Вирусоподобные инфекционные агенты

Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии. Зинченко А.И., Паруль Д.А. — 2005

САТЕЛЛИТЫ И ВИРОИДЫ

Могут ли существовать вирусы с геномами раз­мером в 240 нуклеотидов? А могут ли существо­вать инфекционные агенты вообще без генома? Если первое еще можно себе представить, то ги­потеза о существовании инфекционных аген­тов без генома вроде бы подрывает основы основ молекулярной биологии. Как это ни странно, и те и другие агенты существуют и вызывают за­болевания растений, животных и человека.

В последние годы все чаще говорят о сател­литах, вироидах и прионах. Это необычные ин­фекционные агенты, которые характеризуются тем, что обладают очень маленьким геномом, а в случае прионов — не обладают им вообще.

Сателлиты (сателлитные вирусы, сателлитные РНК) — это маленькие молекулы РНК, которые абсолютно нуждаются для своего размножения в присутствии в клетке вируса, выступающего в качестве вируса-помощника. Таким образом, даже вирусы имеют своих па­разитов. Большинство сателлитов ассоцииро­ваны с вирусами растений, но некоторые из них ассоциированы с бактериофагами или ви­русами животных. Примером последних мо­гут служить аденоассоциированные вирусы, которые, как следует из названия, сопутству­ют аденовирусам.

Типичные свойства сателлитов:

• геном сателлитов (одноцепочечная РНК) имеет размер около 500-2000 нуклеотидов;
• они вызывают специфические проявле­ния заболеваний у растений, которые не обна­руживаются при инфекции тех же хозяев только вирусами-помощниками;
• геномы сателлитов по первичной структу­ре не похожи на геномы вирусов-помощников.

Вироиды — это очень маленькие (200-400 нуклеотидов) палочкообразные молекулы РНК, которые обладают ха­рактерной вторичной структурой (рис. 4.1).

Они не имеют капсида и оболочки и состоят только из одной молекулы нуклеиновой кислоты. Вироиды вызыва­ют заболевания растений и отличаются от сателлитов по ряду характеристик (табл. 4.1).

Таблица 4.1. Характеристика сателлитов и вироидов

Первым открытым и наиболее изученным вироидом является вироид, вызывающий веретеновидность клубней картофеля. Вироиды не кодируют никаких белков и реп­лицируются при помощи РНК-полимеразы клетки-хозяи­на. Детали репликации еще до конца не выяснены, но по­хоже, что она протекает по механизму «катящегося коль­ца» с последующим аутокаталитическим расщеплением и лигированием. Вироиды различаются по первичной структуре, и это служит основанием для разделения их на те или иные виды. Однако все вироиды несут общую пос­ледовательность нуклеотидов, которая расположена в центральной части молекулы и, как полагают, важна для репликации (см. рис. 4.1).

Неясно, как вироиды вызывают симптомы заболева­ний, но не вызывает сомнения, что это является результа­том нарушения нормального метаболизма клетки. Они де­монстрируют сходство по первичной структуре с некото­рыми последовательностями в геноме эукариотической клетки-хозяина, в частности с интроном, расположен­ным между 5,88 и 25S рРНК. Отсюда предположено, что вироиды могут нарушать посттранскрипционный процес­синг РНК-инфицированной клетки.

Большинство вироидов передаются от клетки к клетке при вегетативном размножении хозяев, т.е. делении инфи­цированных растений, хотя некоторые могут распростра­няться и при помощи насекомых-переносчиков или меха­ническим путем. Поскольку вироиды не имеют преимуще­ства защитной оболочки, вироидные РНК имеют исключи­тельный риск деградировать во внешней среде. Однако их малый размер и высокий процент вторичной структуры в достаточной степени их защищают, и они способны суще­ствовать вне клетки-хозяина в течение достаточно долгого периода, чтобы успеть переместиться в другого хозяина.

Происхождение вироидов загадочно. По одной из вер­сий, они являются пережитком — примитивным геномом, сохранившимся с тех времен, когда еще не было ДНК. По другой гипотезе, вироиды возникли «совсем недавно» и олицетворяют собой крайнюю степень паразитизма. По­хоже, что мы никогда не узнаем, какая из этих альтерна­тив истинна. Ясно одно — вироиды существуют и вызыва­ют заболевания растений.

К уникальным в своем роде агентам следует отнести ви­рус гепатита дельта (ВГО). Он представляет собой молеку­лу РНК, обладающую свойствами как сателлита, так и вироида. ВГБ для своей репликации нуждается в вирусе- помощнике, в качестве которого выступает вирус гепати­та В (ВГВ). Поэтому неудивительно, что ВГБ находят только в клетках, инфицированных ВГВ. Переносится ВГБ тем же путем, что и ВГВ, извлекая при этом выгоду из наличия защитной оболочки, состоящей из липида и белка ВГВ. Вирусные препараты, полученные из ВГВ/ВГБ-инфицированных клеток, содержат гетероген­ные частицы, которые представляют собой капсид ВГВ, содержащий ковалентно замкнутую кольцевую РНК ВГБ, имеющую форму стержня, характерную для всех вироидов. Однако, в отличие от всех других вироидов, РНК ВГБ кодирует белок — 8-антиген, который является фосфопротеином. Считается, что геном ВГБ реплицируется путем РНК-зависимого синтеза РНК с использованием ДНК-за- висимой РНК-полимеразы.

Похоже, что ВГБ усугубляет патогенные эффекты ин­фекции ВГВ. Например, скоротечная форма гепатита (ле­тальность около 80%) в 10 раз чаще регистрируется в слу­чае смешанной инфекции по сравнению с моноинфекцией только ВГВ. Специфической терапии ВГБ не существует, однако, поскольку он требует для репликации присут­ствия в клетке ВГВ, его можно контролировать путем вак­цинации против ВГВ.

ПРИОНЫ

Терминология. Прионы — это инфекционные агенты, которые вызывают трансмиссивные спонгиформные (от «спонги», что в переводе означает губка) энцефалопатии человека и животных. Среди них: скрейпи овец, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (коровье бешен­ство), трансмиссивная энцефалопатия норок, болезнь Крейцфельда-Якоба (БКЯ) и куру человека.

Для всех этих заболеваний характерно:

• накопление в мозгу амилоидоподобных образований, при этом ткань мозга принимает пористую форму наподо­бие губки;
• полное отсутствие воспалительных явлений.

У больных наблюдаются деменции, потеря координа­ции движения, конвульсии конечностей. Патологический процесс протекает медленно, но неизменно заканчивается летальным исходом. Средства специфической лекарствен­ной терапии отсутствуют.

Скрейпи — болезнь, известная уже несколько столетий. Название происходит от английского слова «scrape» — скоб­лить, тереть. Дело в том, что больные животные соскребают с себя почти всю шерсть. В 1935 г. французские исследова­тели доказали, что болезнь можно передать от одной овцы к другой путем прививки. Возможность трансмиссии указы­вала на существование инфекционного агента.

Скрейпи оставалось заболеванием, известным лишь ве­теринарам, до 1959 г., когда было замечено, что скрейпи и куру — родственные болезни. О куру мир узнал двумя го­дами раньше из работ Гейдушека. Этот исследователь до­казал, что заболевание, встречающееся у жителей Новой Гвинеи, связано с ритуальным каннибальским обрядом, который состоял в поедании мозга умерших родственни­ков. Инфекционную природу куру Гейдушек продемон­стрировал, сумев передать заболевание от умершего чело­века обезьяне. Вскоре Гейдушек показал, что обезьянам от человека можно передавать и БКЯ.

Сходство проявлений упомянутых выше и других по­добных заболеваний навело исследователей на мысль о родственности этих патологий. Сейчас уже известно, что все эти заболевания могут возникать не только в результа­те инфекции — описаны спорадические и наследственные их формы. При этом существенно, что независимо от про­исхождения заболевания, оно может быть передано здоро­вому реципиенту инфекционным путем.

Химическая природа прионов. Прионы не задержива­ются бактериальными фильтрами. Это характерный приз­нак вирусов. Однако у прионов гораздо больше таких свойств, которыми вирусы не обладают. Более того, по фи­зическим свойствам они не соответствуют ни одному из известных биологических объектов.

• Прионы устойчивы к тепловой инактивации. Инфек- ционность не исчезает после прогревания до 90°С в тече­ние 30 мин. Инфекционность падает, но не исчезает сов­сем даже при автоклавировании (135°С; 18 мин).
• Прионы устойчивы к повреждающему действию ко­ротковолнового УФ-облучения и ионизирующей радиа­ции. Такая обработка вызывает инактивацию всех извест­ных патогенных организмов, поскольку повреждает их ге­номы. Существует обратная зависимость между размера­ми молекулы ДНК (мишень) и дозой радиоактивности или

УФ-облучения, необходимой для их инактивации. Иначе говоря, большие молекулы чувствительны к гораздо мень­шим дозам, чем те дозы, которые губительны для малень­ких молекул. Эксперименты по облучению агента скрей- пи показали, что если он и содержит нуклеиновую кисло­ту, то она не может быть больше 80 нуклеотидов.

• Прионы устойчивы к ДНКазам, РНКазам и многим другим агентам в условиях, разрушающих нуклеиновые кислоты и все известные вирусы, сателлиты и вироиды.
• Прионы чувствительны к обработке мочевиной, доде- цилсульфатом натрия, фенолом и другими химическими соединениями, денатурирующими белки.

Совокупность приведенных выше свойств (а также данных табл. 4.2) указывает на то, что исследуемый агент является, скорее, белком, чем нуклеиновой кислотой или вирусом. Действительно, единственным компонентом, свя­занным с инфекционным началом приона, оказался белок и этот белок получил обозначение РгР⁶⁰. Биохимическая очистка патогена скрейпи приводит к препаратам, высоко обогащенным белком РгР⁶⁰, и, наоборот, по мере очистки препаратов РгР⁶⁰ увеличивается их инфекционность.

Таблица 42. Отношение прионов к некоторым химическим соединениям и ферментам

В 1984 г. С. Прузинер определил последовательность в 15 аминокислот на конце очищенного PrP^Sc. Это привело к открытию того факта, что все клетки млекопитающих содержат ген ргр, который кодирует белок, идентичный по первичной структуре PrP^Sc. Этот белок нормальных клеток принято обозначать РгР^с. Таким образом, очищен­ный инфекционный агент оказался белком, первичная структура которого закодирована в геноме хозяина.

В отличие от нормальных клеток, инфицированные прионом клетки содержат только PrP^Sc. При заражении экспериментальных животных прионом, как и в случае других инфекционных агентов, существует зависимость доза-эффект, которая демонстрирует четкую корреляцию между количеством PrP^Sc в инокулюме и продолжитель­ностью инкубационного периода до развития болезни.

Чувствительность того или иного организма к прионовой инфекции определяется наличием гена ргр. Мутанты, у которых этот ген отсутствует или поврежден, не спо­собны воспринимать прионовую инфекцию.

В настоящее время установлено существование, по крайней мере, 15 различных штаммов РгР⁸⁰ (с идентичной первичной структурой этого белка, но различающихся по величине инкубационного периода развития болезни).

Прионовая гипотеза является революционной и зако­номерно была встречена поначалу многими скептически. Хотя свидетельства в ее пользу постоянно накапливаются, есть данные, которые ей противоречат. Например, данная гипотеза очень трудно сочетается с существованием при- оновых штаммов.

В течение многих лет исследования спонгиформных энцефалитов тянулись чрезвычайно медленно, потому что каждый эксперимент отнимал по меньшей мере один год. С началом молекулярно-биологического этапа эти иссле­дования превратились в быстро прогрессирующую об­ласть науки.

Однако пока рациональная терапия заболеваний, вы­званных прионами (как и заболеваний, вызванных сател­литами и вироидами), не разработана. Привычная страте­гия борьбы с вирусными инфекциями, основанная на ле­карственных препаратах и вакцинах, не имеет в случае этих необычных агентов никакого эффекта. Ясно, что пе­ред тем как будут найдены способы лечения прионовых патологий, необходимо всестороннее и доскональное изу­чение химии и биологии прионовых белков.

Как же может клеточный белок, безобидный в норме, вызывать болезнь? Никаких химических различий, в том числе в первичной структуре, между РгР^с и прионом не бы­ло обнаружено. На основании этих данных было предполо­жено, что фундаментальное отличие между инфекционной формой приона (РгР⁸⁰) и непатогенной эндогенной формой (РгРС) скрыто в конформации этих белковых молекул.

В настоящее время считается доказанным, что во вторич­ной структуре РгР^с преобладает а-спираль. Прион, напро­тив, имеет преимущественно складчатую p-структуру. Бы­ло предположено, что молекула РгР^с, взаимодействуя с прионом, сама превращается в прион (рис. 4.2). Это приво­дит к амплификации приона и исчезновению пула белка- предшественника. Процесс носит характер цепной реакции.

Очень редко имеет место спонтанное перерождение мо­лекулы РгР^с в прион. В принципе такая трансформация (рис. 4.3) энергетически выгодна, однако кинетически она сильно затруднена из-за большого активационного барье­ра, препятствующего самопроизвольному превращению белка РгР^с в белок РгР&°. Вот почему самопроизвольные формы прионовых заболеваний чрезвычайно редки (при­близительно один случай на 1 ООО ООО человек). Тем не ме­нее они имеют место и являются, как полагают, следстви­ем соматической мутации в гене ргр. Понятно, что мута­ция не задевает структурную часть гена, кодирующую первичную структуру белка. Мутация понижает энергию активации на пути перехода РгР^с в PrP^Sc, что делает появ­ление PrP^Sc в организме статистически вероятным.

Суммируем факты, которые согласуются с гипотезой приона:

• при всех прионовых заболеваниях наблюдается сверх­продукция белка РгР&°;
• животные, которые в результате мутации не способ­ны к образованию в организме белка РгР^с, проявляют аб­солютную невосприимчивость к прионовой инфекции;
• увеличение экспрессии гена ргр, напротив, способ­ствует возникновению заболеваний.

Итак, белок-предшественник приона РгР^с является нормальным клеточным белком, функция которого пока не известна. В инфекционного агента РгР⁸⁰ он превращает­ся в результате любого из двух событий: а) при контакте с прионом и б) спонтанно (крайне редко). В обоих случаях при этом происходит только изменение конформации молекулы.

Уникальная особенность этих заболеваний состоит в том, что они могут возникать не только в результате ин­фекции. Известны спорадические и наследственные фор­мы таких патологий. Причем независимо от происхожде­ния заболевания оно может быть передано инфекционным путем. Таким образом, мы как бы имеем дело с самоза­рождением инфекции.

Согласно современным представлениям, прион — осо­бая изоформа нормального клеточного белка, отлича­ющаяся от него плохой растворимостью и склонностью к агрегации, которая и является причиной образования амилоидов в тканях мозга.

Прион, попадая в клетку или спонтанно в ней возникая, способствует путем белок-белковых взаимодействий прев­ращению клеточной формы РгР^с в форму PrP^Sc. В целом процесс трансформации напоминает цепную реакцию.

Существование наследственных форм прионовых забо­леваний в рамках этой концепции может объясняться по­вышенной способностью «мутантных» белков к спонтан­ному превращению в прионовую форму.

Все перечисленные факты полностью согласуются с ги­потезой о белковом материальном носителе прионовых за­болеваний. Животные, лишенные гена ргр, не заболевают просто потому, что их клетки не содержат предшественни­ка, способного к конформационной перестройке. При уве­личении количества молекул этого белка должна возрас­тать вероятность спонтанного перехода какой-либо из мо­лекул в патогенную форму. Пониженная инфекционность чужого приона при межвидовом заражении может объяс­няться ухудшенной способностью белка PrP^Sc передавать свое патогенное состояние белку РгР^с, несколько отлича­ющемуся от него по первичной структуре.

При всей привлекательности гипотезы приона есть факты и наблюдения, которые с ней пока не согласуются. Например, одно из наиболее удивительных свойств прио­нов — это существование различных штаммов (при неиз­менной первичной структуре!). Каждый штамм у генети­чески однородных (линейных) животных вызывает забо­левание, отличающееся по продолжительности инкубаци­онного периода и некоторым другим параметрам. Сущест­вование различных штаммов было подтверждено биохи­мически. Оказалось, что различные штаммы прионов не­сколько различаются по своей вторичной структуре.

В настоящее время установлена первичная структура прионов, изолированных из многих организмов. Она ока­залась высококонсервативной. У разных видов млекопи­тающих прион лишь незначительно отличается по пер­вичной структуре. Тем более удивительным является факт наличия межвидовых барьеров на пути передачи.

Долгое время изучение прионов представляло исклю­чительно теоретический интерес. Однако в конце прошло­го века проблема прионов приобрела существенное прак­тическое значение в связи со вспышками соответствую­щих эпизоотий среди сельскохозяйственных животных в некоторых европейских странах, а также с появлением наблюдений о возможности передачи этих заболеваний от животных к человеку.

В заключение следует отметить, что феномен прионов распространен в природе шире, чем это считалось до недав­них пор. В последнее время появились данные о существова­нии прионов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Некото­рые их нехромосомно наследуемые детерминанты имеют свойства, полностью укладывающиеся в прионовую модель.

Если у млекопитающих заболевания, вызываемые при- онами, представляют собой пример молекулярных пато­логий, то вопрос о том, является ли возникновение прио­нов болезнью дрожжей или их существование имеет для дрожжей биологический смысл, остается пока открытым. Дело в том, что переход предшественников прионов в при­оны изменяет фенотип клетки, при этом расширяется на­бор азотсодержащих соединений, которые клетка может ассимилировать, что приводит к увеличению ее адаптив­ных возможностей.

В свете новых данных прионы можно определить как белки, способные через взаимодействие друг с другом пе­редавать свое конформационное состояние от одной моле­кулы к другой. В этом случае определение «прионы» мо­жет быть распространено и на соответствующие белки дрожжей и подобные белки других организмов, которые, несомненно, будут еще открыты в будущем.