склеренхимные волокна с внутренними перегородками; фрагменты сердцевинных лучей в виде групп округлых клеток с утолщенными пористыми стенками; лубяные волокна с толстыми одре­весневшими пористыми стенками; группы паренхимных клеток, содержащих друзы оксалата кальция; фрагменты коры с секреторными каналами в виде коричневых или желтовато-коричневых трубок; фрагменты пробки, состоящей из крупных клеток с утолщенными стенками; часто в клетках либриформа и сердцевинных лучей видны капли эфирного масла.

Рисунок – Элеутерококка колючего корневища и корни.

1 – фрагмент поперечного среза корневища: a – многослойная пробка,
б – крупный секреторный канал на границе феллодермы и лубяной части коры, в – мелкий секреторный канал в лубяной части коры, г – извилистый сердцевинный луч, д – группы лубяных волокон, е– друзы оксалата кальция, ж – камбий, з – сосуды ксилемы (30×); 2 – фрагмент лубяной части коры поперечного среза корневища: a – сердцевинный луч, б – друзы оксалата кальция, в – мелкие секреторные каналы, г – группы лубяных волокон (200×); 3 – фрагмент продольно-тангентального среза древесины корневища: a – сетчатые сосуды с окаймленными порами, б – склеренхимные волокна (200×); 4 – фрагмент продольно-тангентального среза древесины корневища: a – сердцевинный луч, б – склеренхимные волокна (200×); 5 – давленый препарат: а – фрагмент пробки, состоящей из крупных клеток с утолщенными стенками (200×); 6 – давленый препарат: а – паренхимные клетки с друзами оксалата кальция (200×); 7 – давленый препарат: а – группа склеренхимных волокон коры c утолщенными пористыми стенками (200×)

Определение основных групп биологически активных веществ

1. Тонкослойная хроматография

Серная кислота раствор спиртовой 10 %,. К 90 мл спирта 96 % приливают 10 мл серной кислоты концентрированной. Срок годности раствора не более 30 сут.

Около 2,5 г сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 15 мл смеси спирт 96 % – вода (1 : 1 о/о) и нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр (испытуемый раствор).

На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля на алюминиевой подложке размером 10 × 10 см наносят 20 мкл испытуемого раствора и 10 мкл раствора стандартного образца (СО) элеутерозида В (см. раздел «Количественное определение «Элеутерозида В», раствор А). Пластинку с нанесенными пробами сушат при комнатной температуре в течение 5 мин, затем помещают в камеру (выложенную изнутри фильтровальной бумагой), предварительно насыщенную в течение 30 мин смесью растворителей хлороформ – метанол вода (70:30:4), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей в вытяжном шкафу.

Пластинку обрабатывают серной кислоты раствором спиртовым 10 %, нагревают в сушильном шкафу при 100 – 105 °С в течение 2 – 3 мин и просматривают при дневном свете.

На хроматограмме раствора СО элеутерозида В должна обнаруживаться зона адсорбции серого или серого с фиолетовым оттенком цвета.

На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться следующие зоны адсорбции (снизу вверх от линии старта): 2 ярко выраженные зоны темно-серого цвета; зона серо-коричневого цвета, зона серого или серого цвета с фиолетовым оттенком на уровне зоны на хроматограмме раствора СО элеутерозида В; допускается обнаружение дополнительных слабовыраженных зон адсорбции серого, серого с фиолетовым оттенком или коричневого цвета.

1. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора, полученного при количественном определении (см. раздел «Количественное определение «Элеутерозида В»), должно соответствовать времени удерживания основного пика на хроматограмме раствора СО элеутерозида В.

1. В коническую колбу вместимостью 25 мл помещают 0,5 г сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, прибавляют 10 мл горячей воды, нагревают на плитке в течение 5 мин и фильтруют. К 1 мл полученного извлечения прибавляют несколько капель железа(III) хлорида раствора 1 %, появляется зелёное окрашивание (полифенольные соединения).

ИСПЫТАНИЯ

Влажность. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок не более 14 %.

Зола общая. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок не более 8 %.

Зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок не более 1 %.

Измельченность сырья. Цельное сырье: частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 3 мм, не более 5 %. Измельченное сырье: частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 5 мм, не более 5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм, не более 5 %. Порошок: частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, не более 5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,18 мм, не более 5 %.

Посторонние примеси

Остатки стеблей, в том числе отделенные при анализе. Цельное сырье не более 1,5 %.

Потемневшие в изломе корневища и корни. Цельное сырье не более 3 %.

Органическая примесь. Цельное сырье, измельченное сырье не более 1 %.

Минеральная примесь. Цельное сырье, измельченное сырье. порошок не более 1 %.

Тяжелые металлы. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».

Радионуклиды. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».

Остаточные количества пестицидов. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах».

Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС «Микробиологическая чистота».

Количественное определение. Цельное сырье, измельченное сырье, порошок: суммы элеутерозидов в пересчете на элеутерозид В не менее 0,3 %; элеутерозида В  не менее 0,03 %.

Элеутерозид В

Приготовление растворов.

Раствор СО элеутерозида В. Около 10,0 мг (точная навеска) СО элеутерозида В растворяют в спирте 96 % в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводят объем раствора смесью спирт 96 % – вода (1:1, о/о) до метки и перемешивают (раствор A).

5,0 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора смесью спирт 96 % – вода (1:1, о/о) до метки и перемешивают (раствор В).

Срок годности растворов не более 3 мес при хранении в плотно укупоренной трае в прохладном, защищенном от света месте.

Проверка пригодности хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:

— фактор асимметрии пика элеутерозида В должен находиться в пределах от 0,8 до 1,5;

— эффективность хроматографической колонки должна быть не менее 5000 теоретических тарелок.

Аналитическую пробу сырья измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм. Около 2,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл смеси спирт 96 % – вода (1:1) и нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения извлечение осторожно (без перемешивания) фильтруют через ватный тампон средней плотности, избегая попадания частиц на вату, в мерную колбу вместимостью 100 мл. Извлечение повторяют дважды, используя каждый раз 25 мл смеси спирт 96 % – вода (1:1), при этом ватный тампон для фильтрования не меняют. Объем извлечения в мерной колбе доводят смесью спирт 96 % – вода (1:1, о/о) до метки, одновременно промывая остаток сырья в колбе, и перемешивают.

Около 2 – 3 мл полученного извлечения фильтруют через нейлоновый фильтр (с размером пор 0,45 мкм), отбрасывая первые 1 – 2 мл фильтрата (испытуемый раствор).

Условия хроматографирования

Колонка	нержавеющая сталь, 250 × 4,6 мм, эндкеппированный октадецилсилилсиликагель (С18) для хроматографии (5 мкм)
Предколонка	соответствует используемой колонке, эндкеппированный октадецилсилилсиликагель (С18) для хроматографии (5 мкм)
Подвижная фаза	А  раствор фосфорной кислоты концентрированной в воде (0,5:99,5); Смешивают фосфорную кислоту концентрированную с водой для хроматографии в объемном соотношении (0,5:99,5). Приготовленный раствор фильтруют под вакуумом через мембранный фильтр с порами размером не более 0,45 мкм. В   ацетонитрил для хроматографии.
Способ элюирования	Программа градиента
Время, мин	А, об. %	В, об. %
0 – 5	90	10
5 – 27	90→80	10→20
27 – 30	80→50	20→50
30 – 35	50	50
35 – 40	50→90	50→10
40 – 45	90	10
Скорость потока, мл/мин	1
Температура Колонки, оС	20 ± 2
Детектор	УФ-спектрофотометрический или диодная матрица
Длина волны, нм	266
Объем вводимой Пробы, мкл	10
Время регистрации Хроматограммы, мин	30

Хроматографируют попеременно испытуемый раствор и раствор СО, получая не менее 3 хроматограмм. Результаты считаются достоверными, если выполняются требования теста «Проверка пригодности хроматографической системы». Расчет содержания элеутерозида В проводят методом внешнего стандарта.

Содержание элеутерозида В в абсолютно сухом сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

где S площадь пика элеутерозида В на хроматограмме испытуемого раствора;

S_о площадь пика элеутерозида В на хроматограмме раствора СО элеутерозида В;

а навеска сырья, мг;

a_о навеска СО элеутерозида В, мг;

P содержание основного вещества в СО элеутерозида В, %;

W влажность сырья, %.

Сумма элеутерозидов

Аналитическую пробу сырья измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл и проводят фракционное извлечение последовательно 2 раза спиртом 70 % и 2 раза спиртом 96 % порциями по 20 мл. Каждое извлечение проводят на магнитной мешалке при нагревании до температуры не выше 50 °С в течение 1 ч. Извлечения фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу вместимостью 100 мл и отгоняют спирт на роторном испарителе под вакуумом досуха. К сухому остатку в колбе прибавляют 10 мл воды и 10 мл углерода тетрахлорида. Содержимое колбы тщательно перемешивают и количественно переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл. Колбу дважды промывают углерода тетрахлоридом порциями по 5 мл и смывы присоединяют к содержимому в делительной воронке. Затем в колбу прибавляют 10 мл смеси хлороформ – спирт 96 % (5:1), перемешивают и оставляют на 10 мин.

В делительной воронке проводят очистку водной фазы трехкратным извлечением углерода тетрахлоридом порциями по 10 мл, отбрасывая каждый раз слой углерода тетрахлорида. К очищенной водной фазе в делительной воронке прибавляют 20 мл смеси хлороформ – спирт 96 % (5:1) (из них 10 мл из колбы для отгона) и извлекают элеутерозиды в течение 5 мин. Нижний слой фильтруют через бумажный фильтр, содержащий 2,0 г натрия сульфата безводного, в мерную колбу вместимостью 100 мл. Извлечение элеутерозидов в делительной воронке повторяют еще 4 раза той же смесью последовательно порциями 15, 15, 10 и 10 мл, собирая извлечения в ту же мерную колбу. Объем раствора в колбе доводят смесью хлороформ – спирт 96 % (5:1) до метки и перемешивают (раствор А).

20,0 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора смесью хлороформ – спирт 96 % (5:1) до метки и перемешивают (раствор Б).

Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре в при длине волны 278 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь хлороформ – спирт 96 % (5:1).

Содержание суммы элеутерозидов в пересчете на элеутерозид В в абсолютно сухом сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

Примечание. Определение суммы элеутерозидов в пересчете на элеутерозид В проводят для сырья, предназначенного для производства экстрактов.

Упаковка, маркировка и транспортирование. В соответствии с требованиями ОФС «Упаковка, маркировка и транспортирование лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов».

Хранение. В соответствии с требованиями ОФС «Хранение лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов».