Жидкостная хроматография. ТСХ, ВЭЖХ, ионная хроматография

Жидкостная хроматография

ГЛАВА 5. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

• Понятие. Основные виды
• Бумажная, тонкослойная хроматография
• Высокоэффективная жидкостная хроматография
• Ионная хроматография
• Качественный и количественный хроматографический анализ

Понятие. Основные виды

В жидкостной хроматографии используется разделение смеси веществ в виде раствора в жидком растворителе (подвижная фаза). В качестве неподвижной фазы может быть использован либо твердый сорбент, либо несмешивающаяся с растворителем жидкость. Жидкостная хроматография стала усиленно развиваться с 1960 года. Новые методы детектирования, создание специальных носителей и сорбентов, изучение механизма хроматографических процессов позволили резко увеличить скорости разделения и сократить время проведения анализов (до нескольких минут и даже секунд). Основные виды жидкостной хроматографии:

• ● бумажная;
• ● колоночная;
• ● тонкослойная;
• ● высокоэффективная жидкостная хроматография.

Бумажная, тонкослойная хроматография

Бумажная хроматографии проводится на специальной бумаге и основан на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси по бумаге в потоке растворителя (элюэнта). Схематически показано сходство этого метода с методом колоночной хроматографии (рис. 5.4 и рис. 5.5). Бумажная хроматография проводится на бумажных полосках 1 (см. рис. 5.5) специальных сортов бумаги. Капля 3 исследуемого раствора наносится на некотором расстоянии от края бумажной полоски. Край полоски помещают в соответствующий растворитель 5, который перемещается по капиллярам бумаги вдоль полоски. При этом происходит разделение веществ чем хуже поглощается вещество, тем дальше будет находиться оно от линии 4 старта. По окончании разделения полоску высушивают и опрыскивают раствором реагента, образующего с определяемыми веществами характерно окрашенные соединения.

Хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ) аналогична хроматографии на бумаге. Различие состоит в том, что в этом случае на стеклянную пластинку наносят тонкий слой порошкообразного сорбента (например, окись алюминия, силикагель, каолин, ионообменная смола).

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в настоящее время является наиболее перспективным методом. ВЭЖХ является вариантом колоночной жидкостной хроматографии. Подвижная фаза — элюент — проходит через колонку, заполненную сорбентом, с большей скоростью за счет значительного давления (десятки и сотни атмосфер) на входе в хроматографическую колонку. ВЭЖХ является удобным способом разделения и проведения количественного и качественного анализа нелетучих термолабильных соединений с малой и большой молекулярной массой. ВЭЖХ (HPLC) широко применяется для анализа:

• ● объектов окружающей среды;
• ● лекарственных средств;
• ● пищевых продуктов.

Аппаратура для проведения ВЭЖХ близка по конструктивному решению газовым хроматографам, за исключением того, что вместо баллона с газом установлен резервуар с жидким элюентом, насос и система регулирования потока подвижной фазы (ПФ), обеспечивающая его высокую постоянную скорость. Насосы изготавливаются из титановых сплавов. Они должны создавать стабильный непульсирующий поток ПФ и развивать (при необходимости) большое давление. Расчет параметров удерживания веществ при ВЭЖХ аналогичен расчетам для газовой хроматографии.

Наиболее значимой задачей, решаемой ВЭЖХ в анализе воды и почвы, является определение в них фенольных соединений, полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и пестицидов (рис. 5.6). Так как ПДК этих экотоксикантов в водах и почвах очень низки, их определение обычно проводят после предварительного концентрирования или выделения.

Фенол, его хлорпроизводные и нитропроизводные образуются в процессе производственной деятельности человека, в частности в целлюлозно-бумажном производстве. Возникает необходимость их определения в различных типах вод природных, водопроводной, производственных и сточных. Состав вод весьма сложен и может включать большое число фенольных соединений, которые образуются на стадии загрязнения. Наиболее вероятными компонентами сточных вод являются фенол, гваякол, о-, м- и п-крезолы, моно-, ди-, три-, пентахлорфенолы, моно- и динитрофенолы. Для разделения и одновременного определения летучих и малолетучих фенолов весьма удачным является использование ВЭЖХ.

Для определения загрязнений в воздухе ВЭЖХ используется реже, чем в воде и почве. Этот метод незаменим при определении в воздухе токсичных высокомолекулярных и высококипящих органических соединений. К ним относятся диоксины, пестициды, полихлобифенилы, ПАУ, фенолы, ароматические амины и имины, азарены (азотсодержащие гетероциклические углеводороды) и их метильные производные. Во всех случаях предварительно загрязняющие компоненты улавливают из воздуха в специальные концентрирующие трубки и после экстракции из фазы адсорбента анализируют полученный раствор методом ВЭЖХ.

Наиболее важным является определение в воздухе ПАУ (ПДК для атмосферного воздуха составляет 10 –6 мг/м3 , воздуха рабочей зоны — 1,5∙10 –4 мг/м3), анализ концентрата проводят, как для воды и почвы.

Определение фенолов и крезолов важно для жилых помещений, так как строительные материалы, покрытия, мебель могут выделять фенолы. Их улавливают при прокачивании воздуха через щелочные растворы или на специальных фильтрах, с которых потом их смывают ацетонитрилом или метанолом. Карбонильные соединения (альдегиды и кетоны) — наиболее важные приоритетные загрязнители городского воздуха (ПДК около 0,02 мг/м3), источником которых являются выхлопные газы автомобилей. В воздухе определяют ароматические амины и гетероциклические имины, а также карбонильные соединения, которые являются распространенными загрязнителями воздуха промышленных регионов.

Ионная хроматография

Ионная хроматография — это высокоэффективная жидкостная хроматография для разделения катионов и анионов на ионообменниках низкой емкости. Достоинства ионной хроматографии:

• ● возможность определять большое число неорганических и органических ионов, а также одновременно определять катионы и анионы;
• ● высокая чувствительность (до 1 нгмл без предварительного концентрирования);
• ● высокая селективность и экспрессность;
• ● малый объем анализируемой пробы (не более 2 мл образца);
• ● во многих случаях без предварительной пробоподготовки. Как и любой аналитический метод, ионная хроматография не лишена недостатков
• ● сложность синтеза ионообменников, что значительно затрудняет развитие метода;
• ● более низкая по сравнению с ВЭЖХ эффективность разделения;
• ● необходимость высокой коррозионной стойкости металлических деталей хроматографа особенно при определении катионов.

Разделение катионов происходит на катионообменниках (рис. 5.7), которые содержат фиксированные группы SO3–, PO3– , –COO– и катионы в качестве противоиона. Равновесие ионного обмена описывается схемой:

Подвижной фазой при разделении катионов чаще всего являются растворы 10 –3 М соляной, азотной кислот или их солей. Разделяемые катионы элюируются с колонки в результате их замещения в фазе ионообменника катионами, содержащимися в подвижной фазе. Разделение анионов проводится на анионообменниках (рис. 5.8), которые содержат фиксированные группы –NR3, –NHR2, –NH2R и анионы как противоионы. Равновесие ионного обмена описывается схемой:

Наиболее распространенными элюентами при определении анионов являются 10 –3 M растворы карбоната, гидрокарбоната или гидроксида натрия. Разделяемые анионы элюируются с колонки анионами, содержащимися в подвижной фазе. Нижняя граница определяемых концентраций в ионной хроматографии составляет 1–10 нг/л.

Ионную хроматографию используют для определения:

• — анионов неорганических кислот (HCl, HNO, H2S, H3BO3);
• — моно- и дикарбоновых кислот;
• — щелочных и щелочноземельных металлов;
• — анионных комплексов переходных металлов;
• — оксоанионов;
• — алифатических аминов;
• — оксидов азота, серы и фосфора.

Одно из направлений использования ионной хроматографии — анализ воды. В воздухе с помощью ионной хроматографии определяют главным образом агрессивные неорганические газы, альдегиды, амины. Газ поглощают с помощью индивидуальных ловушек и определяют в виде соответствующих анионов. Например, диоксид серы в виде сульфат-иона, диоксид азота — нитрат-иона, хлористый водород — хлорид-иона. Метод определения формальдегида и ацетальдегида основан на их окислении до формиат- и ацетат-ионов соответственно. Для определения аминов и гидразинов их сорбируют из воздуха на силикагеле и десорбируют водно-метанольным раствором серной кислоты. Однако важнейшее направление использования ионной хроматографии — анализ воды. В различных водах содержатся неорганические анионы, ионы металлов, ионогенные органические вещества.

Качественный и количественный хроматографический анализ

Задачей качественного анализа является определение вещества, находящихся в анализируемой пробе. Основными способами идентификации веществ являются

1. Метод метки.

Первый вариант метода основан на том, что в одинаковых условиях экспериментально определяют времена удерживания эталонных (метка) и анализируемых веществ и сравнивают их. Равенство параметров удержания позволяет идентифицировать вещество. Второй вариант метода метки заключается в том, что в анализируемую смесь вводят эталонный компонент (метка), присутствие которого в смеси предполагается. Увеличение высоты соответствующего пика по сравнению с высотой пика до введения добавки свидетельствует о наличии этого соединения в смеси.

2. Использование значений параметров времени удерживания, приведенных в справочной литературе.

В основе количественного анализа лежит зависимость площади пика от количества вещества (в некоторых случаях используют высоту пика). Существуют различные способы определения площади пиков:

• ● по формуле, как площадь треугольника;
• ● при помощи планиметра;
• ● взвешиванием вырезанных пиков (пики на хроматограмме копируют на однородную бумагу, вырезают и взвешивают);
• ● при помощи электронного интегратора. Точность количественного хроматографического анализа в значительной степени определяется выбором наиболее рационального метода расчета концентрации веществ.

Основными методами являются:

• ● метод абсолютной калибровки;
• ● метод внутренней нормализации;
• ● метод внутреннего стандарта.

Метод абсолютной калибровки. Для этого метода в хроматографическую колонку вводят известные количества стандартного вещества и определяют площади пиков. По полученным данным строят калибровочный график. Затем хроматографируют анализируемую смесь и по графику определяют содержание данного компонента. Если график линеен, то можно также рассчитать результаты анализа с использованием абсолютных калибровочных коэффициентов. Для расчета этих коэффициентов определяют площади пиков не менее 10 стандартных смесей с различным содержанием данного вещества i. Затем используют формулу:

Полученные таким образом коэффициенты усредняют. Затем проводят анализ исследуемой смеси и рассчитывают результат по формуле:

ωi = k(S ∙ 100) / q.

Метод довольно прост, но необходимым условием применения его является строгое соблюдение параметров режима хроматографирования при градуировке прибора и при определении содержания хроматографируемого вещества. Метод абсолютной калибровки особенно широко применяют при определении одного или нескольких компонентов смеси при контроле технологического процесса. Этот метод является основным при определении микропримесей.

Метод внутренней нормализации. Сущность метода заключается в том, что сумму площадей пиков всех компонентов смеси принимают за 100 %. Необходимым условием применения метода является регистрация всех компонентов (на хроматограмме присутствуют разделенные пики всех компонентов смеси).

Метод внутреннего стандарта. Сущность метода заключается в том, что в анализируемую смесь вводят определенное количество стандартного вещества. Внутренний стандарт выбирается из числа соединений, близких по структуре и физико-химическим свойствам к компонентам анализируемой смеси. Метод применяется при регистрации на хроматограмме всех компонентов анализируемой смеси и в случае не полностью идентифицированных смесей. Основная трудность заключается в выборе и точной дозировке стандартного вещества.