ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

Белки низкотемпературного стресса растений. Колесниченко А.В. 2003

Гены, связанные с низкотемпературной акклиматизацией

• Изменения в содержании нуклеиновых кислот при гипотермии
• Изменения экспрессии генов при гипотермии
• Семейство генов Wcs 120
• Специфические для низкой температуры гены, гены богатых глицином белков
• Гены дегидринов и гены, индуцируемые экзогенной абсцизовой кислотой
• Гены белков, связанных с процессом льдообразовании
• Гены, кодирующие белки, связанные с передачей кальциевых сигналов
• Гены белков холодового шока
• Гены протеинкиназ
• Гены картофеля, индуцируемые хранением на холоду
• Гены Y-box белков и белков, регулирующих процессы транскрипции и трансляции

Гены, связанные с низкотемпературной акклиматизацией

Количественные и качественные преобразования белков растений при снижении температуры предполагают индукцию или репрессию их синтеза. Необходимые доказательства правомерности такого заключения были получены при изучении отдельных стади белкового синтеза. Первая из них — транскрипция.

Изменения в содержании нуклеиновых кислот при гипотермии

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что, по сравнению с нормальными условиями, содержание ДНК при гипотермии меняется незначительно (Gusta, Weiser, 1972). Исследование возможности синтеза нуклеиновых кислот в ядрах клеток скерды волокнистой и триллиума во время охлаждения до температур, близких к 0⁰С, показало, что в этих условиях идет активное включение меченых соединений ( С-аденина, Н- тимидина) (Гриф, 1966). Включение метки становилось значительно интенсивнее при небольшом повышении температуры (до 1 — 2⁰С), либо при увеличении экспозиции (до 48 часов) (Гриф, 1966).

Цитофотометрический анализ содержания ДНК-фуксина в корневой меристеме семян озимых злаков показал, что охлаждение снижает репликативную и метаболитическую активности хроматина (Савин, Никитина, 1983). Способность хроматина поддерживать синтез РНК даже в присутствии эндогенного источника РНК-полимеразы заметно подавляется при охлаждении бобов. Возможно, это связано с тем, что при снижении температуры уменьшается доступность матрицы ДНК для полимеразы (Браун, 1983).

В дальнейших исследованиях было подтверждено положение о том, что содержание ДНК при гипотермии изменяется мало, а все изменения в метаболизме нуклеиновых кислот касаются, в основном, РНК. Показано, что низкотемпературная акклиматизация сопровождается увеличением содержания РНК, расхождения в данных о метаболизме ДНК, по- видимому, зависят от того, вычисляется ли содержание ДНК на единицу сырого или сухого веса. В некоторых случаях отмечаются связанные с гипотермией изменения в содержании транспортных РНК (Sarhan, D’Aoust, 1975), однако эти изменения наблюдались не всеми авторами (Gusta, Weiser, 1972). Кроме того, имеются данные об изменении активности тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы во время закаливания растения (Tao, Khan, 1974; Yang, Brown, 1974), что свидетельствует о регуляции в этих условиях синтеза белка на уровне трансляции (Браун, 1983).

Изменения экспрессии генов при гипотермии

Как известно, в клетках растений, насекомых, млекопитающих как тепловой, так и холодовой шок вызывает изменения в активности генов (Ashburner, Bonner, 1979; Tanguay, 1983; Guy et al, 1985; Tseng, Li, 1990). При этом начинается синтез небольшого числа «белков теплового шока» и прекращается (или сильно замедляется) синтез всех остальных белков. Вероятно, в упомянутых в предыдущем разделе работах (Браун, 1983; Савин, Никитина, 1983) зарегистрирована репрессия при холодовом шоке активности большинства генов, функционирующих в «нормальных» условиях. Если продолжить аналогию между тепловым и холодовым шоками, то следует ожидать, что при понижении температуры в определенных границах начнут функционировать специфические гены (Guy et al., 1985). В этой связи становится понятной противоречивость данных об изменении содержания РНК при гипотермии. Значительная часть авторов указывает, что во время охлаждения и холодового закаливания у растений повышается общее содержание РНК (Jung et al., 1967; Oslung, Li, 1972; Vigue et al., 1974; Chen, Li, 1977), но имеются и противоположные результаты (Scholtissek, 1967; Лебедев, Комарницкий, 1971). Изучение специфических видов РНК после фракционирования показало относительное повышение содержания РНК, действующе на уровне трансляции (имеются в виду, прежде всего, рибосомальные РНК) (Gusta, Weiser, 1972). Низкотемпературное закаливание растения приводит к структурным изменениям в рибосомах (Bixby, Brown, 1975).

Ч. Гай с соавт. (Guy et al., 1985). привели прямое доказательство того, что гипотермия индуцирует изменения в экспрессии генов. Используя трансляцию в бесклеточной системе, они показали, что под действием низких положительных температур (5⁰С) происходит быстрое и стабильное изменение набора поли(А)+мРНК, выражающееся в появлении специфических РНК холодового стресса. Изменение набора поли(А)+мРНК происходило уже в первые сутки закаливания, при этом начиналось развитие холодоустойчивости, (она достигала максимума на 14-21 сутки закаливания). С началом развития устойчивости коррелировало появление двух мРНК, которые в бесклеточной системе определяют синтез белков холодового шока с молекулярными массами 82 и 180 кДа. В последующие 8 суток продолжается изменение состава мРНК: содержание четырех мРНК увеличивается, а трех — значительно уменьшается. Большая часть белков, синтез которых индуцировался гипотермие , не идентична по молекулярным массам и pI белкам теплового шока (Guy et al., 1985). Таким образом, это сообщение является одним из первых свидетельств существования в растениях белков холодового шока (БХШ), отличных от белков теплового шока (БТШ).

Быстрое изменение набора мРНК с началом холодового закаливания было впоследствии подтверждено другими исследователями (Mohapatra et al., 1987; Hahn, Walbot, 1989; Tseng, Li, 1990). Так, было показано (Mohapatra et al., 1987), что двухдневная экспозиция проростков люцерны при 4⁰С приводит к резкому увеличению содержания общего количества РНК и к изменению состава транслируемых мРНК. Трансляция in vitro поли(А)⁺мРНК, с последующим электрофорезом меченых полипептидов, показала индукцию синтеза низко- и высокомолекулярных белков холодового шока. При переносе растений в условия с «нормальной» температурой происходило обратное изменение спектра полипептидов и, следовательно, набора мРНК. Показано, что мРНК, индуцируемые охлаждением, накапливаются с различно скоростью. При трансляции in vitro обнаружены группы белков с различной индукцией синтеза de novo — от 6 до 12 часов, а также белки, содержание которых при холодовом закаливании снижается (Cattiveli, Bartels, 1989).

В последующие годы изучение изменений в синтезе РНК при низкотемпературном стрессе привлекло особое внимание исследователе . К настоящему времени выделено и охарактеризовано значительное число мРНК, экспрессирующихся при низкотемпературном стрессе и в процессе адаптации растения к низким температурам. В частности, установлено, что, например, в люцерне во время холодовой акклиматизации накапливаются две мРНК, MsaCiA и MsaCiB, которые кодируют белки, содержащие богатые глицином мотивы. Слитые полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, выведенные на основании этих мРНК, продуцировались в E. coli и были использованы для получения антител. Полученные антитела обладали кросс-реактивной специфичностью с растворимыми полипептидами MsaCiA и MsaCiB, соответственно. Эти полипептиды обнаруживались только в верхушках закаленных растений хотя во время холодовой акклиматизации мРНК для

MsaCiA накапливалась как в верхушках, так и в стеблях. Анализ белков при помощи вестерн-блоттинга показал, что MsaCiA-подобные белки с молекулярными массами 32, 41 и 68 кДа накапливались в клеточных стенках стеблей, и один, с молекулярной массой 59 кДа, — в клеточных стенках побегов. Показано, что эта дифференциальная экспрессия включает как транскрипционную, так и посттрансляционную регуляцию. Сравнение, проведенное между шестью сортами люцерны с контрастно морозоустойчивостью, подтверждает то, что способность накапливать до значительного уровня белки, подобные MsaCiA и MsaCiB, может быть связана с устойчивостью растения к низким температурам (Ferullo et al., 1997).

В ходе исследований экспрессии генов при низких температурах было выявлено несколько групп генов, экспрессия которых индуцируется холодовым шоком и адаптацией растения к низким температурам. Далее будут рассмотрены основные семейства таких генов.

Семейство генов Wcs 120

Озимые, по сравнению с яровыми злаками, обладают эффективными механизмами акклиматизации, которые позволяют им перезимовывать и выживать при температуре замерзания почвы. Это различие генетически запрограммировано и включает в себя сложную генетическую систему. Чтобы понять характер данной системы и ее регуляцию низкими температурами, были идентифицированы и охарактеризованы гены пшеницы (Triticum aestivum L.), устойчивой к замерзанию почвы. В ходе этих исследований установлено, что семейство гена wcs120 кодирует группу белков с молекулярными массами от 12 до 200 кД. Как показано при помощи биохимических, иммуногистохимических и молекулярно­генетических анализов, данное семейство генов, специфическое у Poaceae, весьма многочисленно и координированно регулируется низкими температурами. Более того, накопление белков WCS прямо коррелирует с уровнем устойчивости растений к замерзанию почвы. Эти анализы обнаружили также регуляторны контроль процесса яровизации при экспрессии генов низкой температуры у озимых злаков (Sarhan et al., 1997).

Индуцируемые низко температурой у пшеницы гены семейства wcs120 были картированы с использованием вестерн- и Саузерн-блоттинга на дителоцентрических сериях сорта Chines Spring. Идентифицированные гены были локализованы в длинных участках гомологичных групп 6-х хромосом всех трех геномов (A, B и D) гексаплоидной пшеницы. Близкие виды, также несущие A, AB или D геномы также исследовались с использованием вестерн- и Саузерн-блоттинга с wcs120- зондами и WCS120- антителами. Все близкородственные виды несли один или более геномов гексаплоидной пшеницы и продуцировали 50 кДа белок, реагирующий с антителами и определяемый при помощи вестерн- блоттинга, и wcs120-гомологи, которые определялись при помощи Саузерн-блоттинга во всех видах. Отсутствие участка 6DL хромосомы в гексаплоидной пшенице сорта Chines Spring вызывало отсутствие синтеза 50 кДа белка, что не только указывало на локализацию wcs120 в данном участке 6DL-хромосомы, но также и подтвердило молчание wcs120- гомологов в 6А хромосоме. Были также исследованы содержание белков, реагирующих с антителами на WCS120, и уровни холодоустойчивости в сериях лини с заменой хромосом сорта Chines Spring на хромосомы сорта Cheyenne. В ходе экспериментов было установлено, что 5А хромосома сорта Cheyenne увеличивала холодоустойчивость пшеницы сорта Chines Spring. Денситометрия вестерн-блоттингов для определения содержания белка показала, что хромосома 5А имеет регуляторны эффект на экспрессию гена семейства wcs120, располагающегося на хромосомах 6-ой группы всех трех геномов гексаплоидной пшеницы (Limin et al., 1997).

Специфические для низкой температуры гены, гены богатых глицином белков

Специфическая для низко температуры (2 ⁰C) кДНК пшеницы pTACR7, представляет ген, определенный как tacr7 из озимой пшеницы (Triticum aestivum L. Cv. Winoka). Термин низкотемпературно­специфически (LTS) используется авторами, поскольку экспрессия гена tacr7 не вызывается обработкой экзогенной абсцизовой кислотой или другими типами стресса, такими, как солевой стресс, обезвоживание и тепловой стресс. PTACR7 был выделен при помощи олигонуклеотидного зонда, сходного с pHVCR8 (номер в генетическом банке L28091) из ячменя посредством RT-PCR с мРНК из ткани побегов пшеницы. На основании предсказанной аминокислотной последовательности были определены характеристики этого белка. Установлено, что TACR7 очень гидрофобный белок, с единственно трансмембранной областью и богат лейцином (19%). Изучение уровней содержания копий tacr7 показало их накопление в проростках пшеницы, верхушечной ткани и каллусной культуре после переноса объектов из контрольных условий (25⁰C) на холод (2⁰C). В ходе экспериментов наблюдалось отсутствие обнаруживаемых нозерн- гибридизацие транскриптов pTACR7 в проростках или каллусах, обработанных экзогенной абсцизовой кислотой, после солевого стресса, обезвоживания или теплового стресса. Транскрипты tacr7 накапливались в ткани меристемы во время экспонирования при 2⁰C в больше степени в холодоустойчивой озимой пшенице (SD(mut)16029), чем холодочувствительной (SD(mut)16169) с наибольшим различием между генотипами (около 30%±3%) на третьей неделе закаливания. Таким образом, кодируемый tacr7 белок по своим характеристикам уникален среди описанных в литературе индуцируемых низко температурой белков пшеницы (Gana et al., 1997).

При изучении мутации сердцевины пентамера CCGAC двух предполагаемых индуцируемых низко температурой элементов в 5′- области индуцируемого холодом гена BN115 озимого рапса (Brassica napus) при помощи анализа нерезидентной экспрессии равнодействующих мутированных слияний BN115-промотор-GUS было установлено уменьшение низкотемпературного регулирования промотора. Это указывает на то, что последовательность CCGAC в гене BN115 является чрезвычайно важно для его ответа на низкую температуру. Напротив, мутация двух G-боксов CACGTG, находящихся между индуцируемыми низко температурой элементами в то же области промотора, не изменила индуцируемую холодом экспрессию гена. Замена возможно области энхансера промотора BN115 на энхансер из промотора CaMV 35S выразилась в увеличении уровня низкотемпературной индукции экспрессии GUS (Jiang et al., 1996).

При изучении кДНК ячменя были получены ген-специфические зонды (с 3′ конца кДНК), кодирующие два типа глицин-богатых белков: HvGRP2, характеризуемый цитокератин-подобной и цистеин-богато областями, и HVGRP3, чья основная особенность — наличие РНК-связывающей области. В ходе исследования было установлено, что экспрессия генов HvGRP2 и HVGRP3, которые присутствуют в одной или двух копиях на каждый гаплоидный геном, была повсеместной, и было показано, что ген HVGRP3 модулируется изменением условий освещения. Холодовой воздействие также увеличивало уровни содержания мРНК HvGRP2 и HVGRP3 (Molina et al., 1997).

При изучении действия окружающей среды на экспрессию индуцируемых холодом генов на уровне изменения содержания мРНК и тестировании взаимосвязи экспрессии генов и холодно акклиматизации растений ячменя (Hordeum vulgare L. Cv. Igri) в фазе третьего и четвертого листа было проведено несколько вариантов опыта. В первом варианте растения были выращены в различных температурных условиях между 20/15⁰C и +4/-4⁰С, во втором варианте растения были перенесены с температуры 20/15⁰C на температуру 6/2⁰C и в третьем варианте опыта растения были выращены в условиях засухи или недостатка питательных веществ. В ходе экспериментов измерялись при помощи метода отрастания морозоустойчивость растений и уровни содержания мРНК для трех индуцируемых холодом генов: blt4.9, blt14 и blt101 из меристематических тканей побегов. Результаты экспериментов показывают, что закаленность растений и уровни экспрессии мРНК генов blt4.9, blt14 и blt101 повышались при более низких температурах роста. В ходе экспериментов было также установлено, что на степень изменения содержания мРНК этих генов в ответ на изменение температуры среды значительное влияние оказывали предшествующие температурные условия и возраст растения. При этом уровень закаленности растений сильно коррелировал с уровнями содержания мРНК этих генов в растениях, выращенных в различных температурных условиях. Эта корреляция не распространялась на растения, подвергнутые действию недостатка питательных веществ или засухи (Pearce et al., 1996).

При изучении влияния низкой температуры на экспрессию генов в Poncirus trifoliata из закаленных к холоду растений были клонированы шесть кДНК, представляющие уникальные индуцируемые холодом последовательности. В ходе экспериментов было обнаружено, что гены pbcorc115 и pbcorc119 принадлежат к одному семейству генов. Данные сиквенса указывают на то, что pbcorc115 и pbcorc119 содержат открытую рамку считывания, кодирующую полипептид с молекулярно массой 19.8 кДа (COR19) и полипептид с меньшей молекулярной массой 11.4 кДа (COR11), соответственно. Анализ предсказанной аминокислотной последовательности обнаружил три больших повтора в COR19 и только один повтор в COR11. В каждом повторе были выявлены два элемента — Q-кластеризованный тракт и K-богатый мотив. K-богатый мотив был сходен с подобными мотивами у белков класса D-II из хлопка и группы 2 белков LEA. Сериновый кластер, характерный для многих сходных с группой 2 LEA белков, также был найден в этих белках. В то же время было обнаружено, что в них он находился в необычном положении относительно карбокси-конца. В COR19 и COR11 также присутствовал двусторонний мотив основных остатков, сходных с известными ядерными маркерными последовательностями, что позволяет предположить, что члены данного семейства белков могут иметь ядерную маркерную функцию. В ходе экспериментов авторами была исследована экспрессия мРНК COR19 в ответ на холодовую акклиматизацию, засуху, затопление и засоление. Результаты показали, что экспрессия COR19 в ткани листа индуцировалась в ответ на холодовую акклиматизацию, но подавлялась во время засухи и затопления (Cai et al., 1995).

W. Goodwin с соавторами при изучении озимого рапса (Brassica napus) изолировали кДНК и выделили ген, кодирующий гибридны богатый пролином белок. Предполагаемый белок по структуре является модульным. При анализе его аминокислотной последовательности установлено, что N-терминальная область данного белка имеет свойства сигнального пептида, который может направлять белок в эндоплазматический ретикулум. Последовательность аминокислот от 27 до 287 имеет три области, которые содержат высокие уровни содержания пролина и нескольких других аминокислот, часто встречающихся в богатых пролином белках клеточной стенки. Эти области характеризуются повторяющимся аминокислотным мотивом. С-терминальная область (аминокислоты от 288 до 376) содержит три предполагаемых мембранно- связывающих участка и имеет высокую степень сходства с аминокислотами некоторых разновидностей гибридных богатых пролином белков. На основе этих данных авторы делают вывод, что данный белок секретируется из клетки, размещается в клеточной стенке и заякоривается в плазматической мембране посредством С-терминальной области. В ходе экспериментов установлено, что транскрипты, кодирующие данный белок, индуцируются в ткани листа в течение 8 ч обработки холодом и их содержание быстро снижается при возвращении растения к нормальным температурам. В то же время установлено, что транскрипты не индуцируются тепловым шоком, обезвоживанием, экзогенной абсцизовой кислото или раневым стрессом, тогда как транскрипты контрольного гена napus индуцируются обезвоживанием и экзогенной абсцизовой кислотой (Goodwin et al., 1996).

При изучении экспрессии генов кукурузы были выделены кДНК (zmEF1a) и соответствующий геномный клон (zmgEF1a) члена семейства генов, кодирующих a-субъединицу фактора элонгации трансляции 1 (EF1a). Предсказанная аминокислотная последовательность из 447 остатков прерывается в гене одним интроном. Саузерн-блот анализ показал, что клонированный ген ef1a — один из семейства, состоящего, по меньшей мере, из шести генов. Как показал нозерн-блот анализ, содержание мРНК данного белка в листьях кукурузы увеличивается при низко температуре, в то время как в корнях уровень мРНК ef1 a резко уменьшается. Эти результаты показывают, что экспрессия EF1a дифференцированной регулируется в листьях и корнях во время холодового стресса (Berberich et al., 1995).

Гены дегидринов и гены, индуцируемые экзогенной абсцизовой кислотой

Одними из наиболее изученных семейств генов, индуцируемых низко температурой, являются гены дегидринов и гены, индуцируемые экзогенной абсцизовой кислотой. Гены данных семейств к настоящему времени обнаружены практически во всех изученных видах растений — как травянистых, так и древесных.

При селективном исследовании с использованием первичных антител против богато лизином области дегидринов библиотеки кДНК, созданной из закаленных тканей коры персика, было обнаружено, что некоторые клоны обладают высокой степенью сходства с дегидринами. Нозерн- блоттинг с использованием клона 5А показал, что 1,8 kb участок экспрессировался сезонно и в листопадных, и в вечнозеленых генотипах, а также индуцировался водным дефицитом. Вечнозеленые и листопадные генотипы значительно различались как по их способности к холодовой акклиматизации, так и по сезонно экспрессии транскриптов и белков дегидринов. У обоих генотипов максимум экспрессии транскриптов был отмечен зимой и они не обнаруживались в мае — июле. Экспрессия белков была сходна с экспрессией транскриптов, в то же время экспрессия белка в вечнозеленом генотипе значительно увеличивалась после накопления транскриптов. Полученные данные указывают на то, что во время холодовой акклиматизации могут существовать различные уровни регуляции дегидринов (Artlip et al., 1997). В ходе исследований авторами также был изолирован клон G10a, содержащий полный ген дегидрина, обозначенный ppdhn1. Этот ген кодировал белок из 472 аминокислот с предсказанным размером 50020 Да. Кодируемый белок (PCA 60) содержит девять богатых лизином повторов, характерных для дегидринов и два DEYGNP мотива. Генный блот с использованием зонда к клону 5а показал, что в персике имеется один или два высокогомологичных гена (Artlip et al., 1997).

При изучении белков, экспрессирующихся в ответ на низкие температуры у Brassica napus, был очищен до почти гомогенного состояния рекомбинант из белка BN28 (rBN28) и была определена его структура. Антитетела, полученные против rBN28, были использованы для характеристики рекомбинантного и нативного белков. Похожи на многие другие индуцируемые низко температурой белки, BN28 необычайно гидрофилен и термостабилен настолько, что остается в растворе после кипячения. Иммуноблот-анализ клеточных фракций показал, что BN28 не был ассоциирован с клеточными мембранами и находился исключительно в растворимой фракции клетки. Хотя ранее предполагалось, что BN28- подобные белки из Arabidopsis thaliana должны обладать антифризной активностью, такая антифризная активность не была определена при рекристализации льда с rBN28 (Boothe et al., 1997).

Из библиотеки кДНК, изготовленной из акклиматизированных к холоду этиолированных проростков рапса (Brassica napus cv Samourai) был изолирован клон, соответствующий регулируемому холодом гену. Анализ последовательности и поиски гомологи показали, что этот ген кодирует белок, гомологичный с ATP-зависимой фосфоенолпируват карбоксикиназой (PEPCK, EC 4.1.1.49) из Saccharomyces cerevisiae,

Trypanosoma, Rhizobium sp., и Escherichia coli. Аналог из B. napus был обозначен как BnPEPCK. Потенциальный ATP-связывающий сайт, существующий во всех белках PEPCK, также обнаруживался и в BnPEPCK. Хотя в ходе исследований и была установлена конститутивная экспрессия BnPEPCK в контрольных проростках при комнатной температуре, было также установлено, что уровень содержания копи его мРНК статистически достоверно повышался при 4 ⁰C и уменьшался до контрольного уровня, когда проростки возвращались на контрольную температуру (22 ⁰C). Использование антител, полученных против рекомбинантного гистидин-BnPEPCK слитого белка, продемонстрировало, что уровень содержания белка BnPEPCK коррелирует с накоплением транскриптов Bnpepck (Saezvasquez et al., 1995).

Для экспериментов, имеющих целью понять механизмы развития морозоустойчивости, индуцированной экзогенной абсцизовой кислотой, были использованы культивируемые клетки эмбрионов озимой пшеницы (T. aestivum, cv Chihoku). Культивируемые клетки обрабатывались 50 цМ абсцизовой кислоты в течение 5 дней при 23 ⁰С для достижения максимального уровня морозоустойчивости (ЬТ₅₀= -26.6 ⁰С). Возросшая морозоустойчивость обработанных экзогенной абсцизовой кислотой клеток была тесно ассоциирована со значительным накоплением в плазматической мембране полипептида с молекулярной массой 19 кДа. 19- кДа полипептидны компонент был выделен путем препаративного гель- электрофореза и далее разделен на мажорную (AWPM-19) и минорную полипептидную компоненту при помощи Трицин-SDS-PAGE. Была определена N-концевая аминокислотная последовательность AWPM-19 и при помощи PCR из библиотеки, выделенной из обработанных экзогенной абсцизовой кислотой культивируемых клеток, был выделен клон кДНК (wpm-1), кодирующий 18.9 кДа гидрофобный полипептид AWPM-19, с четырьмя мембранно-связываемыми доменами и щелочно точкой pI (10.2). Экспрессия мРНК wpm-1 сильно индуцируется обработкой в течение нескольких часов 50 мМ абсцизовой кислоты. Эти результаты показывают, что AWPM-19 должен быть тесно связан с индуцируемым экзогенной абсцизовой кислотой увеличением морозоустойчивости у культивируемых клеток пшеницы (Koike et al., 1997).

Гены белков, связанных с процессом льдообразования

Установлено, что бактериальный ген, связанны с образованием льда, inaZ при перемещении в трансгенные растения вызывает образование ядер льда. Предварительная инкубация преобразованной ткани растения при температурах около 0 ⁰C существенно повысила активность нуклеации льда в растениях, хотя максимальная активность нуклеации льда была достигнута только после низкотемпературной обработки продолжительностью около 48 часов. Хотя трансгенные растения содержат сходные количества мРНК inaZ как при «нормальных», так и при низких температурах, установлено, что низкие температуры необходимы для накопления белка INAZ. Предлагается, что устойчивость INAZ белка и, таким образом, активность нуклеации льда в трансгенных растениях усиливается при низкотемпературной обработке (Vanzee et al., 1996).

Гены, кодирующие белки, связанные с передачей кальциевых сигналов

Вопрос о механизме восприятия и трансформации сигнала в клетках растений к настоящему времени все еще изучен недостаточно. Установлено, что роль вторичного посредника в передаче стрессовых сигналов у различных организмов, в том числе и у растений, играют ионы Ca²+ (Kikkawa, Nishizuka, 1986; Boss, 1989; Khight et al., 1991, 1992). В клетках растений, не подвергнутых действию стресса, уровень содержания Ca²+ при помощи активных Ca²+-транспортирующих систем поддерживается на низком, наномолярном уровне. Холодовой шок вызывает резкое увеличение концентрации Ca²+ в цитоплазме (Khight et al., 1992). На животных клетках во время стресса были показаны активации ионами Ca²+ протеинкиназы С (Kikkawa, Nishizuka, 1986) и Ca²+- кальмодулинзависимой протеинкиназы (Hanson, Schulman, 1992), вызывающие изменения экспрессии генов. Для выяснения роли Ca²+ процессах ответа растения на низкотемпературный стресс и адаптации к низко температуре были проведены эксперименты по изучению влияния хелатора Ca²+ — ЭГТА и блокаторов кальциевых каналов — La³+ и верапамила — на процессы адаптации растений люцерны к холоду. Результаты экспериментов показывают, что ЭГТА ингибирует низкотемпературную адаптацию на 70%, а La³+ и верапамил полностью блокируют развитие процесса низкотемпературной адаптации у люцерны (Monroy et al., 1993).

Чтобы далее исследовать путь передачи сигнала, который стимулирует ответ на холодовой шок у кукурузы, был выделен кодирующий низкотемпературно-индуцируемую кальций-зависимую протеинкиназу клон кДНК (Zmcdpk1). Эксперименты по изучению динамики ответа на стресс показали, что низкотемпературная индукция Zmcdpk1 предшествует аналогичному показателю для mlip15, другого холодоиндуцируемого гена, кодирующего ДНК-связывающи белок типа лейцин-зиппер (bzip), что указывает на то, что Zmcdpk1 может размещаться раньше mlip15 в пути передачи вызванного холодным стрессом сигнала. При этом было отмечено, что уровень mlip15 мРНК в конститутивном состоянии в большой степени возрос после обработки циклогексимидом. Кроме гена mlip15, циклогексимид увеличивает уровни транскрипции двух других индуцируемых низко температурой генов — Zmcdpk1 и Adh1, кодирующего алкогольдегидрогеназу 1. Напротив, экспрессия гена хальконсинтетазы индуцировалась только низко температурой. Аккумуляция транскриптов mlip15 при низких температурах и в ответ на циклогексимид значительно уменьшалась после предварительно обработки хелатором кальция, что позволяет предполагать, что кальций вовлечен в обоих случаях индукции гена mlip15 (Berberich, Kusano, 1997).

После холодового шока усиливается экспрессия TCH-генов из Arabidopsis, которые кодируют калмодулин-связанные белки и ксилоглюкан эндотрансглюканазу. Была исследована возможная роль колебаний во внутриклеточных концентрациях иона кальция Ca²⁺ в вызванной холодовым шоком экспрессии гена TCH. Для этого у трансгенных растений, несущих ген апоэкворина, был проведен мониторинг содержания Ca²+ с тем, чтобы исследовать необходимость индуцируемого холодом увеличения содержания Ca²+ для экспрессии TCH. Индуцированное холодовым шоком увеличение содержания Ca²⁺ может быть заблокировано La³⁺ и Gd³⁺, предполагаемыми ингибиторами Ca²⁺— канала в плазматической мембране, и 1.2-бис (o-аминоэпокси) этан-тетраацетиловой кислотой, внеклеточным хелатором Ca²+. В ходе экспериментов было установлено, что индуцируемая холодовым- шоком экспрессия TCH генов затормаживается высокими уровнями содержания всех этих агентов, что, как было показано, блокирует увеличение содержания Ca²⁺. Эти данные подтверждают то, что внутриклеточное увеличение содержания Ca²+, следующее за холодовым шоком, требует внеклеточного Ca²⁺ и может получить необходимы приток Ca²+ опосредованно через Ca²+ каналы плазмалеммы. Во-вторых, результаты экспериментов свидетельствуют, что индуцируемая холодом экспрессия хотя бы подкласса TCH-генов требует увеличения содержания внутриклеточного Ca²+ (Polisensky, Braam, 1996).

Гены белков холодового шока

Установлено, что у бактерий существует многочисленное семейство генов, экспрессирующихся только в ответ на резкое снижение температуры. Гены этого семейства обозначены как гены белков холодового шока (cold shock proteins — CSP). Показано, что для начала экспрессии некоторых из этих белков холодового шока бактерий достаточно снижения температуры на 10 — 15⁰С.

Известно, что экспрессия гена CspA, важнейшего белка холодового шока Escherichia coli, очень сильно индуцируется во время резкого снижения температуры. Установлено, что замена трех оснований около последовательности Shine-Dalgarno размером в 159-оснований в 5′- нетранслируемой области мРНК cspA стабилизирует мРНК, приводя к конститутивному синтезу CspA при 37⁰С. Как оказалась, эта стабилизация, по крайней мере частично, происходит из-за сопротивления деградации РНКазо E. Холодовая индукция cspA также достигалась путем замены его промотора промотором Ipp, не индуцируемым-холодовым шоком. Таким образом, полученные данные указывают на то, что ген CspA эффективно транскрибируется даже при 37⁰C. В то же время трансляция мРНК белка CSPA заблокирована вследствие ее предельной нестабильности при 37⁰C. Представленные результаты также демонстрируют, что ген cspA конститутивной транскрибируется при всех температурах; однако его экспрессия при 37⁰C предотвращена из-за дестабилизации его мРНК (Fang et al., 1997).

С целью оценить эффективность промоторов белков холодового шока для их низкотемпературной экспрессии, было сконструировано транскрипционное слияние генов между промотором гена cspA и геном бета-галактозидазы lacZ. Показано, что в таком слитом гене синтез бета- галактозидазы эффективно подавлялся при 37⁰C, но быстро индуцировался при переносе в 15⁰C, приводя к трех- пятикратному увеличению в специфической активности белка относительно контрольной бактериальной культуры. Только продолжение инкубации культуры при 20⁰C, но не при 15⁰C, приводило к ослаблению активности из-за деления клетки и репрессии промотора, хотя исходные показатели накопления бета-галактозидазы при 20⁰C были в два раза выше измеренных при 15⁰C (Vasina, Baneyx, 1996).

Из двух штаммов Lactobacillus plantarum были клонированы два гена белков холодового шока, cspL и cspP. Эти гены, являющиеся неаллельными, присутствовали во всех исследованных штаммах. Данные гены кодируют полипептиды из 66-аминокислотных остатков, родственные друг другу и принадлежащие к семейству CSP — «белков холодового шока». Транскрипция гена cspP оканчивается единственной мРНК, в то время как для гена cspL были найдены две cspL мРНК с общими 5′ концами. Содержание этих транскриптов умеренно возрастало в ответ на обработку культур холодом (Mayo et al., 1997).

При изучении ответа лактозно-кислых бактери на замораживание было установлено, что при замораживании (-20⁰C в течение 24 часов) культуры лактозно-кислых бактери жизнеспособность клеток в значительной мере снижалась. В то же время, когда культуры бактерий перед замораживанием были предварительно подвергнуты в течение 2 часов холодовому шоку при 10⁰C, значительно улучшалась жизнеспособность у штаммов Lactococcus lactis subsp.lactis (на 25-37%) и Pediococcus pentosaceus PO2 (на 18%), но она не менялась у штамма Lactococcus lactis subsp. cremoris и у штаммов Lactobacillus helveticus LB1 и Streptococcus thermophilus TS2. Жизнеспособность клеток возросла еще более, когда период холодового шока был продлен до 5 часов. Использование дегенерированных PCR праймеров, полученных как из гена важнейшего белка холодового шока (csp) Escherichia coli, так и Bacillus subtilis приводит к образованию PCR продуктов у всех изученных штаммов. PCR продукт из Lactococcus lactis ssp. Lactis M474 был клонирован и секвенирован. Вычисленная для этого белка последовательность аминокислот показала высокую гомологию с аминокислотными последовательностями других белков семе ства CSP. Использование PCR праймеров, основанных на последовательность M474, приводило к образованию PCR продуктов только у изученных штаммов лактококков, но не у изученных штаммов Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus или Pediococcus pentosaceus (Kim, Dunn, 1997).

Гены протеинкиназ

Клон к ДНК для гена рецепторо-подобной протеинкиназы (RPK1) был выделен из Arabidopsis thaliana. Этот клон длиной 1952 bp с открытой рамкой считывания размером 1623 bp кодирует пептид (RPK1) из 540 аминокислот, которы содержит четыре области, характерных для рецепторно киназы. Во-первых, он содержит характерную для киназ предполагаемую аминотерминальную сигнальную область последовательности. Во-вторых, он содержит область с пятью экстрацеллюлярными богатыми ле цином повторяющимися последовательностями. В-третьих, он имеет мембрано-связывающую область и, в-четвертых, домен цитоплазматической протеинкиназы, которы содержит все 11 субдоменов, характерных для протеинкиназ. Ген RPK1 экспрессируется в цветах, побегах, листьях и корнях. Показано, что экспрессия гена RPK1 индуцируется в течение 1 часа после обработки экзогенно абсцизово кислото . Ген также быстро индуцируется различными другими абиотическими стрессами, такими, как обезвоживание, высокая концентрация соле и низкая температура. Предлагается, что данный ген вовлечен в общий ответ клетки на стресс. Вызванная обезвоживанием индукция гена rpk1 не нарушается в дефинитных по эндогенной абсцизовой кислоте мутантах aba-1, abi 1-1, abi2-1, abi3-1 и, вследствие этого, предполагается, что эта индукция не зависит от обработки абсцизовой кислотой (Hong et al., 1997).

Гены картофеля, индуцируемые хранением на холоду

Хранение клубне картофеля на холоду при 4 ⁰C связано с

накоплением нескольких индуцируемых холодом транскриптов генов. Путем использования в качестве зонда ранее охарактеризованно кДНК (CI7) был выделен и секвенирован соответствующий ген ci7.

Предполагаемы промотор ci7 содержит последовательность элементов, которая, как было показано, регулирует экспрессию индуцируемых холодом генов у Arabidopsis thaliana. Транскрипты CI7 дифференциально экспрессируются в клубнях и листьях картофеля в ответ на холодово стресс, засуху, высокую концентрацию соле или обработку экзогенно абсцизовой кислотой. В то время как накопление транскриптов CI7 во время хранения на холоду происходит в течение нескольких дне , индукция транскриптов CI7 в ответ на засуху, экзогенную абсцизовую кислоту и солевой стресс происходит быстро, в течение нескольких часов. Накопление белка CI7 в ответ на абиотические стрессы и обработку экзогенной абсцизовой кислотой в клубнях было небольшим, особенно по сравнению с уровнем содержания транскриптов. В листьях белок CI7 отсутствовал после всех исследованных возде стви . В ходе экспериментов растения S. tuberosum были трансформированы слитым с репортерным GUS-геном 5′-фланкирующим промоторным регионом ci7 размером 3 kb. Анализ клубней независимых трансгенных линий не обнаружил значительной индукции энзиматической активности GUS в ответ на низкотемпературное воздействие. В то же время, когда для анализа уровня индукции гена GUS с введенным ci7 промотором был использован РНК блоттинг, гетерологичное слияние GUS сильно индуцировалось в ответ на низкие температуры. По сравнению с РНК блот-анализом трансгенных растений, изучение ядерной «run-on» транскрипции ci7 гена показало, что большая часть температурно­регулируемо экспрессии гена ci7 в клубнях может быть связана с посттрансляционными механизмами контроля (Kirch et al., 1997).

Анализ последовательности кДНК клона CI21, которы соответствует другому индуцируемому холодом транскрипту, обнаруживает высокую гомологию с транскриптами томата (Lycopersicon esculentum) и дикого картофеля (Solanum chacoense), индуцируемыми созреванием и водным стрессом. Два гомологичных, неаллельных гена, ci21A и ci21B, были выделены и секвенированы. Нозерн-блот анализ показал, что самые высокие уровни содержания транскриптов ci21 обнаружены в хранимых в холоде клубнях. Более низкие уровни транскриптов содержатся в стеблях и корнях, и самые низкие уровни отмечены в листьях и клубнях, хранимых при комнатной температуре. Обработка растений абсцизовой кислотой, высокая концентрация соли и теплово шок не оказывали значительного влияния на уровни содержания транскрипта ci21 в клубнях и листьях. Подсушивание было единственным стрессом, вызывавшим транскрипцию CI21 на листьях, но оно не вызывало ее в клубнях. Вестерн-блот анализ обнаружил белок CI21 только в клубнях. Химерный ген, созданный путем слияния предполагаемой области промотора ci21A (фрагменты между 380 и 2000 bp области промотора ci21A) и репортер-геном uidA, тестировался на индукцию бета-глюкуронидазы низко температуро в трансгенных картофельных растениях, при этом в ответ на хранение клубне при 4 ⁰C у трансгенных растени наблюдалось двукратное увеличение активности бета-глюкуронидазы (Schneider et al., 1997).

Гены Y-box белков и белков, регулирующих процессы транскрипции и трансляции

В ходе исследований экспрессии генов семейства Y-бокс белков, регулирующих процессы транскрипции в клетках, было установлено, что высококонсервативны элемент основы промотора grp78 играет важную роль в индукции grp78 под разнообразными стрессовыми сигналами. Предшествующее изучение установило функциональную область в 3′ конце основы промотора (стресс-индуцируемая область изменения [SICR]), которая проявляет стресс-индуцируемые изменения в стрессированных ядрах. В ходе экспериментов показано, что человеческий фактор транскрипции YY1 связывает SICR и трансактиваторный элемент основы промотора в условиях стресса. Скрининг библиотек с данным элементом промотора выявил два новых связывающих эту область промотора белка, YB-1 и DBPA. Оба белка принадлежат к семейству Y- бокс белков, для которых характерен эволюционно- усто чивы ДНК- связывающи мотив — домен холодового шока (CSD). В ходе исследований в экспериментах по ко-переносу было установлено, что Y-бокс белки выступают в стрессированных клетках антагонистами WI-опосредованного управляемого grp78 усиления транскрипции. Таким образом, белки, имеющие домен холодового шока, могут быть частью механизма передачи сигнала стресса у млекопитающих (Li et al., 1997).

В то же время проблематично существование особых факторов транскрипции для специфических функций в элементах промотора,

особенно в таких системах, как G-бокс, поскольку существуют многочисленные синергические специфические для G-бокса факторы, в частности, промотора алкогольдегидрогеназы (Adh) у Arabidopsis, который регулирует экспрессию в ответ на холодовое возде ствие и обезвоживание (Lu et al., 1996).

Гены, связанные с низкотемпературной акклиматизацией

В ходе исследований по изучению влияния низкотемпературной акклиматизации на экспрессию генов в растениях выявлено и охарактеризовано значительное число генов, экспрессия которых индуцируется во время этого процесса как в травянистых, так и в древесных растениях. Значительное число этих генов индуцируется также экзогенной абсцизовой кислотой и засухой. В то же время выявлены гены, которые специфичны для процесса акклиматизации растения к низким температурам и не индуцируются другими типами абиотического стресса.

Для установления молекулярных основ холодовой акклиматизации у клубники (Fragaria xanannassa) было проведено выявление генов, ассоциированных с низкотемпературной акклиматизацией. .

Дифференциальный скрининг библиотеки кДНК, изготовленной из акклиматизированных к холоду растений клубники, позволил изолировать различные кДНК, дифференциально экспрессирующиеся при низкотемпературной акклиматизации. Нозерн-блот анализ показал, что уровень транскриптов Fcor1 (Fragaria cold-regulated) возрастал после 2 дне низкотемпературной акклиматизации, в то время как аналогичны показатель Fcor2 увеличивался только после 2 недель низкотемпературной акклиматизации. С другой стороны, уровень содержания транскриптов Fcor3 снижался в течение 24 часов воздействия низкотемпературной акклиматизации и оставался на низком уровне в течение 8 недель периода акклиматизации. Гены Fcor1 и Fcor2 экспрессируются во всех тканях, в то время как ген Fcor3 специфичен для листьев. Кодируемый геном Fcor1 белок имеет высокое содержание лейцина, изолейцина, глицина, пролина и серина. Данный белок имеет гомологию с белками, кодируемыми геном ячменя blt 101, индуцируемым низкотемпературной акклиматизацией, и геном Lophopyrum esi3, индуцируемым солевым стрессом. Белок FCOR2 богат лизином, лейцином, валином, аланином и аргинином и не имеет гомологии ни с каким из продуктов известных генов. Частичный клон кДНК Fcor3 кодирует полипептид, имеющий очень высокую идентичность с субъединицей V PSI из шпината и с полипептидом PSI Psag из ячменя. Уровень накопления транскриптов Fcor1 коррелирует с устойчивостью к замораживанию у исследованных сортов клубники (Dong et al., 1997).

Клон кДНК pbn59 был изолирован путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК акклиматизированного к холоду озимого рапса (Brassica napus). Нуклеотидная последовательность BN59 оказалась гомологичной последовательности, кодирующей 70 кДа субъединицу вакуолярной Н+-АТФазы в растениях. Транскрипты, гибридизующиеся с BN59, аккумулируются во время воздействия низко температуры и воздействия экзогенной абсцизовой кислоты. Вестерн-блоттинг белков также показал увеличение содержания 70 кДа субъединицы во время акклиматизации к холоду. Накопление эндомембранной Н+-АТФазы следует также из наблюдений за осмотическим регулированием, увеличением содержания эндогенной абсцизовой кислоты и пролиферации эндомембран в течение холодной акклиматизации (Orr et al., 1995).

Двенадцать клонов индуцируемых холодом кДНК были изолированы путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК, подготовленной из мРНК холодоустойчивого картофеля (Solanum sogarandinum). При помощи нозерн-блот гибридизации было проанализировано накопление мРНК, соответствующей каждому клону. Изолированные в данном исследовании клоны кДНК обозначены как Ssci (S. Sogarandinum cold inducing). Все клоны отчетливо индуцировались в ответ на холод — накопление соответствующих транскриптов было замечено уже после одного дня закаливания к холоду. Максимальная аккумуляция мРНК, соответствующих клонам Ssci1, Ssci2, Ssci6 и Ssci8, была отмечена в первый день холодового закаливания, тогда как для клонов Ssci3, Ssci4, Ssci5, Ssci7, Ssci9, Ssci10, Ssci11 и Ssci12 — после 8 дней закаливания. Частичная последовательность ДНК была определена для 5′ и 3′ концов клонов и был произведен поиск гомологии с последовательностями в базах данных. Результаты поиска показали, что выделенные клоны кДНК соответствуют известным генам и кодируют мРНК для следующих белков: мРНК для двух различных S-аденозилы-метионин декарбоксилаз (Ssci1 и 2), два хлоропластных шаперонина (Ssci3, Ssci4), белок цикла деления клетки CDC48 (Ssci5), малатдегидрогеназу (Ssci6), мио-инозитол-1-фосфат синтетазу (Ssci7), протопорфирин IX:Mg хелатазу (Ssci8), фактор элонгации EF-1a (Ssci9), хлоропластный фактор элонгации трансляции EF- G (Ssci10), рибосомальный белок L-3 (Ssci11) и мРНК для белка томата TAS14, индуцируемого экзогенной абсцизовой кислотой. Выявленные гены могут участвовать в двух различных механизмах, относящихся к холодоустойчивости. Одна группа может предохранять хлоропласты и клеточные структуры во время стресса, в то время как другая может быть вовлечена в механизмы приспособления растительной клетки к холоду (Rorat et al., 1997).

Были изучены некоторые из ответов мутантов Arabidopsis thaliana L. (Heynh), не развивающих максимальной холодостойкости после холодовой акклиматизации, на холодовое воздействие. В ходе экспериментов были изучены холодовая индукция трех белков, уровни содержания сахарозы и глюкозы, жирнокислотный состав липидов, а также накопление антоцианинов в листьях. Четыре мутации (sfr3, sfr4, sfr6 и sfr7) понижали или устраняли накопление антоцианина во время холодно акклиматизации. Одна мутация (sfr4) предотвращала индуцируемое холодом в норме повышение уровня содержания сахарозы и глюкозы. Мутации sfr4 и sfr7 влияли на жирнокислотный состав липидов после холодовой акклиматизации. С другой стороны, поскольку все исследованные параметры у мутаций sfr1, sfr2 и sfr5 не отличались от таковых у дикого типа, то предполагается, что они имеют другое, вполне возможно, высокоспецифическое действие в ответ на низкотемпературное воздействие (McKown et al., 1996).

Регулируемый холодом оперон rbpA1-rpsU кодирует РНК- связывающий белок и рибосомальный белок M3 у Anabaena variabilis. Уровень экспрессии это группы генов примерно в десять раз выше при температурах ниже 30 ⁰C, чем при 38 ⁰C. С целью изучения функций белка RbpA1 in vivo был создан нарушенный вставкой ген rbpA1. Эти мутанты были полностью лишены белка RbpA1, но содержали нормальный уровень продукта гена rpsU — рибосомального белка S21. При 38 ⁰C мутанты были морфологически нормальными, но при 22 ⁰C они с небольшой частотой производили необычные клетки. По-видимому, эти клетки были на начальном этапе образования прогетероцист. В присутствии нитрата при 22 ⁰C у мутантов на молекулярном уровне также происходили различные события, обуславливающиеся инициацией превращения в гетероцисты, а именно, иссечение 11-kbp элемента ДНК в nifD и накоплении копий xisA и hetR, но в то же время эти события не происходили в присутствии аммония или при 38 ⁰C. Полученные результаты позволяют считать, что RbpA1 необходим для полно репрессии инициации образования гетероцист при низких температурах в присутствии нитрата (Sato, Wada, 1996).

В ходе изучения низкотемпературного ответа генома Arabidopsis thaliana были охарактеризованы две связанные кДНК (RCI2A и RCI2B), соответствующие генам, экспрессия которых временно индуцируется низкими температурами. RCI2A и RCI2B кодируют небольшие (54 аминокислоты) сильно гидрофобные белки, которые несут два потенциальных трансмембранных домена. Анализ их аминокислотной последовательности показал сродство с регулируемыми различными стрессовыми условиями белками, кодируемыми генами из ячменя (Hordeum volgare L.) и Lophophyrom elongatum. Их высокий уровень гомологии последовательностей (78%) и их геномная локализация в отдельном рестрикционном фрагменте подтверждают то, что оба гена появились в результате тандемной дупликации. В то же время их регулирующие последовательности достаточно различаются для того, чтобы считать их различными генами. Подобно большинству охарактеризованных индуцируемых холодом генов растений, экспрессия RCI2A и RCI2B также усиливается экзогенной абсцизовой кислотой и дегидратацией, но не обще реакцией растения на стрессовые условия, поскольку она не индуцируется солевым стрессом или анаэробиозом. Более того, низкая температура способна вызвать экспрессию RCI2A и RCI2B в ABA-дефицитной и нечувствительной генетической среде, что свидетельствует о том, что низкотемпературны ответ этих двух генов регулирует и зависимые от абсцизовой кислоты, и независимые от нее пути (Capel et al., 1997).

Для изучения генетического регулирования морозоустойчивости рапса у популяции F2 Brassica rapa и двойной гаплоидной популяции Brassica napus in vitro определялась относительная морозоустойчивость акклиматизированных и неакклиматизированных растений. Для идентификации предполагаемых локусов количественных признаков использовались разработанные раньше карты связей. У популяции B. napus области генома со значительным влиянием на морозоустойчивость не были обнаружены, но у B. rapa четыре области ассоциировались со связанной с акклиматизацией морозоустойчивостью (FTA) и способностью к акклиматизации (FTB), но две другие области связывались с морозоустойчивостью, не связанной с акклиматизацией (FTN). Способность к акклиматизации регулировалась генами с очень небольшими как положительными, так и отрицательными эффектами доминирования. Аллель озимых родителе имела положительные добавочные эффекты, но отрицательные доминантные эффекты в локусах количественных признаков FTN. RFLP локусы обнаруживались при помощи индуцируемой холодом и связанно со стрессом кДНК из Arabidopsis thaliana, картированной около двух локусов количественных признаков для FTA/FTB (Teutonico et al., 1995).

Недавние исследования определили в растениях cis-действующий ДНК-регулирующий элемент, «C-повтор/отвечающий на обезвоживание элемент (DRE)», который стимулирует транскрипцию в ответ на действие низкой температуры и водного дефицита. Из Arabidopsis thaliana была выделена кДНК, которая кодирует «C-repeat/DRE» связывающий фактор, CBF1 (C-repeat/DRE binding factor 1). Анализ выведенной аминокислотной последовательности CBF1 показывает, что белок имеет молекулярную массу 24 кДа, потенциальную ядерную локализацию последовательности и возможную активность в кислой области. CBF1 также имеет область AP2, которая является ДНК-связывающим мотивом из 60 аминокислот, имеющимся в белках Arabidopsis APETALA2, AINTEGUMENTA, и TINY и в других растительных белках с неизвестными функциями. Уровни содержания транскриптов CBF1, которые конститутивной являются единичными или низкими, незначительно изменялись в растениях, подвергнутых низкотемпературной обработке, или в отдельных листьях, подвергнутых дефициту воды. Связывание CBF1 к «C-repeat/DRE» продемонстрировано при помощи анализа со сдвигом геля при использовании рекомбинантного белка CBF1, экспрессированного в Escherichia coli. Кроме того, обнаружено, что экспрессия CBF1 в дрожжах активизирует транскрипцию репортер-генов, содержащих «C-repeat/DRE» как активизатор, расположенный выше последовательности, но не активизирует транскрипцию мутантной версии элемента ДНК. Считается, что CBF1 может функционировать как активизатор транскрипции, который связывается с «C-repeat/DRE» ответственным элементом ДНК и, вероятно, играет роль в индуцированной холодом и обезвоживанием экспрессии гена у Arabidopsis (Stockinger et al., 1997).

Из обработанных холодом проростков холодоустойчивого сорта сои (Glycine max L. cv. Kitamusume) при помощи дифференциального секвенирования были выделены две регулируемые холодом кДНК — src1 и src2. Уровень содержания транскриптов src1 увеличивается после воздействия низкой или высокой температурой (5, 15 и 40⁰C), засухой, ранением и инфекцией вирусом мозаики соевого боба (SMV). Транслированный из кДНК src1 полипептид (SRC1) имеет 102 аминокислоты, гидрофилен и имеет девять аминокислотных повторов, богатых глютаминовой кислотой, гистидином, лизином и глицином. SRC1 имеет гомологию с белком водного стресса риса (WSI724) и регулируемым холодом белком люцерны (CAS15). Уровень содержания транскриптов src2 увеличивался только после понижения температуры до 5⁰C, что указывает на то, что этот ген индуцируется только охлаждением. Транслированный из кДНК src2 полипептид (SRC2) состоит из 290 аминокислот и содержит семь повторов последовательностей аминокислот, богатых пролином, глицином, тирозином и глутамином и гидрофобную область у карбокси-конца, которая может связываться с мембраной. Уровень транскриптов src2 при 5⁰C продолжал увеличиваться вплоть до 48 часов действия низко температуры в холодоустойчивом сорте Kitamusume, в то время как он достигал максимума через 12 часов и затем понижался в чувствительном к холоду сорте Koganejiro (Takahashi, Shimosaka, 1997).

Из Arabidopsis thaliana был изолирован геномный фрагмент EcoRI размером 7 kb, который содержит два тесно связанных dhn/lea/rab- подобных гена — lti29 (прежде именуемый lti45) и cor47 в тандемном оформлении. Для обоих транскриптов показана аккумуляция в ответ на низкотемпературны стресс, обработку экзогенной абсцизовой кислотой и обезвоживание. Сравнение последовательностей аминокислот транслированных полипептидов показало, что они на 67% идентичны. Рассчитанные молекулярные массы этих полипептидов были 29 кДа для LTI29 и 30 кДа для COR47. Оба полипептида содержат один консервативны сериновы домен и три богатых лизином повтора, как у DHN/LEA/RAB-подобных белков. Кроме того, как LTI29, так и COR47 имеют N-терминальный кислый повтор, обнаруживаемый только у нескольких среди DHN/LEA/RAB белков. Близкое расстояние между двумя генами (всего 2,7 kb) и их тандемная организация в геноме A. thaliana, а также общая гомология последовательности области кодирования на нуклеотидном уровне позволяют предположить, что два гена развились путем дублирования. Это, по-видимому, представляет собой общую черту среди зависимых от низкотемпературного стресса генов A. thaliana (Welin et al., 1995).

Paldi с соавторами был изучен эффект низко температуры на процессинг рРНК у пшеницы. Две линии пшеницы, использованные в этой работе, отличались друг от друга только морозоустойчивостью. В ходе экспериментов было показано, что в случае слабоморозоустойчивой линии количественные и качественные изменения в процессе созревания рРНК произошли как результат действия низко температуры. В течение холодовой обработки последние предшественники (с мол. массами 1.4 и 0.9 МДа) двух стабильных цитоплазматических рРНК (с мол. массами 1.3 и 0.7 МДа) накапливались в качестве стабильных фракций рРНК. Это накопление увеличивалось по мере увеличения продолжительности холодовой обработки. В то же время это изменение не было выявлено у линии с хорошей морозоустойчивостью. Результаты свидетельствуют, что в слабоморозоустойчивых линиях холодовая обработка имела ингибирующий эффект на последнюю стадию процесса созревания рРНК, то есть при низко температуре этот процесс не может завершиться (Paldi et al., 1996).

Известно, что тепловая обработка плодов помидора индуцирует также и устойчивость к повреждению от охлаждения. Ранее было показано, что специфические белки теплового шока (БТШ) экспрессируются в нагретых плодах помидора после хранения на холоде. Для поиска индуцируемых теплом генов, экспрессирующихся при низких температурах, была изготовлена, а затем подвергнута дифференциальному скринингу библиотека кДНК из предварительно прогретых, а затем охлажденных плодов помидора. В ходе этих экспериментов был выделен новы клон кДНК, hcit2, кодирующий белок с молекулярной массой 16.5 кДа. Кодируемы им белок содержит три предполагаемых трансмембранных гидрофобных последовательности, что позволяет предполагать, что этот белок локализован в мембранах. Экспрессия hcit2 в плодах индуцировалась высоко температурой, но не иными видами стресса, такими, как, например, низкая температура, засуха или анаэробные условия, и не наблюдалась во время созревания плода. Высоки уровень транскриптов hcit2 был обнаружен в нагретых плодах после 2-х недель хранения при 2⁰ C. Высокие температуры также индуцировали экспрессию hcit2 в листьях, цветах и стеблях помидора. Авторы предполагают, что белок HCIT2 может быть вовлечен в процесс приобретения растением устойчивости к повреждению охлаждением (Adnan et al., 1998).

У ряда лини дикого картофеля (Solanum sogarandinum) были проанализированы динамика холодового закаливания и изменения в транслируемых мРНК во время холодовой акклиматизации. Перед низкотемпературной обработкой все линии были полностью закалены в течение восьми дней при 4⁰C. Наиболее холодостойкая линия 1 усилила холодостойкость (LT₅₀) от -3,2⁰C до — 8,9⁰C, а наименее холодостойкая линия 10 увеличила свою холодостойкость (LT₅₀) от -2,5⁰C до -6,5⁰C. В ходе исследований были изолированы поли РНК из закаленных и незакаленных растений лини 1 и 10 и продукты их трансляции in vitro были разделены двумерным-PAGE-электрофорезом. Анализ профилей продуктов трансляции in vitro закаленных растений линии 1 обнаружил изменения в содержании приблизительно 31 продукта в области молекулярных весов от 14 до 69 кДа и pI в ра оне от 6,7 до 5,0. Содержание 26 продуктов во время холодно акклиматизации повышалось, а двух других белков — уменьшалось. Во время, когда растения подвергались низкотемпературному стрессу, было возможно идентифицировать вновь образующиеся продукты трансляции — три с мол. массами около 18 кДа и два с мол. массами около 45 кДа. Большинство продуктов, содержание которых изменялось в течение холодовой акклиматизации, было обнаружено в группе низкомолекулярных белков с молекулярными массами от 14 до 21 кДа и от 24 до 35 кДа. В менее устойчивой линии 10 в течение холодовой акклиматизации изменялось содержание только 19 продуктов трансляции, и в не не было отмечено вновь образующихся продуктов. Все изменения в продуктах трансляции в обеих линиях появлялись после двух дне холодовой обработки, когда морозоустойчивость линий еще повышалась (Rorat, Irzykowski, 1996).

Таким образом, к настоящему времени накоплено большое количество данных об отдельных индуцируемых низко температурой генах у различных видов растений. Особенно большой объем данных в настоящее время получен в связи с проводимым полным сиквенсом генома Arabidopsis thaliana. В то же время необходимо отметить, что, несмотря на обилие данных о влиянии низко температуры на экспрессию генов в растениях, эти исследования проводятся отрывочно и бессистемно. В основном, полученные данные говорят об индукции экспрессии определенных генов низко температурой. В то же время данные о взаимосвязи экспрессии различных генов при низкотемпературном стрессе крайне ограничены. Все же из рассмотренных выше данных можно сделать вывод, что, хотя по сравнению с «нормальными» температурными условиями содержание ДНК при гипотермии меняется незначительно, в то же время гипотермия вызывает значительные изменения в экспрессии генов на уровне транскрипции. При низкотемпературном стрессе и в процессе низкотемпературной адаптации у разных исследованных видов индуцируется экспрессия ряда генов, некоторые из которых являются видоспецифичными. В то же время выделено несколько семейств генов, которые индуцируются в ответ на низкотемпературный стресс у многих из исследованных видов. Установлено, что многие из экспрессирующихся при низкой температуре генов индуцируются также в ответ на обработку экзогенной абсцизовой кислотой и засуху. Индукция некоторых генов является общим неспецифическим ответом организма на стресс, так как они индуцируются всеми изученными видами абиотического и биотического стресса. Поскольку установлено, что низкотемпературный стресс вызывает изменения экспрессии генов на уровне транскрипции, можно перейти к рассмотрению результатов, полученных при изучении его влияния на уровне трансляции.