Терапия и профилактика вирусных инфекций

Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии. Зинченко А.И., Паруль Д.А. — 2005

• Способы контроля вирусных инфекций
• Вакцинотерапия и вакцинопрофилактика
  • Принцип вакцинации
  • Типы вакцин
  • Вакцины, находящиеся в употреблении в настоящее время
• Клиническое применение интерферона и его индукто­ров
• Химиотерапия вирусных инфекций
  • Понятие о химиотерапевтическом индексе анти­вирусных препаратов
  • Разработка и испытания противовирусных препара­тов
  • Успехи химиотерапии. Противовирусные препараты
    • Сложность борьбы с вирусными инфекциями
    • Вирулицидные препараты
    • Препараты, ингибирующие адсорбцию, проник­новение и раздевание вирусов
    • Препараты, ингибирующие синтез вирусных нуклеиновых кислот
    • Ингибирование экспрессии вирусных генов

СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

К антивирусным препаратам относятся пре­параты, обладающие этиотропным эффектом. Контроль вирусных инфекций включает сле­дующие способы (табл. 5.1):

• специфический, достигаемый с помощью вакцин;
• неспецифический, когда стимуляция ре­зистентности организма достигается с помощью интерферона, его индукторов и имму­номодуляторов ;
• химический — при использовании химио­препаратов, избирательно подавляющих репродукцию вирусов.

Каждый из перечисленных способов имеет свои достоинства и недостатки. Так, вакцины, обладая максимальной эффективностью и длительностью защиты, отличаются узкой направленностью и пригодны в основном для профилактики. Напротив, интерферон, характеризую­щийся универсально широким спектром действия, приго­ден для терапии и менее эффективен в качестве средства профилактики. Еще в большей мере это относится к химио­препаратам, для которых характерны, за редким исключе­нием, узкая направленность действия и кратковременный эффект.

Таблица 5.1. Характеристика способов контроля вирусных инфекций

 

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ИНТЕРФЕРОНА И ЕГО ИНДУКТОРОВ

Интерферон. Существующие медицинские препараты интерферона делятся: по типу активного компонента — на а-, Р” и у-интерфероны; по способу получения и, следова­тельно, времени создания и начала клинического приме­нения — на природные (или интерфероны первого поколе­ния) и рекомбинантные (или интерфероны второго поко­ления) (табл. 5.3).

Таблица 5.3. Применяемые препараты интерферона

Спектр заболеваний, при которых показано примене­ние интерферона, можно разделить на три большие груп­пы: вирусные инфекции (табл. 5.4), болезни злокачест­венного роста и прочие заболевания.

Таблица 5.4. Эффективность использования интерферона при терапии некоторых вирусных инфекций

К перечню, представленному в табл. 5.4, можно доба­вить вирусные осложнения, часто наблюдающиеся при трансплантации органов и на фоне приема иммунодепрес­сантов. Применение интерферона такими больными при­водит к улучшению общего состояния, уменьшению или снижению симптомов интоксикации и т.д.

Особо следует отметить, что самым эффективным сред­ством для терапии такого грозного заболевания, как хронический гепатит С, является разрешенная к применению с 1998 г. комбинация «рекомбинантный а-интерферон + виразол » (препарат «Ребетрон»).

Индукторы интерферона. Индукторы интерферона представляют собой разнородную по составу группу высо­ко- и низкомолекулярных природных и синтетических со­единений, объединенных способностью вызывать в орга­низме образование эндогенного интерферона. Многие со­единения этой группы обладают противовирусной, анти- пролиферативной и иммуномодулирующей активностью, т.е. всеми характерными для интерферона эффектами. В табл. 5.5 представлены примеры имеющихся в настоя­щее время нескольких весьма перспективных для меди­цины индукторов интерферона, пригодных для профилактики и лечения вирусных инфекций.

Таблица 5.5. Индукторы интерферона, пригодные для клинического применения

Изучение эффективности индукторов интерферона при различных экспериментальных вирусных инфекциях и при клиническом применении позволило выявить важней­шее свойство индукторов — универсально широкий диапа­зон противовирусной активности, а также то, что их актив­ность, в целом, совпадает с антивирусными эффектами эк­зогенных интерферонов. При этом наиболее активными индукторами интерферона зарекомендовали себя очищен­ная природная двухцепочечная РНК и искусственные двухцепочечные полинуклеотиды (при обязательном усло­вии их достаточно высокой молекулярной массы).

Ранее индукторы интерферона применяли главным об­разом местно, однако в настоящее время есть все основа­ния предполагать, что в недалеком будущем будет широко распространено и системное применение этих препаратов.

Наконец следует отметить, что препараты, которые ин­дуцируют синтез эндогенного интерферона, имеют ряд преимуществ перед экзогенным интерфероном.

• Индукторы относительно стабильны, дешевы и дос­тупны. Они не обладают антигенностью.
• Естественный (хотя и стимулированный) синтез эн­догенного интерферона не вызывает гиперинтерфероне- мии, которая нередко возникает при введении экзогенных (особенно рекомбинантных) интерферонов и приводит к тяжелым побочным явлениям.
• Однократное введение индуктора интерферона обес­печивает длительную циркуляцию интерферона на тера­певтическом уровне. Для достижения такого уровня экзо­генного интерферона требуется многократное введение высоких его доз, поскольку время полужизни интерферо­на в крови составляет всего 20-40 мин.
• Широко применяемые сейчас интерфероны (реком­бинантные) являются препаратами только а-интерферона, что существенно ограничивает их противовирусные свой­ства, так как для эффективной противовирусной защиты необходимо наличие всех трех классов интерферонов, син­тез которых и вызывается применением индукторов интерфероногенеза.

В заключение разговора об интерфероне следует подчерк­нуть, что интерферон является хотя и мощным, однако не «высокоточным оружием». Образно говоря, это оружие стреляет по площадям. Как следствие — интерфероновая терапия сопровождается серьезными побочными эффек­тами (лихорадка, тошнота и другие недомогания). На ос­новании этого многие исследователи считают, что интер­ферон никогда не будет широко применяться для лечения тривиальных вирусных инфекций типа простуды. Однако для терапии угрожающих жизни заболеваний (например, эндогенные гепатиты) применение его будет со временем лишь возрастать.

 

ХИМИОТЕРАПИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Понятие о химиотерапевтическом индексе антивирусных препаратов

Химиотерапия вирусных инфекций (ХВИ) — это раздел вирусологии, основными задачами которого являются по­иск, испытание и отбор противовирусных лекарственных средств синтетического или природного происхождения. В настоящее время эта наука, развивая классический скрининг препаратов, использует достижения молекуляр­ной биологии, генетики и биохимии вирусов для разработ­ки научно обоснованного подхода к решению данной проб­лемы. В связи с тем что вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, основной принцип ХВИ заключается в избирательном подавлении репродукции вирусов без существенного нарушения жизненных функ­ций клетки-хозяина и макроорганизма в целом.

Следует отметить, что это классическое положение ХВИ в последнее время существенно расширено. К анти­вирусным химиопрепаратам сейчас многие относят не только препараты, которые селективно ингибируют от­дельные этапы вирусной репродукции в клетке, но и вирулицидные вещества, инактивирующие внеклеточный ви­рус, а также вещества, которые влияют на структуры клетки, принимающие участие в механизмах репродук­ции вируса. Наконец, к антивирусным химиопрепаратам часто относят и такие препараты, которые действуют на зараженные вирусом клетки и приводят к элиминации их из организма.

Основное требование, которое предъявляется к антиви­русным препаратам, — специфичность. Именно поэтому главным показателем клинической пригодности препара­тов служит их химиотерапевтический индекс (ХТИ).

Химиотерапевтический индекс в его классическом пони­мании обычно изображается в виде следующей формулы:

 

Величина частного определяет качество химиопрепара­та. Дадим пояснения. Чем больше числитель, тем более это свидетельствует о хорошей переносимости химиопрепара­та, а значит, и о возможности безопасно повышать его дозу. Другими словами, высокий числовой показатель числите­ля — это показатель малой токсичности препарата и, следо­вательно, ценности его как антивирусного средства.

Знаменатель указывает на минимальную лечебную до­зу. Нетрудно понять, что здесь благоприятствующее для оценки препарата значение будет определяться обратным отношением к числителю: чем меньшая доза необходима для получения лечебного эффекта, тем выше ценность препарата. Из всего вышеизложенного следует, что идеаль­ным химиопрепаратом будет такой, который характери­зуется большим цифровым показателем в числителе и очень малым — в знаменателе.

Практика показывает, что соотношение рассматривае­мых параметров чрезвычайно важно. Нередко из-за резко­го нарушения в этом соотношении препарат оказывается негодным, его практически нельзя применять — очень не­высокая толерантность организма к препарату, определя­емая небольшой цифрой в числителе, характеризует его высокую органотропность. С другой стороны, высокий цифровой показатель в знаменателе указывает на необхо­димость сильно поднимать дозы для получения терапев­тического эффекта, что свидетельствует о низком этио- тропном свойстве препарата.

Справедливости ради следует заметить, что существует проблема с унификацией критериев активности и токсич­ности противовирусных соединений. Не вдаваясь в детали проблемы, отметим, что различными исследователями па­раметры, располагающиеся в числителе и знаменателе формулы ХТИ, рассчитываются по-разному, что несколь­ко затрудняет сопоставление данных, полученных раз­личными авторами.

Разработка и испытания противовирусных препаратов

Как правило, разработка противовирусных препаратов должна вестись в порядке, который в немного упрощен­ном виде иллюстрирует рис. 5.1.

Задача начального этапа испытаний — объективно и точно выявить первичную специфическую противовирус­ную активность соединения и дать заключение о его перс­пективной значимости и целесообразности испытаний в опытах на животных. Практика показала, что наиболее дешево и быстро можно получить такие данные, исполь­зуя тканевые культуры.

Противовирусную активность препаратов в культуре ткани (КТ) выявляют с помощью тех же тестов, что ис­пользуются для оценки репродукции вируса: цитопатический эффект, феномен гемагглютенации, феномен гемадсорбции, метод флюоресцирующих антител, метод электронной микроскопии и метод бляшек (негативных колоний). При этом наиболее часто в последние 20-25 лет активность препаратов в КТ определяют методом редук­ции бляшек.

Популярной модификацией метода подавления бля­шек является методика градиента концентрации исследу­емого вещества в агаре, которое вносится в лунку, высе­ченную в центре чашки Петри, с инфицированными клет­ками. По этой методике можно определять минимальную активность исследуемого вещества с одновременной оцен­кой его токсичности для клеток.

Широко используется также дисковый метод подавле­ния образования негативных колоний, состоящий в том, что исследуемое соединение вносится в составе фильтро­вального диска в культуру клеток с агаровым покрытием.

На стадии первичного отбора противовирусных препа­ратов особую ценность приобретают системы для одновре­менной оценки большого числа соединений. Описана ме­тодика исследования противовирусной активности химио­препаратов с использованием культуры ткани в микро­объемах. По этой методике культуру клеток выращивают в пластиковых панелях с 96 лунками, в каждую из кото­рых вносят по 0,1 мл вируссодержащей среды. После 72 ч инкубирования культуру клеток микроскопируют для оп­ределения цитопатического действия (ЦПД). По такой ме­тодике можно исследовать сразу большое число препара­тов при небольших расходах питательных сред и изучае­мых соединений.

Можно упомянуть и один из ускоренных методов оцен­ки противовирусной активности соединений, который ос­нован на определении интенсивности включения ³Н-уридина или ³Н-тимидина в нуклеиновые кислоты соответ­ственно РНК-содержащих или ДНК-содержащих вирусов. В суспензию клеток вносят исследуемый вирус и спустя 30-60 мин распределяют по лункам панелей. Пред­варительно в каждую лунку наливают раствор испытуе­мого вещества и один из указанных выше радиоактивно меченных предшественников вирусной нуклеиновой кис­лоты. Пробы инкубируют 5 ч при 37°С. Затем радиоактив­ность, включившаяся в высокополимерную (кислотонера­створимую) фракцию клеточных лизатов, замеряется в жидкостном сцинтилляционном счетчике. При помощи этого метода один работник за 3 ч может исследовать до 100 образцов различных соединений. Считается, что оцен­ка противовирусной активности соединений методом ин­гибирования синтеза вирусных нуклеиновых кислот бо­лее точная, чем методом редукции бляшек.

При отборе антивирусных средств большое значение имеет правильная оценка токсичности соединений. Наибо­лее широко распространенным и простым является метод прижизненного морфологического исследования клеток культуры ткани, которая инкубируется 48 ч в присутствии тестируемого соединения. Морфологическая оценка цито­токсичности основана на использовании результатов свето­вой, фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии.

В качестве критерия токсического поражения клеток используются результаты теста на жизнеспособность. До­за препарата оценивается как нетоксичная, если культура клеток после смены среды, содержащей препарат, способ­на репродуцировать вирус в том же титре, что и интактная культура. Этот метод определения токсичности химиопре­паратов считается более чувствительным, чем метод при­жизненного морфологического исследования. Минималь­ная доза препарата, полностью прекращающая размноже­ние в клетках вируса, рассматривается как токсичная.

Критерий эффективности антивирусных препаратов — ХТИ — в экспериментах с использованием культуры ткани определяется, как отношение среднетоксичной концент­рации вещества (СТ₅₀) к среднеэффективной вирусинги- бирующей концентрации (ЕД₅₀). Соединения с ХТИ более 8 считаются перспективными для дальнейших исследова­ний в опытах на животных.

Здесь уместно сделать следующее замечание. В англо­язычной литературе для обозначения ХТИ приняты индек­сы TI (therapeutic index) или SI (selectivity index). Их рассчет производится из отношения 1С₅₀/ЕС₅о, где 1С₅₀ — кон­центрация ингибитора, подавляющая рост клеток или жизнеспособность неинфицированных клеток на 50%, а ЕС₅₀ — концентрация ингибитора, подавляющая на 50% продукцию вируса, инфекционность вируса или вирусиндуцированный цитопатический эффект.

Далее на животных исследуют специфическую актив­ность, а также острую и хроническую токсичность препа­ратов после различных способов их введения. Критерием эффективности служит процент выживаемости и ХТИ. Препараты, обеспечивающие выживаемость (защиту) не менее 50% животных от 10 ЛД₅о, считаются перспектив­ными для дальнейшего изучения.

Острую и хроническую токсичность новых препаратов нужно изучать не менее чем на трех видах животных, включая собак. Аналоги известных химических соедине­ний допускается изучать на животных двух видов, один из которых не относится к грызунам. В качестве подопытных животных для изучения противовирусных препара­тов используются самые разнообразные животные, в том числе белые мыши, хлопковые крысы, морские свинки, кролики, хомяки, хорьки, поросята, собаки, обезьяны.

Оценка на животных является абсолютно необходимой хотя бы потому, что между активностью препарата in vitro и in vivo далеко не всегда существует корреляция. Чем это можно объяснить? Универсального ответа не существует. Это может быть плохая всасываемость препарата (т.е. био­доступность), подверженность препарата непродуктивно­му метаболизму в макроорганизме и т.д.

Следует отметить, что экспериментальная модель ви­русной инфекции для оценки противовирусной активнос­ти препаратов должна как можно точнее воспроизводить заболевание человека. Чем больше сходство, тем выше корреляция между результатами, полученными на лабо­раторных животных и у человека. К сожалению, удовлет­ворительных моделей такого типа для большинства ви­русных инфекций мало.

В схемах оценки препаратов при изучении на живот­ных моделях предусматривается введение их до и после заражения — для определения профилактического и ле­чебного эффекта. Обычно ХТИ в опытах на животных вы­ражается отношением ЛД₅₀ к ЕД₅₀, где ЕД₅₀ — суточная доза препарата, защищающая 50% животных. Принято, что препараты с ХТИ меньше 2 — неактивны, а с 4 и выше — перспективны для дальнейшего изучения в клинике.

Следует отметить, что кроме высокой специфичности к антивирусным препаратам предъявляется много других требований, а именно:

• хорошая растворимость в водной среде;
• сохранность структуры при введении в организм;
• скорость адсорбции слизистыми и элиминации из ор­ганизма;
• способность проникать в ткани-мишени;
• стабильность при хранении;
• доступность сырья и простая технология производ­ства и т.д.

По поводу последнего по списку (но не по значимости!) требования необходимо отметить, что именно из-за отсут­ствия подходящей технологии производства часто внедре­ние препаратов в практику здравоохранения задержива­ется на десятки лет.