ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ НА СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ В ТКАНЯХ РАСТЕНИЙ

Белки низкотемпературного стресса растений. Колесниченко А.В. 2003

• Влияние гипотермии на содержание водорастворимых белков в тканях высших растений
• Влияние гипотермии на содержание водорастворимых белков в тканях бактерий и водорослей
• Влияние гипотермии на активность и содержание ферментов в тканях высших растений
• Влияние гипотермии на активность и содержание ферментов бактерий
• Влияние гипотермии на содержание мембранных белков
• Влияние гипотермии на фосфорилирование белков

Влияние гипотермии на содержание водорастворимых белков в тканях высших растений

Предположение о том, что во время закаливания растений к холоду происходит синтез белков, было впервые высказано Дж. До лом и П. Клинчем в 1927 году. Первые доказательства того, что процесс синтеза белка непосредственно участвует в закаливании растения, были получены Г. Симинович (цит. по Браун, 1983). Впоследствии во многих работах сообщалось об изменении содержания нуклеиновых кислот и общего белка во время закаливания растений к холоду (Колоша, Костенко, 1976; Brown, Bixby, 1975; Chen, Li, 1977; Graham, Patterson, 1982). Анализ изменений водо- и солерастворимых белков озимой пшеницы после закаливания и перезимовки показал увеличение содержания водорастворимых белков (Беличенко, Грязина, 1980; Колоша, Костенко, 1976). В то же время содержание солерастворимых белков снижалось. По этим признакам обнаружены различия между озимой пшенице сорта Безостая 1 и высокозимостоким мутантом этого сорта, полученным под действием нитрозометилмочевины. Аминокислотный анализ изучаемых белков выявил значительные изменения по этому признаку как у исходно формы, так и у мутанта под действием перезимовки (Беличенко, Грязина).

В ряде других работ сообщалось об изменении содержания общего белка во время действия низкой температуры (Колоша, Черепенчук, 1968) и закаливания (Браун, 1983; Kasperska-Palacz et al., 1977а,б). При изучении биосинтеза белка во время низкотемпературной адаптации озимых злаков в связи с их морозостойкостью (Карасев и др., 1992) было установлено, что у озимой пшеницы, озимой ржи и ячменя при снижении температуры с 18⁰С до 2⁰С в первые — третьи сутки адаптации происходит снижение уровня синтеза белка, но на пятые — седьмые сутки синтез белка возрастает, при этом 10-15% обще массы растительного белка составляют вновь синтезированные белки, не присутствовавшие в контрольных растениях.

Во время перезимовки растений озимой пшеницы происходят значительные изменения в содержании белков в тканях корня и узлов кущения: наблюдается гидролиз белков в корнях и перемещение свободных аминокислот в узлы кущения, причем если осенью с понижением температуры количество растворимых белков в корнях уменьшается, то к весне оно увеличивается (Мусич, 1968). Накопление белков (в основном в виде легкорастворимых форм) за счет более слабого по сравнению с ростом замедления скорости белкового синтеза отмечалось в клетках корня кукурузы под влиянием пониженно температуры (Родченко и др., 1988).

Применение электрофореза для разделения растительных белков позволило получить новую информацию о влиянии гипотермии на состав белков растений . Резкое снижение температуры вызывает заметные изменения в электрофоретическом спектре легкорастворимых белков. В частности, у озимой пшеницы в период перезимойвки обнаружены значительные изменения в составе белков, выделенных из узлов кущения (Барашкова, 1971, 1979). В процессе закаливания образование белков, судя по количеству полос в электрофоретическом спектре, нарастало, а в осенне-зимний период уменьшалось. Была отмечена сортовая специфика в отношении этого признака. В частности, морозоустойчивы сорт озимой пшеницы отличался от морозочувствительного сорта большим числом полос в электрофоретическом спектре.

Появление новых полос в спектре белков под действием гипотермии и в процессе закаливания растений к холоду отмечается многими исследователями. В частности, в ходе процесса адаптации озимой пшеницы к низким отрицательным температурам отмечалось появление в электрофоретическом спектре белков с молекулярными массами 24 и 85 кДа (Карасев и др., 1991), а также в дополнение к ним 67 и 74 кДа (Карасев и др., 1993). При изучении полипептидного состава белков узла кущения озимой пшеницы в процессе зимойвки было обнаружено изменение содержания глобулинов с молекулярными массами 23 и 48 кДа (Новожилова и др., 1994). Закаливание озимой пшеницы приводит и к изменениям в составе белков надземных органов (Бабенко, Нигрецкая, 1971), при этом наблюдается новообразование четко выраженных полос в электрофоретическом спектре в зонах высоко- и низкоподвижных белков. Авторы, учитывая, что значительная часть белков обладает ферментативными свойствами, предполагают появление ферментов, которые обнаруживаются только при холодовом воздействии на озимую пшеницу.

При исследовании белков, синтез которых коррелирует с возрастанием холодоустойчивости клеточных культур Bromus inermis Leyss. cv. Manchar было отмечено усиление синтеза белков с молекулярными массами 25, 165, 190 и 200 кДа (Robertson et al., 1988).

Одним из наиболее изученных к настоящему времени семейств белков, содержание которых в растенийи коррелирует с холодоустойчивостью, являются дегидрины (члены семейства D II белков LEA [late embryogenesis abundant — белки позднего эмбриогенеза]). Данное семейство белков имеет определенные, характерные для этого семейства последовательности аминокислот, что позволяет достаточно легко и уверенно идентифицировать его членов как на уровне транскриптов, так и на уровне индивидуальных белков. В связи с этим члены данного семейства в настоящее время интенсивно изучаются.

Значительные изменения под действием холодовой акклиматизации были обнаружены при изучении экспрессии дегидринов у яровых и озимых зерновых культур (Fu et al., 1994). Было установлено, что содержание дегидриновых транскриптов возрастает с сентября по ноябрь, причем их содержание у яровых культур возрастает меньше, чем у озимых. При исследовании экспрессии гена дегидрина (белок DHN-4) было обнаружено, что после 14 дне закаливания в контролируемых условиях (2/-2⁰С) в значительных количествах обнаруживаются три транскрипта, гибридизующихся с кДНК белка DHN-4. После низкотемпературной закалки растений в полевых условиях к ноябрю в растениях накапливался высоки уровень транскриптов дегидрина, при этом растения развивали очень высокую морозостойкость (LT₅₀= -30⁰C) (Robertson et al.,1994). Увеличение уровня синтеза дегидрина с молекулярной массой 50 кДа во время холодовой акклиматизации было отмечено у пшеницы (Houde et al., 1992). Было также установлено, что некоторые из полипептидов, появляющиеся под действием закаливания у других культур (в частности, полипептид с молекулярной массой 60 кДа), также относятся к семейству белков-дегидринов (Arora et al., 1993).

С помощью электрофореза белков в градиенте ПААГ и изоэлектрофокусирования было показано, что закаленные и незакаленные к холоду листья озимой пшеницы имеют различающиеся белковые спектры (Makinen, Stegemann, 1981). После закаливания наблюдалось появление белковых компонентов с высокой молекулярной массой. В ряде работ (Weidner, Heuel, 1979; Weidner et al., 1982) было высказано предположение, что холодовая обработка индуцирует синтез полипептидов с отличающейся первичной структурой, поскольку этими авторами было установлено, что охлаждение (2 дня при 4⁰С) проростков яровой пшеницы приводит к появлению новых полос не только в спектрах нативных белков, но и в электрофоретических спектрах белков, обработанных додецилсульфатом натрия.

Ф.Р. Гималов с соавторами (1991) констатировали, что под действием холодового шока у пшеницы происходит индукция синтеза полипептидов с молекулярными массами 50, 70 и 94 кДа. Впоследствии этими же авторами (Гималов и др., 1996) был проведен скрининг ряда представителей трибы Triticeae (Triticum urartu; T. monococcum; T. sinskajae; T. dicoccum; T. aestivum /озимый сорт Альбидум 114, яровой сорт Заря/; Aegilops longissima, Ae. Rauschii; Secale cereale /сорт Чулпан/) для сравнения полипептидов, синтезирующихся у них под действием гипотермии. Обработка объектов низкой температурой (5⁰С) проводилась в течение 7 суток. Радиоактивная метка вводилась в течение последних 24 часов холодовой обработки. При помощи электрофореза в ПААГ и радиоавтографии было установлено, что у всех диплоидных видов (T. urartu, T. sinskajae, T. monococcum) понизился уровень синтеза полипептидов с молекулярной массой 50 и 66 кДа. У всех этих видов в спектре белков появился полипептид с молекулярной массой 43 кДа. В растениях вида T. urartu синтезировались также белки с молекулярными массами 20, 27 и 37 кДа; у вида T. sinskajae — 20 и 37 кДа, а у T. monococcum — 20 и 27 кДа. У эгилопсов в спектрах появлялись белки с молекулярными массами 33 и 43 кДа и наблюдалось увеличение синтеза белков с молекулярными массами 20, 40, 50 и 62 кДа. У T. dicoccum наблюдалось уменьшение синтеза белка с молекулярной массой 66 кДа и усиление синтеза белков с молекулярными массами 45 и 48 кДа. В белковом спектре появлялись полосы с молекулярными массами 20, 33 и 43 кДа. У T. aestivum наблюдалось появление в спектре белков с молекулярными массами 43 кДа (у озимого сорта Альбидум 114) и 43 и 48 кДа (у ярового сорта Заря). Уменьшалось включение радиоактивно метки в белок 66 кДа (у ярового сорта) и 46 кДа (у озимойго сорта). У озимой ржи (Secale cereale, сорт Чулпан) было отмечено снижение включения метки в белки с молекулярными массами 13, 38, 50 и 90 кДа и увеличение включения метки в белки с молекулярными массами 15 и 22 кДа. В белковом спектре появлялась полоса с молекулярно массой 28 кДа. Авторы (Гималов и др., 1996) выделяют ряд полипептидов (в частности, с молекулярной массой 43 кДа), которые появляются в белковых спектрах большинства исследованных видов растений под действием пониженно температуры.

Из листьев закаленной к холоду капусты (Brassica oleracea L.) был выделен и очищен белок (криопротектин), который защищал тилакоиды незакаленного шпината (Spinacea oleracea L.) от повреждения при замораживании (Sieg et al., 1996). Процедура выделения включала в себя осаждение тепловой обработкой, осаждение сульфатом аммония и гликозаминогликаном гепарина, а также колоночную хроматографию на Полиамиде 6 и обращенно-фазную хроматографию на матриксе С-18. После обращенно-фазной хроматографии на электрофорезе была выявлена одна полоса с приблизительной молекулярной массой 7 кДа. Эта фракция имела криопротекторную активность. Гель-фильтрация подтвердила, что данный белок является мономером с молекулярной массой 7 кДа. Этот белок можно выделить только из закаленных к холоду растений капусты, но не из растений, выращеных в незакаливающих условиях. С использованием меченых пероксидазой лектинов было показано, что данный криопротектин является гликопротеином и содержит связанны остаток а 1-3 связанной фукозы.

Листья омелы (Viscum album L.) содержат тригалактозу и специфические N-ацетилгалактозаминные- изолектиновые группы (ML I, II и III). Группы ML I и ML III показали высокую криозащитную активность в изолированных мембранах тилакоидов шпината (Spinacea oleracea L.) в период замерзания и оттаивания почвы, в то время как ML II не обладали такой активностью. В ходе экспериментов установлено, что криозащитная эффективность белков коррелировала с их относительной гидрофобностью. Было установлено также, что морозостойкость листьев омелы сезонно регулируется природными условиями. В то время как листья, собранные зимой, не повреждались при замерзании почвы до -20⁰ C, листья, собранные в июле, претерпевали 70% утечку электролита после замерзания почвы до -5⁰ C. Данные экспериментов свидетельствуют, что и количество фракци ML I и ML III изменяется в течение года. Наиболее высокое содержание этих криозащитных лектинов наблюдалось зимой и ранней весно й, а наиболее низкое — в период летних месяцев. Изменений в содержании ML II не было зафиксировано. Эти данные подтверждают то, что некоторые лектины могут играть роль в стабилизации клеточных мембран под действием стрессовых условий окружающей среды (Hincha et al., 1997).

При изучении влияния развития морозоустойчивости на синтез белков было идентифицировано семейство белков, ассоциированное с развитием морозоустойчивости у пшеницы. Данное семейство белков специфическое для злаков и их содержание регулируется низкой температурой. Антитела, полученные против белка с мол. массой 50 кДа (WCS120), реагируют, по крайней мере, с пятью членами данного семейства. Используя эти антитела, были определены содержание и локализация данного семейства белков в акклиматизированных к холоду всходах пшеницы. Вестерн- блоттинг субклеточных частиц показал наличие всех членов семейства в цитозоле и очищенных ядерных частицах. После 21 дня холодовой акклиматизации озимой пшеницы эти белки накапливались вплоть до 0.9% от всех растворимых экстрагируемых белков. Их клеточная концентрация составляла 1.34 рМ. Иммуногистохимическая локализация показала, что содержание этих белков наиболее высоко в зоне сосудистого перехода. Эти белки не были обнаружены в зрелой ксилеме, в верхушечной меристеме побегов или в боковых корневых примордиях. Данная тканеспецифичная индукция позволяет предполагать, что чувствительные клетки в областях, где вода имеет тенденцию замерзать в первую очередь, для свое защиты требуют более высокого содержания этих белков (Houde et al., 1995).

Полученные данные хорошо соответствуют тому факту, что отрастание после замораживания в значительно степени зависит от жизнеспособности части побега. Электронно-микроскопически анализ с использованием иммунно-золотой метки показал, что эти белки присутствуют в цитоплазме и в нуклеоплазме. В то же время они не были найдены в клеточных стенках или других клеточных органеллах. Исследование криозащитного действия in vitro показало, что белок WCS120 (PD₅₀ 10 рг/мл или 0.2 pM) так же эффективно, как БСА и сахароза (в концентрации 250 мМ), защищает лактатдегидрогеназу от денатурации в ходе замораживания (Houde et al., 1995). Эти результаты показывают, что данное семейство белков может быть вовлечено в общий механизм защиты растворимых частиц клетки. Их присутствие в нуклеоплазме также позволяет предложить как их возможную функцию — предохранение процессов транскрипции. Высокая гидрофильность, высокое содержание данных белков и устойчивость этих белков при кипячении позволяют предлагать, что они могут обеспечивать особую микросреду, необходимую для выживания клетки в чувствительно зоне сосудистого перехода во время стресса при замораживании (Houde et al., 1995).

При исследовании взаимосвязи ответов растения на различные типы стресса было обнаружено, что солевой стресс увеличивает морозоустойчивость у некоторых видов травянистых растений. С целью понять молекулярные основы увеличения индуцируемой холодовым стрессом морозоустойчивости при помощи двумерного электрофореза в ПААГ был проанализирован эффект обработки солевым раствором (100 мМ NaCl) на состав общих белков растений картофеля (Solanum commersonii Dun). После 24 часовой обработки NaCl, во время которой холодоустойчивость возрасла в три раза, были выявлены девять индуцируемых солевым стрессом белков (Ryu et al., 1995). Прямое сравнение этих белков с белками, индуцируемыми низкотемпературным стрессом и экзогенной абсцизовой кислотой, позволило установить, что пять индуцируемых солевым стрессом белков индуцировались также низкотемпературным стрессом (4 /2⁰С), а семь — обработкой абсцизовой кислотой (40 pM). Три белка (мол. массы (кДа)/р! 13/7.0, 27/6.6 и 48/6.9) индуцировались и холодом и экзогенной абсцизовой кислотой и были связаны с изменением морозоустойчивости (Ryu et al., 1995). После 6 часов обработки солью, перед тем как развивалась холодоустойчивость, эндогенный уровень абсцизовой кислоты в листьях кратковременно увеличивался в шесть раз. Результаты позволяют считать, что солевая индукция холодового закаливания включает синтез холодоиндуцируемых и индуцируемых абсцизовой кислотой белков, а также то, что изменение белкового синтеза можно связать с увеличением концентрации абсцизовой кислоты в ответ на солевой стресс. Эти данные также позволяют предполагать, что некоторая часть белков, индуцируемых холодом и абсцизовой кислотой, связана с солевым стрессом (Ryu et al., 1995).

Влияние гипотермии на содержание водорастворимых белков в тканях бактерий и водорослей

Изменение экспрессии водорастворимых белков в ответ на понижение температуры наблюдается также и у водорослей и у бактерий. Во время резкого понижения температуры в бактериях временно экспрессируются на высоком уровне «индуцируемые холодом белки» (CIP). При помощи двумерного электрофореза в ПААГ были идентифицированы некоторые из этих белков. Несмотря на это, общие функции данных белков, как ответа организма на холодовой шок, в настоящее время все еще неясны. В последнее время наибольшее внимание исследователе сфокусировано на группе «белков холодового шока» (CSP), синтез которых, как было показано, в значительно степени индуцируется во время холодового шока и после него и которые играют важную регуляторную роль в физиологии адаптации микроорганизмов к низким температурам. E. Coli, B. Subtilis и B. Cereus обладают семейством белков, насчитывающим, по меньшей мере, 3 — 7 белков CSP — небольших кислых белков, которые имеют между собой более 45% идентичности в последовательности аминокислот. Последние данные подтверждают, что члены этого широко распространенного семейства белков могут in vitro действовать как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Тем не менее, все функции CSP остаются неизвестны. К тому же, в соответствии с недавно полученными данными, в индукции синтеза CSP также играет важную роль посттрансляционная регуляция. В этот процесс могут быть также вовлечены рибосомы. Это предположение находится в соответствии с моделью, в которой, как предполагается, рибосомы являются температурным сенсором в бактериях (Graumann, Marahiel, 1996).

Перенос Enterococcus faecalis в условия низкой температуры (8⁰С от 4 до 30 часов) вызывал усиление экспрессии 11 белков холодового шока. Кроме того, мезофильные прокариоты синтезировали также 10 белков холодовой акклиматизации, 5 из которых совпадали с белками холодового шока, во время продолжительного роста (до 4 дне ) при температуре 8⁰С (Panoff et al., 1997).

Listeria monocytogenes — грампозитивный продовольственный патоген — способен расти при температуре холодильника. При снижении температуры от 37 до 5⁰C у L. monocytogenes (штамм 10403S) индуцируется синтез двенадцати белков холодового шока (CSP) с молекулярными массами 48,6; 41,0; 21,8; 21,1; 19,7; 19,2; 18,8; 17,2; 15,5; 14,5 и 14,0 кДа. Это было установлено в экспериментах по включению 35 метки (L-[S- ]метионин) с последующим двумерным электрофорезом в геле. Штамм SLCC53 показал аналогичный ответ на холодовой шок. Белки холодовой акклиматизации наблюдались в культурах штамма 10403S в условиях роста при 5⁰C, четыре из этих белков, с молекулярными массами 48,0; 21,1; 19,7 и 18,8 кДа, также являлись белками холодового шока. Два чувствительных к холоду транспозон-индуцированных мутанта включали метку менее эффективно, чем нечувствительны к холоду родительски штамм, но в то же время ответная индукция белков холодового шока у изученных мутантов была очень похожа на ответную индукцию родительского штамма (Bayles et al., 1996).

Дальнейшее изучение основного белка холодового шока (18 кДа) Listeria monocytogenes при помощи двумерного электрофореза показало, что его изоэлектрическая точка (pI) составляет 5.1 (Hebraud, Guzzo, 2000). При помощи N-терминального сиквенса полученного при помощи двумерного электрофореза белка была установлена его полная идентичность с негеминовым железосвязывающим ферритином из Listeria innocua. Очистка этого ферритин-подобного белка позволила установить, что его нативная молекулярная масса составляет около 100-110 кДа, что свидетельствует о том, что он состоит из шести 18 кДа субъединиц (Hebraud, Guzzo, 2000). Нозерн-блот анализ показал присутствие его 0.8 kb мРНК в клетках во время фазы экспоненциального роста, а также значительное увеличение количества мРНК этого белка как после падения, так и после возрастания температуры (Hebraud, Guzzo, 2000).

CSPA является основным белком холодового шока E. coli, его синтез значительно возрастает в ответ на холодовой шок. Аминокислотная последовательность CSPA имеет 43% идентичности «домену холодового шока» эукариотического Y-box семейства белков, члены которого взаимодействуют с РНК и ДНК для регуляции их функций. Показано, что CSPA кооперативной связывается с денатурировавшими под действием низко температуры одноцепочечными РНК, размером больше, чем 74 основания. Для его кооперативного связывания необходима минимальная концентрация CSPA 2.7х10^-5 М, что значительно ниже, чем присутствующая в клетке после холодового шока концентрация CSPA (10^-4 М). Для связывания CSPA не было установлено специфических последовательносте РНК, что показывает, что он может связываться с широким спектром последовательностей. Когда состоящий из 142 оснований 5’-нетранслируемый участок собственной мРНК CSPA был использован как субстрат для рибонуклеаз А и Т1, добавление CSPA значительно стимулировало гидролиз РНК путем предотвращения образования РНКазоустойчивых связей из-за образования стабильных вторичных структур в 5’-нетранслируемом участке. Эти данные показывают, что связывание CSPA с РНК дестабилизирует вторичную структуру РНК и делает ее доступно для рибонуклеаз. Предполагается, что CSPA действует как шаперон РНК для предотвращения образования вторичной структуры у РНК при низких температурах. Эта функция CSPA может быть необходима для эффективно трансляции мРНК при низких температурах и, по-видимому, может также оказывать влияние на процесс транскрипции (Jiang et al., 1997).

При падении температуры в клетках Escherichia coli обнаружена сильная индукция синтеза важнейшего белка холодового шока — CSPA. Поскольку этот белок весьма консервативен, был использован подход, основанный на PCR с использованием пары дегенерированных праймеров, полученных из высоко консервативных областей cspA-связанных белков, чтобы доказать присутствие как минимум трех связанных с cspA генов в Lactacoccus lactis. Один из них, cspB, был клонирован и секвенирован. Он кодирует белок из 66 аминокислот, который обладает 60% тождественности последовательности с CSPA из Escherichia coli. После холодового шока (падение температуры от 30 до 15⁰ C) уровень транскриптов мРНК CspB увеличивался, что было показано при помощи нозерн-блот гибридизации. Кроме того, наблюдалась индукция активности CSPB-зависимой бета-галактозидазы. Эти результаты указывают на то, что ген cspB из L. Lactis индуцируется холодовым шоком (ChapotChartier et al., 1997).

Белок холодового шока Bacillus subtilis, CSPB, после гипотермии влияет на уровень содержания нескольких других белков холодового шока в B. Subtilis. Экспрессия CSPB в Escherichia coli при 37⁰C — в условиях, когда белки холодового шока CSPA и CSPB E. Coli не обнаруживаются — приводит к заметному снижению скорости роста клеток и имеет значительное влияние на уровень синтеза других белков. При этом происходит как уменьшение, так и увеличение уровне синтеза специфических белков. В частности, индукция CSPB приводит к усилению активности бета-галактозидазы, экспрессированной из слитых транскриптов hns-lacz. Это увеличение отражает индукцию транскрипции hns и синтеза HNS после холодового шока и in vitro зависит от присутствия CSPA. Напротив, экспрессия мутантной формы CSPB (CspBf15a), которая неспособна связываться с суперскрученно ДНК in vitro, не имела влияния на степени увеличения экспрессии генов, уровня синтеза белка или активность бета-галактозидазы. Эти данные демонстрируют сильное влияние CSPB на синтез белка в E. Coli и предполагают аналогичную функцию для CSPA в E. Coli по сравнению с CSPB в B. Subtilis (Graumann, Marahiel, 1997). Однако впоследствии было установлено, что CSPA и CSPB по-разному связываются с одноцепочечной ДНК (Lopez, Makhatadze, 2000). В частности, в ходе этих исследований было установлено, что, если CSPB связывает поли-Т олигонуклеотиды примерно на порядок сильнее, чем поли-U или поли-С одноцепочечные ssДНК, тогда как CSPA связывает поли-Т, поли-U и поли-С ssДНК с одинаковой интенсивностью (Lopez, Makhatadze, 2000).

Как и другие бактерии, Bacillus subtilis обладает семейством гомологов небольших кислых белков (CSPB, CSPC и CSPD, идентичность более 70%), синтез которых индуцируется в ответ на холодовой шок. Делеция генов cspC или cspD не приводит к видимому изменению фенотипа; напротив, двойные мутанты по генам csp проявили серьезное снижение скорости клеточного роста как при 15⁰C, так и при 37⁰C и ухудшение выживаемости во время стационарно фазы роста. С помощью двумерного гель-электрофореза показано, что у двойных мутантов по генам csp разрегулирован синтез белка и потеря одного или двух белков

CSP приводит к увеличению синтеза остаточных CSP при 37⁰ C и после холодового шока, что позволяет предположить, что CSP ингибируют синтез других членов этого семейства белков. Тройной мутант cspB/C/D (64bcdbt) мог размножаться только в присутствии CSPB, перенесенного плазмидой, что свидетельствует о том, что хотя бы минимальное количество гена csp необходимо для жизнеспособности B. Subtilis. После холодового шока синтез CSPB в 64bcdbt был намного ниже, чем в клетках дикого типа, что сопровождалось прекращением роста и значительным уменьшением общего синтеза белка. Поскольку как CSPB, CSPC, так и CSPD показали способность связывать РНК кооперативным и интерактивным способом, предполагается, что белки CSP де ствуют как РНК-шапероны, облегчающие инициирование трансляции при оптимальных и низких температурах (Graumann et al., 1997).

При изучении характеристик CSPB было установлено, что CspB из Bacillus subtilis конформационно стабилен лишь в двух граничных состояниях, но чрезвыча но быстро меняет свою укладку между этими стабильными состояниями. Изучение соответствующих белков холодового шока из термофильно Bacillus caldolyticus и гипертермофильно Thermotoga maritima показало, что они обладают значительно более высоко конформационно стабильностью, но с неизменно очень быстро кинетико переходов между двумя стабильными состояниями. По-видимому, это неотъемлемое сво ство небольших белков, полностью состоящих из ^-изгибов (Perl et al., 1998).

В белке холодового шока CSPB из Bacillus subtilis имеются три незащищенных остатка фенилаланина (Phe 15, Phe 17 и Phe 27), которые необходимы для его функционирования при связывании с одноцепочечными суперскрученными нуклеиновыми кислотами. Обычно гидрофобные боковые цепи фенилаланина в складчатых белках спрятаны (Schindler et al., 1998). Авторами была предпринята попытка выяснить, может ли экспозиция этих остатков фенилаланина быть причино низко конформационной стабильности CSPB. В ходе экспериментов были измерены индуцированные мочевино и индуцированные нагревом равновесные переходы для трех мутантов CspB, у которых Phe 15, Phe 17 и Phe 27 индивидуально были заменены аланином. Неожиданной было обнаружено, что все три мутации сильно дестабилизировали CspB (Schindler et al., 1998). Таким образом, ароматические боковые цепи Phe 15, Phe 17 и Phe 27 в активном сайте важны и для связывания с нуклеиновыми кислотами, и для конформационно стабильности.

В целом, согласно современным представлениям, бактериальные белки холодового шока (CSP) функционируют как регуляторы трансляции и РНК-шапероны (Рис. 4). Во время роста при 37⁰С CSP связываются с мРНК и поддерживают ее в линейной форме. Во время трансляции рибосомы вытесняют CSP с мРНК, поскольку CSP обладают более низким сродством к мРНК. Во время холодового шока происходит резкое увеличение содержания CSP, поскольку это необходимо для уравновешивания возрастания стабильности вторично структуры мРНК.

Рис. 4. Модель функционирования бактериальных белков холодового шока (CSP) как РНК-шаперонов, сопрягающих процессы транскрипциии и трансляции мРНК (по Graumann, Marahiel, 1998).

Искусственное снижение концентрации CSP приводит к образованию вторичной структуры мРНК и прекращению процесса трансляции (Graumann, Marahiel, 1998).

Как показано выше, после резкого падения температуры (холодового шока) различные виды бактерий проявляют мультигенный ответ. Доказательства такого рода ответа на действие холода у Salmonella typhimurium были получены при определении диапазона индуцируемых низкими температурами слияний генов, содержавших Mudlux-вставки. Из выделенных Mudlux-слияний генов было найдено одно, которое не производило детектируемого свечения во время выращивания при 30⁰C, но проявило быстры и высоки уровень индукции при снижении температуры до 10⁰C. Мишень данного слияния гена (который был назван cspB), как было показано, расположена по соседству с umudc опероном и кодирует гомолог основного белка холодового шока Escherichia coli, CSPA. Изучение люминесценции показало, что детектируемое свечение происходило от слияния CspB::Mudlux при температурах ниже 22⁰C, но не при более высоких температурах, даже после падения температуры от 30⁰C. Более того, было обнаружено, что уровни содержания мРНК CSPB соответствуют данной модели люминесценции, что позволяет предлагать, что экспрессия cspB происходит ниже определенной пороговой температуры. Как было обнаружено, мРНК CSPB очень стабильна при 10⁰C, но становится чрезвычайно нестабильной, когда температура поднимается выше пороговой. Существующие клеточные РНКазы, таким образом, по-видимому, опосредуют разрушение мРНК CSPB при высоких температурах, но не способны совершать это при низких температурах (Craig et al., 1998).

Необходимо отметить, что белки холодового шока (CSP) у мезофильных и термофильных бактерий имеют большое сходство в структуре, но весьма отличаются в стабильности. Сравнение структуры CSP из мезофилов и гипертермофильной бактерии Thermotoga maritima показало большую значимость определенных заряженных групп белковой молекулы для ее стабилизации при низкой температуре (Frankenberg et al., 1999).

Среди белков холодовой адаптации бактерий особое внимание исследователей привлекли археи — психрофильные, мезофильные и термофильные метаногены. В ходе исследований было установлено, что адаптация этих бактерий к различным температурам роста (от 113°С до температур ниже 0⁰С) связана с определенными изменениями в первичной структуре полипептидов, в частности, фактора элонгации 2 (Thomas, Cavicchioli, 1998). Трехмерное моделирование структуры этого белка позволило идентифицировать аминокислотные остатки, которые могут быть важны для обеспечения его функционально активности при низких температурах.

Снижение температуры в течение 80 минут от 40 до 20⁰C останавливает рост Bacillus subtilis и значительно изменяет общие показатели макромолекулярного синтеза. Синтез белков в это время резко уменьшается и восстанавливается после охлаждения параллельно с восстановлением роста. Синтез РНК уменьшается до минимального уровня через 150 минут; впоследствии, транскрипция ускоряется до нового статичного уровня. Уровень синтеза ДНК после 80 минут холодового шока сначала падает до 20%, затем, после восстановления роста, он несколько увеличивается. Напротив, синтез фосфолипидов немедленно после падения температуры до 20⁰C устанавливается на новом уровне равновесия, при этом значительно изменяется состав полярных групп головок фосфолипидов. Это изменение предлагает эффективную адаптацию к холоду структуры бактериальной мембраны (Kunclova et al., 1995).

Synechococcus способен расти при температурах ниже оптимальной температуры роста, хотя и с меньше скоростью. Электрофорез в геле клеточных белков, меченных с ¹⁴C гидролизатом белка, из обработанных холодовым и тепловым шоком клеток, обнаружил различия в уровнях синтеза ряда белков. Молекулярный вес индуцируемых холодом (10-22⁰C) полипептидов был определен как 74, 64.5, 23, 17 и 14.7 кДа. Изучение синтеза белков во времени показало прогрессирующую индукцию некоторых белков холодового шока (CSP) при 13⁰C. Тепловой шок вызвал немедленную репрессию синтеза большинства нешоковых белков. Результаты исследований показали, что фотосинтетическая активность и области критических температур у Synechococcus зависят от температуры выращивания. Уменьшение потребления O₂ колебалось в пределах изученной низкотемпературной области от 37% до 47%. При температуре 10 и 13⁰C происходило быстрое ингибирование фотосинтетической активности (до 50%) после 17 и 29 минут, соответственно. Кроме того, при 13⁰C происходили изменения в спектре поглощения света образцом, что указывает на участие в данном случае общего механизма. Авторами предполагается, что холод вызывает функциональное отделение фикобилисом от хлорофилл-белкового комплекса (Hammouda, Borbely, 1996).

Индуцируемые закаливанием к холоду растворимые белки Chlorella vulgaris Beijerink IAM C-27 были выделены и очищены при помощи двумерной жидкостно хроматографии высокого разрешения (2d-hplc) на анионо-обменной колонке с последующеобращенно-фазовой хроматографией. Некоторые из белков были разделены при помощи SDS- электрофореза, охарактеризованы путем амино-терминального секвенирования и отождествлены путем поиска гомологии в базах данных. В ходе эксперимента было установлено увеличение содержания, по крайней мере, 31 белка. Особый интерес представляла собой индукция синтеза после 12 часов закаливания белка с мол. массой 10 кДа с амино­терминальной последовательностью аминокислот AGNKPITEQISDAVGAAGQKVG и индукция после 6 часов закаливания белка с мол. массой 14 кДа с амино-терминальной последовательностью ALGEESLGDKAKNAFEDAК. Амино-терминальные последовательности этих белков показывают, что они являются гомологичными с LEA- белками. Более того, уровень содержания белка 22-кДа также возрос после 12 часов закаливания. Амино-терминальная последовательность этого белка, AAPLVGGPAPDFTAAAVFD, показывает, что он имеет гомологию с тиоредоксин-пероксидазой (Honjoh et al., 1995).

Таким образом, низкотемпературный стресс вызывает значительные изменения в содержании некоторых водорастворимых белков. Среди индуцируемых низкотемпературным стрессом белков выделено несколько семейств, определены их функции в клетке во время низкотемпературного стресса и их характеристики.

Влияние гипотермии на активность и содержание ферментов в тканях высших растений

Значительное количество выполненных к настоящему времени работ посвящено влиянию гипотермии и акклиматизации к холоду на активность и новообразование различных ферментов. Так, было отмечено, что активность инвертазы при гипотермии у морозостойких сортов ржи и пшеницы повышалась, а у слабоморозостойких — снижалась (Колупаев и др., 1993). Понижение температуры приводит к значительным как качественным, так и количественным изменениям в изоферментных спектрах малатдегидрогеназы в листьях пшеницы (Makinen, Stegemann, 1981) и многолетних злаковых растений (Жибоедов и др., 1994). В проростках озимой пшеницы были обнаружены две специфические рибонуклеазы с различными температурными оптимумами активности (Sasaki, Sasaki, 1976). Благодаря их наличию изменение температуры может приводить к активации или инактивации различных рибонуклеазных систем, что создает возможность регуляции интенсивности синтеза РНК и белков (Браун, 1983).

В периоды осеннего закаливания и весеннего «пробуждения» растений озимой ржи изоферментны состав пероксидазы в узлах кущения претерпевает значительные изменения. Наблюдается значительное увеличение числа изоферментов, причем у морозоустойчивого сорта они образуются раньше и в большем количестве, чем у морозочувствительного сорта (Файзулин, Лукманова, 1987).

У кукурузы обнаружены две группы изоферментов пероксидазы, различающихся по реакции на гипотермию. Если изоферменты первой группы претерпевают лишь количественные изменения, связанные с увеличением содержания то или иной изоформы, то изоферменты второй группы претерпевают качественные трансформации, поскольку происходит изменение их антигенной структуры. Эти изменения зависят от напряженности стресса и холодоустойчивости линий кукурузы (Савич, 1990). Также были обнаружены качественные и количественные изменения изоферментов пероксидаз в подвергшихся охлаждению листьях пшеницы (Савич, Таджибаева, 1988). Обнаружены закономерности в изменениях пероксидаз сорго при гипотермии, при этом рассчитаны коэффициенты корреляции и их зависимость от длительности и интенсивности холодового стресса (Савич, 1989а,б).

При снижении температуры роста проростков пшеницы с 23 до 4⁰С наблюдалось возрастание активности сахарозосинтетазы, что вызывало быстрое увеличение уровня содержания сахарозы в листьях. Позднее при помощи антител к этому ферменту и использовании блоттинг-анализа при изучении экспрессии сахарозосинтетазы у пшеницы во время холодовой акклиматизации было установлено, что при понижении температуры до 4⁰С в течение 14 дне происходит увеличение количества пептида сахарозосинтетазы в 5 — 6 раз (Crespi et al., 1991).

Также было отмечено возрастание активности высокомолекулярно формы фосфофруктокиназы в листьях райграса многолетнего, подвергшихся холодовому закаливанию. При этом активность фосфофруктокиназы с низкой молекулярной массой оставалась без изменений (Breedemeijer, Esselink, 1994).

Другими авторами было отмечено значительное увеличение активности сахарозофосфатсинтетазы в листьях при низкотемпературной обработке. Это увеличение происходило из-за синтеза субъединиц фермента как во время, так и после действия гипотермии (Guy et al., 1992б).

При закаливании проростков озимой пшеницы в первой (+2⁰С) и второ (-4⁰С) фазах закаливания отмечалось повышение активности пептидгидролаз, причем максимальная активность наблюдалась у морозоустойчивого сорта после второй фазы закаливания (Вовчук и др., 1994).

Скрининг рибулозобифосфаткарбоксилазы у различных по холодоустойчивости сортов риса позволил установить, что у растений чувствительного к холоду сорта при гипотермии содержание мало и большой субъединиц Rubisco уменьшается, у устойчивого к холоду сорта их содержание увеличивается, а у растений среднеустойчивого к холоду сорта — остается без изменений (Shakya, A rawal, 1993).

При изучении вклада антиоксидантов в акклиматизацию к холоду в различных тканях выращенных в темноте проростков кукурузы (Zea mays L.) в отношении холодоустойчивости и защиты от вызванного образованием льда окислительного стресса было установлено, что охлаждение вызывает накопление H₂O₂ как в колеоптиле и листе, так и в мезокотиле, но не в корнях, в то время как акклиматизация предотвращает этот процесс. Ни один из противоокислительных энзимов не воздействовал на акклиматизацию при охлаждении в колеоптиле, листе и корне. Тем не менее, повышенные уровни глутатиона в акклиматизированных проростках могут содействовать увеличению способности перерабатывать H₂O₂ в колеоптиле и листе. В мезокотиле (визуально наиболее повреждаемом при охлаждении) уровень содержания каталазы увеличивался при акклиматизации проростков и это может быть перво стадией защиты от генерируемого митохондриями H2O2. Содержание девяти из наиболее известных изозимов пероксидазы индуцировалось акклиматизацие . Два из них локализованы в клеточной стенке, что позволяет предположить их участие в процессе лигнификации. Содержание лигнина увеличивалось в мезокотиле акклиматизированных проростков, по-видимому, для повышения прочности мезокотиля. Содержание одного изозима цитозольной глутатион-редуктазы существенно уменьшалось в акклиматизированных проростках, в то время как двух других — увеличивалось, что, возможно, повышает эффективность энзима при низко температуре. Все это, взятое вместе, иллюстрирует потенциальные пути в акклиматизации к охлаждению, при помощи которых может улучшаться выживание проростков кукурузы (Anderson et al., 1995).

Антиоксидантная активность ферментов была определена в первых, третьих и пятых ярусах листьев четырех имеющих различающуюся чувствительность к охлаждению инбредных линий кукурузы (Zea mayz L.). При фотопериоде 16:8 (свет: темнота) растения подвергались одному из трех видов воздействия: (1) контроль (25⁰C), (2) контрольная обработка плюс воздействие краткосрочным холодовым шоком (11⁰C 1 день перед уборкой урожая) и (3) долговременного (11⁰C постоянно) охлаждения. В ходе экспериментов были оценены активность каталазы (CAT; EC 1.11.1.16, аскорбатпероксидазы (ASPX; EC 1.11. 1.11), супероксиддисмутазы (GR; EC 1.15. 1.1), глютатионредуктазы (GR; EC 1.6.4.2), и монодегидроаскорбатредуктазы (MDHAR; EC 1.6. 5.4). Как общие метаболические индикаторы стресса, были определены редуцированные и нередуцированные сахара и концентрация крахмала. Установлено, что уменьшение активности CAT, ASPX и MDHAR может вызывать снижение устойчивости к охлаждению на ранних стадиях развития у кукурузы. Обнаруженные изменения в уровнях содержания сахара и крахмала указывают на более быстрое уменьшение утилизации углеводов по сравнению с уровнем фотосинтеза в чувствительно к охлаждению линии при краткосрочном холодовом шоке и предложительной вносят большой вклад в акклиматизацию в толерантных линиях в течение длинного периода охлаждения (Hodges et al., 1997).

Для исследования влияния стресса на экспрессию сахарозосинтетазы сахарно свеклы из корне Beta vulgaris с использованием гетерологично кДНК сахарозосинтетазы из картофеля была выделена кДНК сахарозосинтетазы. Клон кДНК длиной 2762 основания, обозначенный SBSS 1, кодирует полипептид из 822 аминокислотных остатков с предсказанной молекулярной массой 93,7 кДа. Предсказанная аминокислотная последовательность сахарозосинтетазы имеет 65-70% гомологии с последовательностями сахарозосинтетаз других видов. РНК- блот анализ показал, что SBSS 1 предпочтительно экспрессируется в корнеплоде в нормальных условиях. Воздействие низко температуры и анаэробиоз вызывают увеличение содержания мРНК SBSS 1 в листьях и корнях. В то же время раневой стресс вызывает уменьшение содержания ее транскриптов (Hesse, Willmitzer, 1996).

При изучении механизма накопления фруктанов при холодовом воздействии (2⁰C, 6⁰C) использованы разновидности пшеницы (Triticum aestivum L. cv. Norin 61 и Yukichabo), отличающиеся по накоплению этих метаболитов. В ходе этих экспериментов был проведен сравнительны анализ изменений в содержании сахарозо-сахарозофруктозил трансферразы (SST; EC 2.4.1.99) и фруктанэкзогидролазы (FEH; EC 3.2.1.80). Было показано, что под действием низкой температуры с увеличением активности SST и уменьшением активности FEH концентрация фруктанов повышалась. Накопление фруктанов усиливалось при высокой активности SST при обработке низкой температурой (-2⁰C), что предлагает участие SST в накоплении фруктанов. При изучении разновидности пшеницы Norin 61, имеющей очень высокое накопление фруктанов и содержаще FEH высоко активности, было установлено, что с 10-ого дня действия температуры 6⁰C при увеличении активности FEH концентрации фруктанов у Norin 61 уменьшаются, что позволяет предполагать, что генотипическое различие в накоплении фруктанов в основном зависит от уровня активности FEH (Yukawa et al., 1995).

В листьях растений озимого масличного рапса (Brassica napus L. var. oleifera L. cv Jantar), выращенных в течение 3 недель при 2⁰C и затем подвергнутых в темноте кратковременному замораживанию и оттаиванию (-5⁰C в течение 18 часов с последующим оттаиванием 6 часов при 2⁰C), показаны возрастание морозоустойчивости растений и изменения в активности фенилаланин-аммоний лиазы (PAL, EC 4.3.1.5). Эти изменения заключались, во-первых, в значительном увеличении в общей и физической активности фермента, отмеченной в течение первых 2 дней обработки растения низкой температурой, и, во-вторых, кратковременном значительном увеличении активности PAL, отмеченной сразу после замораживания и оттаивания. Также наблюдались изменения в каталитических активностях фермента, экстрагированного из предварительно обработанных холодом листьев: K_m для L-фенилаланина уменьшалась от 25 до 20 рМ, оптимум pH приближался к 8.4, фермент стал менее чувствительным к суб- или супероптимальным температурам, хотя оптимальная температура для активности фермента (35⁰C) в целом не изменялась в ходе акклиматизации. Изменения в активности PAL в ходе акклиматизации растения к низким температурам указывают, что фенилпропаноидный метаболизм может играть важную роль в развитии устойчивости растений к низким температурам (Solecka, Kacperska, 1995).

Пируват-ортофосфат дикиназа (PPDK) — фермент, играющий важную роль в процессах C-4 фотосинтеза, — типичны чувствительны к холоду энзим. Тем не менее, холодоустойчивая форма энзима была выделена из листьев Flaveria brownii. Изучение сайтонаправленного мутагенеза в системе экспрессии с использованием E. Coli и кДНК к PPDK из F. Brownii (холодоустойчивый вид), F. Bidentis (холодочувствительный вид) и кукурузы (промежуточной холодоустойчивый вид), показало, что всего три аминокислоты (из 880 аминокислот полипептида) сильно влияют на холодочувствительность PPDK из Flaveria brownii. Анализ экспрессированной в E. Coli PPDK при помощи гель-фильтрации показал, что ассоциация субъединиц этого фермента и холодоустойчивость тесно связаны (Ohta et al., 1997).

Два сорта (морозоустойчивый Sadovo 1 и морозочувствительный San Pastore) озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) были использованы для анализа защитного эффекта молибдена во время промораживания растений, выращенных на кислых почвах. Авторы отслеживали эффект холодовой акклиматизации (2⁰C в течение 7 дне ) и промораживания (-5⁰C в течение 16 часов) на активности нитратредуктазы (NR), нитритредуктазы (NiR) и глутаминсинтетазы (GS) в листьях пшеницы, выращенной как на почве с pH 6.0, так и на почве с pH 4.5. Между сортами не было обнаружено никаких различи в изменениях активности ферментов, вызванных температурой. В течение холодовой акклиматизации активность трех ферментов повышалась независимо от pH почвы; это увеличение было наиболее выраженным для активности NADH:NR и сопровождалось увеличением содержания белка NR. Промораживание влияло только на активность NR в растениях, выращенных на кисло почве; наиболее сильный спад обнаруживался для активности NADH:NR и частично для активности FADH:NR. Молибден поддерживал рост озимой пшеницы cv. Sadovo 1 на почвах с pH 4.5, предохраняя от вызванного морозом спада активности NADH:NR (Yaneva et al., 1996).

Хотя и установлено, что устойчивость ATPазы V-типа при температурах от 0 до 4⁰C уменьшается в присутствии субстрата, механизм ее инактивации до сих пор малопонятен. Было проведено изучение индукции холодовой инактивации вакуолярной H⁺ATPазы при 0⁰C у кукурузы (Zea mays L.) при помощи различных нуклеотидных аналогов, которые были определены как конкурентные или неконкурентные ингибиторы ATP-зависимого протонного транспорта, в сравнении с субстратной ATP. При 30 минутной инкубации при 0⁰C в присутствии 10 мМ KNO₃ и 2 мМ MgSO₄ либо не было отмечено, либо было отмечено незначительное падение активности. Добавление 2 мМ ATP вызвало значительное ингибирование за тот же период. Неконкурентные ингибиторы, такие как 5′-аденилилимидо дифосфат и 2′-,3′-O-(4- бензоилбензоил)-аденозин трифосфат, не ускоряли потерю активности. Следовательно, связывание нуклеотидов не было достаточно для холодовой инактивации. Конкурентный ингибитор: диальдегид производная AMP, ускорял холодовую инактивацию H+-ATPазы, но значительно меньше, чем ATP. Во время холодовой инкубации ATP и диальдегид производная AMP гидролизовывались, в то время как два неконкурентных ингибитора нет. Гидролиз нуклеотидов при 0⁰C был связан со степенью холодовой инактивации. Эти результаты позволяют считать, что гидролиз нуклеотидов при 0⁰C, а не их связывание, вызывает нестабильность комплекса H⁺-ATPазы, которая ведет к холодовой инактивации (Brauer et al., 1995).

Для определения возможных механизмов, ответственных за дифференциальный ответ на низкие температуры, среди экотипов обладающей C-4 типом фотосинтеза сорной травы вида Echinochloa crusgalli (L.) Beauv., определялась специфическая активность пяти антиоксидантных ферментов, ответственных за устранение или уменьшение содержания свободных радикалов и перекиси водорода в течение индуцированного холодом фотоингибирования у 5-недельных растений двух популяций, собранных с мест с контрастным климатом — Quebec (QUE) и Mississippi (MISS). Активности ферментов измерялись при температурах, изменяющихся от 5 до 30⁰C. При низких температурах активности аскорбатпероксидазы, монодегидроаскорбатредуктазы, дегидроаскорбат-редуктазы и глутатионредуктазы были значительно выше в акклиматизированных к холоду растениях популяции QUE, чем в акклиматизированных к теплу растениях популяции MISS. Специфическая активность супероксиддисмутазы, оцененная при 5 и 25⁰C, была одинакова у растений обоих популяций E. crusgalli. Концентрации аскорбата не различались среди растений двух популяций, что позволяет считать, что наблюдаемые различия в специфической активности аскорбатпероксидазы, оцененной при 5 C, действительно отражают связанную с процессом фотоингибирования лучшую возможность энзима QUE редуцировать H₂O₂ до воды в температурных условиях. Усиление специфической активности четырех из пяти антиоксидантных ферментов, показанное в адаптированно к холоду популяции QUE при низких температурах, коррелирует с синдромом низкотемпературной адаптации, изученным у растений это популяции в более ранних исследованиях (Hakam, Simon, 1996).

Ферменты, модифицирующие компоненты клеточно стенки, по- видимому, играют критическую роль в изменении размера, формы и физических сво ств клеток растений. Предполагается, что регулирование такой модификационно активности может играть важную роль в течение морфогенеза и в выявлении изменени в развитии ряда признаков, которые возникают в ответ на внешние условия. Предшествующие работы показали, что ген Arabidopsis TCH4 кодирует ксилоглюканэндотрансглюканазу (XET), которая влияет на важнейшие гемицеллюлозы клеточно стенки растенийя. Экспрессия TCH4 эффективно усиливается в ответ на де ствие различных стимулов окружающе среды (включая прикосновение, ветер, темноту, теплово и холодово шок), а также гормонов ауксина и брассиностероидов. Было установлено наличие обширного XET-связанного семейства генов (XTR) в Arabidopsis. Дополнительно к TCH4, это семейство включает два прежде идентифицированных гена, EXT и Meri-5, и по крайней мере пять дополнительных генов. кДНК к семейству XTR обладают от 46 до 79% тождеством последовательности, и предсказанные белки XTR обладают от 37 до 84% тождеством. Все восемь белков включают потенциальную N- терминальную сигнальную последовательность, и большинство из них имеют консервативный мотив (DEIDFEFLG), который обнаруживается также в бациллярно бета-глюканазе и может быть важен для функционирования энзима. Семейство гена XTR обладает различно чувствительностью к факторам окружающе среды и гормонам. Величина и кинетика регулирования различаются для разных генов. Дифференциальное регулирование экспрессии этого сложного семе ства генов, которое может управлять сво ствами клеточных стенок и ткане во время развития и в ответ на возде ствие окружающе среды, предполагает участие связанных, но четко различающихся ферментов, модифицирующих клеточную стенку (Xu et al., 1996).

С помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS и флюорографии радиоактивно меченых in vivo белков было установлено, что синтез хитиназы в побегах бермудской травы “Midiron” и “Tifgreen” (Cynodon dactylon L. Pers. x C. transvaalensis Burtt-Davy) коррелирует с холодово акклиматизацие . Возрастающи синтез некоторых белков во время холодово акклиматизации в побегах Midiron коррелирует с больше морозоусто чивостью Midiron по сравнению с Tifgreen. Этот анализ предпринимался для того, чтобы, во-первых, охарактеризовать дальне шие изменения в белковом синтезе в побегах

Midiron и Tifgreen, и, во-вторых, идентифицировать регулируемые холодом белки (COR), кодируемые генами, экспрессия которых усиливается в течение холодовой акклиматизации. Растенийя выращивались 26 дне в растильнях с контролируемыми условиями среды во время акклиматизации [8/2⁰C (день/ночь) циклы с 10 часовым фотопериодом] или в неакклиматизирующих [28/24⁰C] условиях. Белки, синтезированные изолированными побегами, радиоактивно метились in vivo в течение 16 часов с S -метионином и S -цистеином. Было показано, что среди различных групп COR белков низкомолекулярные (около 20-28 кДа) основные белки COR синтезировались в большем наборе и больших количествах в побегах Midiron, чем в побегах Tifgreen. Основно белок COR 27-кДа синтезировался в побегах как Midiron, так и Tifgreen. Этот белок из побегов Midiron был обозначен COR27 и идентифицирован путем сиквенса белка как хитиназа (E.C. 3.2.1.14) (Gatschet et al., 1996).

Влияние гипотермии на активность и содержание ферментов бактерий

В качестве модели для изучения изменени в спектре белков под действием температуры было предложено использовать E. coli, поскольку было установлено, что среди 133 белков, идентифицированных у этого организма при помощи двумерного электрофореза и составляющих 70% массы белков клетки, некоторая часть значительно меняется при изменении температуры (Herendeen et al., 1979). Было также отмечено, что метаболическая координация в интервале температур 23-27°С достигается за счет увеличения активности, а не количества ферментов. При выходе температуры за рамки указанного диапазона происходит изменение содержания большинства белков, причем количество девяти из них увеличиваются в 5 — 25 раз. Содержание трех белков является простой линейной функцией температуры (убывающей для двух и возрастающей для одного белка) в интервале 13.5-16⁰С (Herendeen et al., 1979).

Психротропная бактерия, вырабатывающая акклиматизированную к холоду липазу во время роста при низких температурах, была выделена из почвы Аляски и идентифицирована как штамм Pseudomonas. У этого штамма был клонирован и секвенирован ген липазы (lipP). Вычисленная из нуклеотидно последовательности гена (924 основания) аминокислотная последовательность соответствовала белку размером 308 аминокислотных остатков с молекулярным весом 33714 Да. LipP также имеет консервативны консенсусны мотив с другими акклиматизированными к холоду липазами, такими, как липаза 2 из антарктическо Moraxella TA144 и гормон-чувствительная липаза млекопитающих. Пентапептид GDSAG предположительно содержит сериновый и BG дипептидны й активные сайты. LipP был очищен из экстракта рекомбинантных клеток Escherichia coli, содержащих плазмиду C600, кодирующую ген lipP. Фермент показал 1.3-позиционную специфичность по отношению к триолеин, p- нитрофениловым эфирам жирных кислот с короткими и средними цепями (C-4 и C-6), которые являлись для него хорошими субстратами. Фермент был стабилен при pH между 6 и 9, а оптимальны pH для ферментативного гидролиза трибутирина был около 8. Энергия активации для гидролиза p- нитрофенил бутирата и p-нитрофенил лаурата была определена как 11.2 и 7.7 кКал/Моль, соответственно, в температурном диапазоне между 5 и 35⁰C. Фермент был нестабилен при температурах выше, чем 45⁰C. Км фермента для p-нитрофенил бутирата увеличивалась с увеличением температуры. Фермент сильно ингибировался Zn²+, Cu²+, Fe³+ и Hg²+, но не ингибировался фенилметилсульфонилфлюоридом и динитрофенилфосфатом. Различные водорастворимые органические растворители, такие, как, например, метанол и диметилсульфоксид при концентрациях от 0 до 30% активировали фермент (Choo et al., 1998).

Цианобактерии способны в ответ на уменьшение температуры десатурировать жирные кислоты в липидах своих мембран. Цианобактерия Synechocystis sp. PCC 6803 содержит четыре десатуразы, которые специфически катализируют десатурирацию в @6, @9, @12 и A3 позициях жирных кислот. Уровни мРНК, транскрибированных с генов, кодирующих @6, @12 и A3 десатуразы, повышаются примерно в 10 раз, но в разной степени, при уменьшении температуры с 34 до 22⁰ C, в то время как уровень мРНК для @9 десатуразы остается константой. Увеличение уровне содержания мРНК было вызвано как усилением транскрипции, так и возрастающей устойчивостью мРНК к низкой температуре. Вестерн- блоттинг показал, что уровни содержания @6, @12 и A3 десатураз в разной степени повышаются при низко температуре, в то время как содержание @9 десатуразы остается постоянным. Эти наблюдения указывают на то, что экспрессия генов для четырех десатураз регулируется температурой различными путями (Los et al., 1997).

Влияние гипотермии на содержание мембранных белков.

Изменения в содержании водонерастворимых белков растений при гипотермии изучены гораздо слабее, чем водорастворимых. Данные по количественным изменениям этих белков при охлаждении и закаливании весьма противоречивы (Broun, Bixby, 1975; Gusta, Weiser, 1972; Kasperska- Palasz, Weinslinska, 1977б). Ранее исследователями были получены отдельные сведения о поведении белков в мембранах хлоропластов при закаливании растений к холоду (Huner, Macdowall, 1975). Было также обнаружено, что при охлаждении томатов в темноте изменяется синтез хлоропластного белка с молекулярной массой 35 кДа (Liu et al., 1994). Однако в последние годы изменения в содержании мембранных белков растений привлекают все большее внимание исследователе .

Вызванные холодом изменения в белках плазматических мембран, связанные с развитием морозоусто чивости, были изучены у проростков озимой ржи (Uemura, Yoshida, 1984) и у холодоустойчивой озимой пшеницы (Zhow et al., 1994). Объектом такойго рода исследований явились два сорта со значительными генотипическими различиями в способности к холодово акклиматизации: сорт ярово пшеницы Chinese Spring и сорт озимой пшеницы Norstar. После четырех недель холодового закаливания холодоустойчивость побегов озимой пшеницы возросла до -18°С, в то время как у яровой пшеницы только до -8⁰С. Холодоустойчивость корней растений обоих сортов возросла незначительно. Холодовая акклиматизация вызвала значительные как сорто-, так и тканеспецифичные изменения в электрофоретических спектрах белков плазматических мембран (Zhow et al., 1994). Уменьшение уровня содержания полипептидов с молекулярными массами от 22 до 31 кДа отмечалось как в корнях, так и в побегах растений обоих сортов пшеницы, при этом содержание полипептидов с молекулярными массами 26 и 28 кДа резко снижалось только после одной недели холодовой акклиматизации. Напротив, уровни содержания полипептидов 17, 18, 23, 52, 83 и 89 кДа возрастали в побегах озимой пшеницы, при этом увеличение количества полипептидов с молекулярными массами 17, 18 и 23 кДа было пропорционально увеличению холодоустойчивости. В то же время в корнях растений обоих сортов значительное увеличение отмечалось только для полипептида с молекулярно массой 17 кДа.

Содержание других белков корней озимой пшеницы, таких как 18 и 52 кДа, увеличивалось незначительно, содержание полипептидов с молекулярными массами 83 и 89 кДа не изменялось, а содержание полипептида с молекулярно массой 23 кДа в корнях растений обоих сортов уменьшалось. Белки плазматических мембран, содержание которых изменяется при холодово акклиматизации, авторами были разделены на две группы: 1) белки, содержание которых резко снижается в начале процесса холодово акклиматизации независимо от сорта или органа (26, 28 и 31 кДа) и 2) белки, содержание которых возрастает только в побегах холодоустойчивой озимой пшеницы (17, 18, 23, 52, 83 и 89 кДа) (Zhow et al., 1994).

При исследовании мембранных белков контрастных по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы Альбидум 114 и Безостая 1 было установлено, что первы лист растений морозоусто чивого сорта Альбидум 114 содержит больше мембранных белков и накопление их идет интенсивнее, чем у слабоморозоусто чивого сорта Безостая 1. После закаливания растений к холоду содержание мембранных белков хлоропластов первого листа у морозоусто чивого сорта возрастало, в то время как у слабоморозоусто чивого не изменялось. Было отмечено также большее содержание низкомолекулярных полипептидов у морозоусто чивого сорта. Так, если количество полипептида с молекулярной массой 14.5 кДа при закаливании растений пшеницы Альбидум 114 увеличивалось в 10 раз, то у пшеницы Безостая 1 увеличение происходило только в 1,5 раза. Предполагается, что эти полипептиды ответственны за процессы циклического фосфорилирования, вклад которого в образование АТФ увеличивается в неблагоприятных условиях (Джанумов, Кузанян, 1987).

При исследовании состава полипептидов митохондри озимой пшеницы при адаптации к низким температурам было установлено, что у холодоусто чивого сорта Мироновская 808 в спектре митохондриальных белков появляются полипептиды с молекулярными массами 85, 62, 55, 49 и 42 кДа, в то время как у малохолодосто кого сорта Безостая 1 — 83, 82, 56, 50, 45 и 43 кДа (Авхадиева и др., 1993, 1995).

Интересные данные были получены при цитохимическом изучении гликопротеинов на клеточных мембранах различающихся по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы во время холодового закаливания. При сравнении холодоусто чивого сорта Yanda 1817 и неустойчивого к холоду сорта Zhengzhou 39-1 было отмечено накопление гликопротеинов в виде частиц, распределенных на плазмалемме, эндоплазматическом ретикулуме, ядерной оболочке и тонопласте. После низкотемпературного стресса количество гликопротеинов на эндоплазматическом ретикулуме и ядерно оболочке у холодоусто чивого сорта резко возрастало. Отмечалась также их транспортировка в плазмодесмы. У неустойчивого к холоду сорта эти процессы не наблюдались (Jian et al., 1991).

Синтез двух хлоропластных белков с молекулярными массами 32 и 34 кДа в значительно степени индуцируется в ответ на прогрессивны водный дефицит в целых растенийях Solanum tuberosum (Pruvot et al., 1996). Эти хлоропластные засухоиндуцируемые стрессовые белки, накапливающиеся в строме и в тилакоидах, были обозначены CDSP 32 и CDSP 34, соответственно. Впоследствии были исследованы эффекты низко температуры и высоко концентрации соли на синтез белков CDSP. Было показано, что холодовая обработка растений не влияла на накопление белка CDSP 32, а солево стресс, наоборот, вызывал усиление его синтеза. Синтез тилакоидного белка CDSP 34 усиливался как после холодового, так и после солевого стресса (Pruvot et al., 1996). Значимое увеличение содержания абсцизовой кислоты (по крайней мере в 2.5 раза) было установлено в листях растенийях, подвергнутых водному дефициту, высокой концентрации соли или низкой температуре. Вклад абсцизовой кислоты в синтезе двух белков был исследован при помощи опрыскивания хорошо-увлажненных растений раствором 100 pM абсцизовой кислоты в течение 15 дне . Эта обработка вызывала 15-кратное увеличение содержания абсцизово кислоты в листьях. В то время как синтез белка CDSP 32 не индуцировался добавлением экзогенной абсцизовой кислоты, синтез белка CDSP 34 индуцировался им в значительно степени. Основываясь на этих результатах, был сделан вывод, что абсцизовая кислота является вероятным медиатором, усиливающим синтез CDSP 34 при засухе, низких температурах и высоко концентрации соли в среде, и что друго сигнал, вероятно, связанны с высоким осмотическим давлением, включает индукцию синтеза CDSP 32 (Pruvot et al., 1996).

Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные позволяют констатировать, что низкотемпературное возде ствие и закаливание к холоду приводят к значительным изменениям в содержании белков растений . Эти изменения в содержании белков отражают сдвиг баланса их синтеза и распада, что отражается на появлении или исчезновении ряда компонентов на электрофореграммах белковых смесе, выделенных из растений после гипотермии (Браун, 1983). В связи с этим представляется интересным рассмотреть изменения на посттрансляционном уровне, связанные с воздействием гипотермии.

Влияние гипотермии на фосфорилирование белков

Известно, что воздействие низких температур вызывает фосфорилирование ряда белков. Уменьшение фосфатазной активности при температурах ниже 12⁰С вызывает гиперфосфорилирование белка с молекулярной массой 58 кДа (РР58) в бесклеточном растительном экстракте. Температурный порог гиперфосфорилирования РР58 совпадает с температурным порогом индуцируемого холодом притока кальция. Поскольку приток кальция вызывается различными типами стресса, предполагается, что наблюдаемое прямое де ствие холода на фосфорилирование определенных белков позволяет клетке связать кальциевый сигнал с холодоспецифическими путями передачи (Monroy et al., 1997). Этими же авторами (Monroy et al., 1997) было показано, что акклиматизация к холоду и специфическая для холодово акклиматизации экспрессия генов cas в люцерне требуют индуцированного холодом притока кальция и фосфорилирования специфических синтезированных предварительно белков. Экспрессия гена cas15 была использована в качестве индикатора конечного пункта для выяснения роли фосфорилирования белков в передаче низкотемпературного сигнала в клетках люцерны. В то время как ингибитор протеинкиназы стауроспорин предотвращал холодовую индукцию cas15, ингибитор протеинфосфатазы — окадаиновая кислота индуцировала cas 15 при 25⁰C. Показано, что при возде ствии на клетки холодом общая активность клеточно протеинфосфатазы быстро уменьшается на 30%, но все это уменьшение может быть обусловлено почти полным ингибированием протеинфосфатазы 2A (PP2A). В ходе экспериментов установлено, что данная холодовая инактивация PP2A оказалась опосредованна притоком кальция и могла быть воспроизведена при 25⁰C обработкой клеток ионофором кальция A23187 или антагонистом кальциевого канала K8644. При обработке клеток холодом уровень содержания транскриптов и каталитическо субъединицы белка PP2A (PP2AC) не уменьшались, но в то же время связывание анти-pp2ac антител с нативным PP2AC возросло, что указывает на демаскирование эпитопа PP2AC (Monroy et al., 1998).

При исследовании действия холодового стресса на фосфорилирование in vitro белков в листьях проростков риса (Oryza sativa) было установлено, что экспонирование в течение 6 часов при 5⁰С двухнедельных проростков стимулирует фосфорилирование белка с молекулярной массой 60 кДа у холодочувствительного сорта риса IR 36. У холодоустойчивого сорта риса Kitaibuki этот белок исходно фосфорилирован. При исследовании ряда других сортов риса холодочувствительные сорта показывали сходное фосфорилирование по контрасту с холодоусто чивыми сортами риса (Komatsu, Kato, 1997).

Фосфорилирование белков является основным механизмом в регулировании функци белков хлоропластов. В субъединицах фотосистемы II тилакоидов хлоропластов, включая основную антенну светособирающего комплекса II и различные компоненты комплекса сердцевины, происходит обратимое фосфорилирование в зависимости от редокс-состояния электронных носителе . Недавно описан ранее неизвестны обратимы случа фосфорилирования для субъединиц CP29, которы ведет к конформационным изменениям и защите от холодового стресса. В этом исследовании было идентифицировано место фосфорилирования на N-терминальном конце экспонированного в строму домена. Было показано, что оно располагается в последовательности, не гомологичной другим участникам семейства Lhc. В хлоропластных мембранах данная фосфорилируемая последовательность уникальна, поскольку она удовлетворяет требованиям для киназы CK2 (казеин киназы II) (Testi et al., 1996) .

Исследование низкотемпературного ответа фосфопротеинов в изолированных ядрах было проведено W. Kawczynski и R. Dhindsa для выяснения вопроса, де ствуют ли низкие температуры, как термодинамически фактор, независимо в разных частях клетки.

Изолированные ядра люцерны (Medicago sativa) отвечали на холод быстрыми обратимыми изменениями в уровне фосфорилирования белков. Популяция таких регулируемых холодом фосфопротеинов и стимуляция холодом их фосфорилирования была больше у холодоусто чивого сорта Apica, чем у холодочувствительного сорта Trek. После четырехдневной холодово обработки проростков было обнаружено значительное дополнительное стимулированное холодом фосфорилирование белков в ядрах сорта Apica, в то время как у сорта Trek происходили лишь незначительные изменения. Более того, ядра из обработанных холодом проростков сорта Apica обнаруживали и высоки уровень накопления термостабильных белков (Kawczynski, Dhindsa, 1996). Эти результаты подтверждают ту точку зрения, что реакция на низкие температуры и акклиматизация происходят во всех живых частях клетки и накопление термостабильных ядерных белков может быть связано с морозоусто чивостью.