Специальные клетки для абсорбции и секреции. Патофизиология диареи

Глава 5. Патофизиология диареи

Поверхностные клетки и клетки крипт специализированы для абсорбции и секреции

Абсорбция и секреция солей, приводящие к перемещению воды через стенку тонкой кишки, осуществляются специализированными клетками эпителия. Абсорб­ция осуществляется эпителиальными клетками ворсинок, которые активно абсор­бируют Na⁺. Секреция производится клетками, расположенными в криптах, кото­рые активно перемещают Cl^–. Несмотря на то, что эти клетки активно транспорти­руют столь разные ионы, параллельно осуществляется и котранспорт: абсорбция Na⁺ не может происходить без абсорбции Cl^–, а секреция Cl^– происходит с парал­лельным перемещением Na⁺. Активный транспорт является основой перемещения ионов, а перемещение ионов с противоположным зарядом — также неотъемлемая часть этого процесса.

На Рис. 5-6 показаны молекулярные механизмы транспорта солей клетками ворсинок и крипт в тонкой кишке. В обоих типах клеток вектор транспорта ионов связан с выраженным полярным распределением мембранных белков, которые способствуют транспорту ионов через апикальные и базолатеральные участки мем­браны клеток. В настоящее время найдены и специальные гены, ответственные за синтез этих белков.

Особой структурой как в абсорбирующих, так и в секретирующих клетках является Na⁺,K⁺-ATФaзa. Этот транспортный белок расположен исключительно на базолатеральных участках мембраны клеток кишечника и связывает непосред­ственно процессы ионного транспорта и энергетические процессы в клетках. Na⁺,K⁺-АТФаза поддерживает низкий уровень внутриклеточного Na⁺ и высокую концент­рацию внутриклеточного К⁺ за счет гидролиза АТФ. Na⁺,K⁺-ATФaзa создает гра­диенты концентраций Na⁺ и K⁺, необходимые для поддержания абсорбционной и секреторной активности в эпителиальных клетках кишечника.

Абсорбирующие клетки

Мембрана щеточной каемки абсорбирующих клеток специализирована в от­ношении пассивного транспорта Na⁺ в клетки из просвета кишки. В тонкой кишке это происходит преимущественно двумя путями. Первый путь: антипорт Na⁺/H⁺, специализирующийся на катализе обмена этих ионов в соотношении 1:1. При этом ионы натрия входят в клетку, а протоны водорода выходят из клетки. Второй меха­низм — котранспортер Na^+/глюкоза, переносящий внутрь клетки ионы Na⁺ и моле­кулы глюкозы в соотношении 1:1, либо в соотношении 2:1. Таким образом, в при­сутствии глюкозы Na⁺ поступает в клетку вместе с ней. В этом механизме свобод­ная энергия натриевого градиента способствует абсорбции глюкозы. Однако необ­ходимо отметить, что наличие глюкозы в просвете кишки резко повышает абсорбцию натрия, усиливая его проникновение в клетки. Этот механизм лежит в основе использования растворов глюкозы перорально для регидратации больных с диаре­ей, так как глюкоза повышает абсорбцию Na⁺ и воды. Растворы, содержащие толь­ко необходимые электролиты, менее эффективны, поскольку они не стимулируют глюкозозависимый транспорт Na⁺ в клетки.

Рис. 5-6. Молекулярные механизмы транспорта веществ клетками ворсинок и крипт в тонкой кишке. Показаны некоторые мембранные белки, участвующие в транспорте солей через апикальные и базола­теральные участки мембраны. Разница электрических потенциалов (V_m) между апикальными и базо­латеральными участками мембран абсорбирующих и секретирующих клеток ориентирована таким образом, что клетки относительно экстрацеллюлярной жидкости имеют отрицательный заряд. Вели­чина V_m на базолатеральном участке мембраны больше, чем V_m апикального участка мембраны, поэто­му трансэпителиальный электропотснциал, измеренный через слой эпителиальных клеток, является отрицательным со стороны просвета кишки

Na⁺,K⁺-ATФaзa базолатерального участка мембраны и белки-переносчики Na⁺ в апикальных отделах мембраны клеток отвечают за трансцеллюлярный перенос Na⁺ из просвета кишки в кровь; поэтому активный транспорт Na⁺ — основной меха­низм абсорбции солей и воды. Абсорбция Сl^–, соответствующая абсорбции натрия, происходит двумя путями. Часть Сl^– абсорбируется из межклеточного простран­ства благодаря слабому электрическому потенциалу, отрицательному со стороны просвета кишки. Кроме этого, существует и трансцеллюлярный механизм абсорб­ции Сl^–, обеспечиваемый Сl^–/НСО₃^–-антипортом в апикальном участке мембраны. Механизм транспорта хлора через базолатеральный участок мембраны пока не со­всем понятен: это может быть либо Сl^–-селективный канал, либо Сl^–,K⁺-котранспортер. Образование Н⁺ и НСО₃^– из угольной кислоты с помощью карбоан­гидразы способствует сочетанному транспорту Na⁺ и Сl^–.

Секреторные клетки

Транспортные белки в секреторных клетках отличаются от транспортных бел­ков в клетках ворсинок (рис. 5-6). Содержание Na⁺ в клетках регулируется белками базолатерального участка мембраны, в то время как проницаемость для Na⁺ в апикальных отделах клеток относительно мала. Натрий поступает в клетку через базо­латеральный участок мембраны посредством механизма сочетанного транспорта; в каждом цикле в клетку переносится по одному иону Na⁺ и К⁺ и по два иона Cl^–. Так как суммарный заряд при таком переносе ионов равен нулю, скорость транспорта зависит не от мембранного потенциала, а от концентрации этих трех ионов. Сум­марный эффект направленных внутрь градиентов Na⁺ и Cl^– и направленного нару­жу градиента 1C приводит к перемещению всех трех ионов внутрь клетки. Натрий, который входит в клетку и выходит из нее, рециркулирует за счет Nа⁺,К⁺-АТФазы. Таким образом, поддерживается высокий градиент Na⁺ вне клетки. Транспортный белок в этих клетках сходен с белком апикальной мембраны клеток почечных ка­нальцев, переносящих натрий. Фармакологический эффект некоторых диурети­ков (фуросемида, буметанида) основан на их влиянии именно на этот белок.

Ионы хлора, которые проникают в клетку через базолатеральные участки мем­браны, выходят из клетки через селективные Cl^–-каналы в апикальных участках мембраны. Хлор выходит из клетки пассивно. Концентрация Cl^– в клетке постоян­на и составляет около 30 ммоль/л, в просвете кишки она в три раза меньше, при этом разность потенциалов — около 50-60 мВ. Поэтому при открытии каналов Cl^– выходит из клетки (рис. 5-6). Выход Na⁺ требуемый для компенсации выхода Cl^–, происходит преимущественно интерцеллюлярно под действием отрицательного электрического потенциала в просвете кишки. Надо сказать, что активная абсорб­ция Na⁺ и активная секреция Cl^–, несмотря на разнонаправленный транспорт, со­здают отрицательный потенциал в просвете кишки (см. подпись к Рис. 5-6). Инте­ресно отметить, что основные механизмы этой секреции встречаются у некоторых позвоночных, но не у млекопитающих, например у акул и птиц, которые имеют так называемые «солевые железы», секретирующие соль.

Цитоплазматическая цАМФ является основным регулятором абсорбции и секреции

Секреция и абсорбция солей — регулируемые процессы, и их нарушение при­водит к диарее. Цитоплазматическая циклическая АМФ (цАМФ) является основ­ным фактором в их регуляции. Механизмы, приводящие к повышению концентра­ции цАМФ в цитоплазме, как правило, усиливают секрецию и снижают абсорбцию солей, приводя к суммарному увеличению секреции. Для понимания этих процес­сов необходимо описать регулируемые транспортные механизмы (каналы и транс­портеры) и компоненты клеточных систем, связанные с цАМФ.

На Рис. 5-7 представлен вторичный мессенджер сигнальной системы (цАМФ), характерный для большинства клеток. Некоторые агонисты, стимулы и фармакологические препараты активируют эту систему, влияя на синтез цАМФ, разруше­ние цАМФ или на оба этих процесса. Активирующий стимул может взаимодей­ствовать с регуляторным G-белком либо прямо, либо через рецепторы, повышая активность аденилатциклазы, что приводит к увеличению синтеза цАМФ из АТФ. Молекула цАМФ связывается в цитоплазме с регуляторными субъединицами другого фермента (протеинкиназы А), вызывая отщепление активной каталити­ческой субъединицы, которая может катализировать перенос фосфата на клеточ­ные белки.

Наиболее важным механизмом в регуляции внутриклеточных процессов яв­ляется фосфорилирование, которое имеет значение для транспорта электролитов и воды в кишечнике, в частности в секреторных клетках кишечных крипт. Как по­казано на Рис. 5-6, любое трансцеллюлярное перемещение Cl^– (как поступление хлора через базолатеральные, так и выход хлора через апикальные участки мемб­раны) регулируется реакцией фосфорилирования. Фосфорилирование апикального Сl^–-селективного канала увеличивает время открытия этого канала, а фосфорили­рование Na⁺,K⁺, 2Cl^–-тpaнcпopтнoгo белка усиливает активность этого процесса. Таким образом, любой стимул, увеличивающий содержание в клетке цАМФ, мо­жет вызвать резкое усиление активной секреции Cl^–.

Роль цАМФ в механизме абсорбции до конца не изучена, хотя есть убедитель­ные данные, говорящие за то, что повышение концентрации цитоплазматической цАМФ уменьшает абсорбцию солей, вероятно, угнетая абсорбцию Na⁺ и Cl^– на апи­кальном участке мембраны. Суммарный секреторный эффект при повышении кон­центрации цАМФ усиливается, поскольку, с одной стороны, происходит увеличе­ние секреции, с другой — уменьшение абсорбции. Нет данных о влиянии цАМФ на активность котранспортера Na⁺ и глюкозы апикального участка мембраны. Поэто­му такой путь поступления Na⁺ в клетку не подавляется даже в случае сильной стимуляции, приводящей к значительному повышению секреции Cl^–. Это объяс­няет эффективность регидратации пероральным приемом растворов глюкозы при лечении диареи.

Циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) также является важным мессенд­жером в регуляции секреции Cl^–. Он образуется под действием гуанилатциклазы и активирует киназу, известную как протеинкиназа G. Циклический ГМФ, как и цАМФ, усиливает секрецию солей, а также ослабляет абсорбцию, хотя тонкие мо­лекулярные основы этих изменений еще менее изучены. Следующим внутрикле­точным мессенджером является кальций, который также модулирует абсорбцию и секрецию, хотя механизмы этого действия тоже пока мало изучены.

Cl^–-канал апикального участка мембраны является трансмембранным регулятором, «сопровождающим» муковисцидоз

В последние годы резко возрос интерес к белку, функционирующему в каче­стве хлорного канала в апикальных участках мембраны секреторных клеток тон­кой кишки, поскольку при врожденном заболевании — муковисцидозе (кистозном фиброзе) обнаружена мутация гена, кодирующего именно этот белок. Ген кодиру­ет белок , состоящий из 1480 аминокислот и названный муковисцидозным транс­мембранным регулятором (cystyc fibrosis transmembrane conductance regulator [CFTR]), который действует в качестве Cl^–-селективного ионного канала. Он ак­тивируется цАМФ и имеется в клетках поджелудочной железы, кишечника, дыха­тельных путей, половых органов. Мутация этого гена приводит к нарушению сек­реции Cl^–, что является причиной многих симптомов при муковисцидозе. Наруше­ние транспорта Cl^– может быть прямым следствием дисфункции CFTR Cl^–-канала. Мутация может приводить: (1) к образованию неполной цепочки белка, кото­рый быстро разрушается в клетке, (2) к синтезу белка с нормальной длиной цепоч­ки, но не встраивающегося в апикальный участок мембраны, (3) к синтезу белка с полной (нормальной) длиной цепочки, но функционально дефектного, который встраивается в апикальный участок мембраны. Наиболее частая мутация — это потеря фенилаланина в положении 508 (ДР508), приводящая к образованию це­почки белка с почти полной длиной, не встраивающейся в мембрану клетки.

Молекулярные механизмы активации CFTR были изучены при анализе его аминокислотного состава (см. рис. 5-8). Большой цитоплазматический домен (R-домен) содержит много участков, подвергающихся фосфорилированию протеинкиназой А (ПКА). Было установлено, что удаление этих участков снижает ак­тивность хлорных каналов при повышении концентрации цитоплазматической цАМФ. Эти каналы имеют также два других цитоплазматических регуляторных домена, которые называются нуклеотидсвязывающими, так как они почти гомоло­гичны семейству белков, связывающих и гидролизующих АТФ. Повышение кон­центрации цАМФ в цитоплазме активирует CFTR следующим образом: цАМФ связывается с каталитической субъединицей протеинкиназы А и освобождает ак­тивную каталитическую субъединицу, которая способствует фосфорилированию одной или нескольких сериновых структур R-домена CFTR. Затем нуклеотидсвязывающие участки присоединяют и гидролизуют АТФ, что в результате открыва­ет каналы. Затраты энергии при этом необходимы для изменения конформацион­ной структуры канала, что ведет к его открытию, после чего происходит пассивный транспорт ионов и затрат АТФ для этого процесса не требуется.

Рис. 5-7. Схема действия вторичного мессенджера сигнальной системы (цАМФ), обнаруженного в большинстве клеток. Связывание гормона (или нейротрансмиттера) с его рецептором образует акти­вированный комплекс, взаимодействующий со стимулирующим G-белком

Рис. 5-7 (продолжение). Активированный G-белок освобождается от гуанозиндифосфата (ГДФ), с ко­торым он связан в неактивированном состоянии, и соединяется с гуанозинтрифосфатом (ГТФ). Это приводит к образованию С;д и Gp у-субъединиц, после чего Gsa связывается с аденилатциклазой, кото­рая катализирует образование цАМФ из АТФ. Циклическая АМФ образует связи с регуляторными субъединицами протеинкиназы А, от которой отсоединяются каталитические субъединицы, регулиру­ющие фосфорилирование соответствующих участков белков.

Рис. 5-8. Вероятное строение CFTR. Белок состоит из 1480 аминокислот, образующих около пяти доменов: два мембранно-соединенных домена (MSD1 и MSD2), каждый из которых содержит шесть сегментов, организованных таким образом, что формируют хлорный канал; и три цитоплазматических домена (NBF-1, NBF-2 и R), регулирующих активность канала

В секреторных клетках кишечника CFTR является единственным хлорным каналом, в то время как в секреторных клетках других тканей (дыхательные пути и слюнные железы) имеется еще и кальцийзависимый Сl^–-канал в апикальном уча­стке мембраны. Поэтому у больных с муковисцидозом эпителий кишечника не спо­собен секретировать Сl^–. Исследования распределения матричной РНК, прове­денные с помощью гибридизации клеток показали, что информация для синтеза CFTR реализуется в клетках крипт кишки, где и происходят секреторные про­цессы.

Энтеротоксины бактерий активируют систему вторичных мессенджеров в клетках

Большинство данных о внутриклеточных механизмах абсорбции и секреции получены при изучении эффектов бактериальных энтеротоксинов, вызывающих тяжелую диарею. Наиболее показательно исследование холерного экзотоксина Vibrio cholerae — инфекции, вызывающей эпидемии в Азии и Южной Америке. Ки­шечная секреция под действием холерного токсина является следствием длитель­ной активации аденилатциклазы и увеличения концентрации цитоплазматической цАМФ. Экзотоксин представляет собой пептид с массой 84 кД и состоит из одной А и пяти В субъединиц. Субъединица А является простым полипептидом массой 29 кД, в свою очередь, она состоит из двух компонентов — Al (23 кД) и А2 (6 кД), соединенных дисульфидным мостиком. После связывания холерного токсина че­рез свои В субъединицы с поверхностью апикальной мембраны субъединица А про­никает в клетку, где высвобождается компонент Al. В цитоплазме он действует как белок, катализирующий ковалентную модификацию G-протеина для актива­ции аденилатциклазы. АДФ-рибоза присоединяется к аргининовому остатку а-субъединицы G_s, после чего модифицированная б-субъединица отсоединяется от а- и б-субъединиц и активирует аденилатциклазу, что приводит к повышению цАМФ и стимуляции апикальных Cl^–-каналов в секреторных клетках и к сниже­нию активности абсорбирующих клеток. В конечном счете это завершается тяже­лой секреторной потерей солей и воды, опасной для жизни. Предполагается, что наличие у больного мутации гена CFTR, вызывающей у гомозигот тяжелые прояв­ления муковисцидоза, у гетерозигот (с потерей только одного гена) сопровождает­ся меньшей чувствительностью к некоторым факторам, способствующим секре­торной диарее. Естественными стимуляторами секреции, опосредованными цАМФ, являются секреторные нейротрансмиттеры и, прежде всего, вазоактивный интес­тинальный полипептид.

Другим важным способом оценки механизмов нарушения секреторного про­цесса явилось исследование действия термостабильного энтеротоксина Escherichia coli (группа из 18-19-аминокислотных пептидов), активирующего гуанилатцик­лазу щеточной каемки. Эти секретируемые пептиды связываются с рецепторами гормона гуанидина на апикальном участке мембраны. По-видимому, данные ре­цепторы сами являются гуанилатциклазой, а связывание с ними стимулирует сек­рецию и угнетает абсорбцию через механизм цитоплазматической цГМФ.