Синтез белков при гипотермии у растений. Изучение синтеза белков

СИНТЕЗ БЕЛКОВ ПРИ ГИПОТЕРМИИ

Белки низкотемпературного стресса растений. Колесниченко А.В. 2003

• Изучение синтеза белков при помощи радиоактивной метки
• Изучение синтеза белков при помощи ингибиторов белкового синтеза
• Изучение белкового синтеза в последействии гипотермии
• Изучение синтеза белка de novo

Основные методические подходы, применяемые при изучении отдельных стадий синтеза белка и регуляции этого процесса под действием меняющейся температуры, связаны с использованием радиоактивно меченых аминокислот, электрофореза, авторадиографиии и применения ингибиторов белкового синтеза.

Изучение синтеза белков при помощи радиоактивной метки

При изучении включения ¹⁴С-глицина и ^S-метионина у скерды волокнистой и гаплопаппуса, меченых в течение 20-24 часов при 0.5⁰С, наблюдали интенсивное включение радиоактивно метки, мало отличающееся от включения при 20⁰С (Гриф, 1966). Эти результаты позволяют сделать предположение о том, что при снижении температуры почти до 0⁰С синтез белка сохраняется, хотя при таких низких температурах митоз у растений полностью остановлен. Автором сделано заключение о том, что при низких температурах синтез белков тормозится в меньшей степени, чем синтез нуклеиновых кислот (Гриф, 1966). Другими же авторами, наоборот, отмечается высокая термостабильность процесса транскрипции, а наиболее чувствительным к действию температуры процессом считается инициация трансляции (Bernstam, 1978).

Резкое охлаждение растений озимой пшеницы приводит к сильному ингибированию белкового синтеза, который, тем не менее, сохраняется. Было показано, что даже после действия слабо отрицательно температуры (-3⁰С) включение ¹⁴С — гидролизата белка в белки узлов кущения озимой пшеницы сорта Мироновская 808 составляло около 10% от включения метки при 18 ⁰С. В тех же условиях метка не включалась в белки пшеницы сорта Армавени, то есть проявляются генотипические особенности синтеза белков у озимой пшеницы при гипотермии. При -5 ⁰С включение метки прекращалось у обоих сортов (Колоша и др., 1978).

При изучении влияния холодового шока (-4 ⁰С, 1 час) на синтез белков в побегах высокоморозостойкого сорта озимой ржи сорта Удинская был зарегистрирован высокий уровень (30% от контрольного) включения ¹⁴С-лейцина в белки (Войников, Бурбанова, 1981). Однако на основании только этих данных нельзя сделать вывод о синтезе белка de novo при гипотермии. Более важными с это точки зрения являются результаты, полученные при помощи электрофоретических методов разделения белка.

Изучение синтеза белков при помощи ингибиторов белкового синтеза

Индуцируемые гипотермией изменения в белковом спектре могут быть следствием либо трансформации белковой молекулы, либо синтеза белка de novo. Опыты с применением циклогексимида позволяют склониться при решении данного вопроса в пользу второго предположения. Циклогексимид при введении в клетку блокирует трансляцию белков в цитоплазме на 80S рибосомах (Galling, 1982).

В целом ряде других работ показано, что блокирование синтеза белка циклогексимидом в растениях озимых злаков во время холодового закаливания тормозит развитие морозоустойчивости и она остается на уровне незакаленного растения (Трунова, Зверева, 1977; Титов и др., 1992). Исследование действия ингибиторов белкового синтеза (циклогексимида и хлорамфеникола) показало отсутствие их влияния на накопление сахаров при закаливании пшеницы и позволило авторам сделать вывод, что эти ингибиторы снижали морозоустойчивость не через блокировку процесса накопления сахаров, а за счет торможения белкового синтеза. Поскольку ингибирование циклогексимидом синтеза белка на 80S рибосомах тормозило развитие морозоустойчивости в гораздо больше степени, чем блокирование синтеза на 70S рибосомах хлорамфениколом (Трунова, Зверева, 1977), то было сделано заключение, что в адаптационные перестройки при закаливании к холоду вовлечен, главным образом, цитоплазматический аппарат белкового синтеза (Weidner, Combrink, 1979).

В то же время имеются сведения о том, что эффект воздействия хлорамфеникола на закаливание растений к холоду в значительно степени зависит от уровня освещения. Если на свету в пластидах хлорамфеникол в значительно степени подавлял развитие закаленного состояния у растений, то в темноте этот эффект практически полностью отсутствовал. Эти результаты говорят о важно роли белков, синтезирующихся на 70S рибосомах, в процессе закаливания растений к холоду (Титов, Критенко, 1983). Данные об изменении программы экспрессии хлоропластного белка с молекулярной массой 35 кД в результате охлаждения в темноте были получены при изучении реакции томатов на гипотермию (Liu et al., 1994). Хотя эти данные и противоречат приведенным выше результатам, показывающим важность синтеза белка на 80S рибосомах для развития закаленного состояния растений, это противоречие может быть снято, если учесть скоординированность работы белоксинтезирующей системы пластид с работой белоксинтезирующе системы, контролируемо ядерным геномом.

При изучении формирования устойчивости в начальный период закаливания растений при действии ингибиторов белкового синтеза и цитокинина было обнаружено, что циклогексимид и актиномицин D задерживали начало процесса повышения устойчивости растения к холоду, в то время как цитокинин, являющийся стимулятором процесса синтеза белка, ускорял этот процесс (Титов и др., 1992). Обработка листьев пшеницы циклогексимидом перед охлаждением уменьшала накопление определенных белковых фракций (Kasperska-Palasz et al., 1977a). В дальнейшем была установлена локализация этих фракций в цитозоле. Во фракции, содержащей митохондрии и хлоропласты, полосы белков с R_f 0.47 и 0.51 были настолько слабы, что объяснялись, по-видимому, цитозольным загрязнением. Изучение этих белков выявило их относительно низкую молекулярную массу (32 кДа и 26кДа), а также то, что они обнаруживают свойства основных белков и не являются нуклеопротеидами или гликопротеидами (Kasperska-Palacz et al., 1977b).

Было также обнаружено, что циклогексимид препятствует накоплению пептидов с молекулярными массами 85, 74, 67 и 24 кДа, происходящему при гипотермии (в сумме эти четыре белка составляют до 10% от суммарного растворимого белка) (Карасев и др., 1993; Новицкая и др., 1995).

Заключение авторов упомянутых выше работ о цитоплазматической локализации синтеза белков пшеницы при гипотермии подтверждается и другими данными, полученными при использовании циклогексимида и хлорамфеникола. Было показано, что хлорамфеникол ингибирует трансляцию на 70S рибосомах в хлоропластах и митохондриях (Войников, Бурбанова, 1981). Имеются данные о том, что, если в присутствии циклогексимида при гипотермии включение ¹⁴С-лейцина в белки пшеницы подавляется на 85%, то обработка хлорамфениколом не дает такого эффекта (Weidner, Combrink, 1979).

Эффекты декстрела (0.1, 1.0 и 10.0 мг/л) и хлорхолинхлорида (CCC, 1.0 и 10.0 мг/л) на ранних этапах развития холодоустойчивости у проростков огурца (Cucumis sativus L.) были изучены при закаливающих (10 и 8⁰C) и повреждающих (4⁰C) температурах. Другие внешние условия в ходе экспериментов сохранялись постоянными. Было показано, что действие ретардантов зависит от длительности предварительно обработки и их концентрации. Декстрел в концентрациях 0.1 и 1.0 мг/л усиливал начальные процессы адаптации в течение первого дня после помещения проростков в температуру 10⁰C. Этот эффект наблюдался, когда ретардант наносился на листья или корни перед закаливанием. Было продемонстрировано сходство эффекта гетероауксина при аналогичных условиях. При низкой повреждающей температуре (один день при 4⁰C), когда адаптивная возможность проростков огурца уменьшалась, декстрел противодействовал уменьшению адаптивного потенциала проростков более эффективно, чем CCC (Volkova et al., 1996).

С другой стороны, было показано, что холодовая обработка растений пшеницы приводит к изменению включения мечено аминокислоты в белки хлоропластов (Rochat, Therrien, 1975). Существуют также данные об уменьшении гидрофобности белков пшеницы при гипотермии (Weidner, Heuel, 1979).

Данные о влиянии гипотермии на полисомы растений достаточно противоречивы. С одной стороны, есть сведения о том, что во время закаливания растений к холоду полисомны профиль остается стабильным в отношении мономерных полисом (Leenders et al., 1974; Vigue et al., 1974). С другой стороны, по данным других авторов, одно из причин снижения уровня синтеза белка в клетках растений при гипотермии является именно распад полисом (Петрова, 1984). Третьи авторы отмечали, что, если полисомы из закаленных к холоду проростков озимых злаков при промораживании диссоциировали до моносом, а при оттаивании быстро собирались в полисомы без снижения их активности, то полисомны профиль из незакаленных растений был стабильным и они не восстанавливали свою активность после промораживания (Дунаева и др., 1993 a£).

Изучение белкового синтеза в последействии гипотермии

Следует отметить, что, хотя большинство работ в это области посвящены изучению изменений в белковом синтезе во время гипотермии, имеются сведения и о том, что после действия гипотермии также происходят значительные изменения в синтезе белков, причем оптимальная температура для этого процесса в проростках пшеницы, измерявшаяся по включению ¹⁴С-лейцина, зависит от температуры выращивания (Weidner, Ziemens, 1975). Это было показано в экспериментах, в которых выращенные при 20⁰С растения переносили на четыре дня в измененные температурные условия (от 4⁰С до 36⁰С), а затем определяли температурный оптимум белкового синтеза. Как оказалось, у охлаждавшихся растений этот показатель на 7-8⁰С ниже, чем у растений, находившихся в тепле.

Большой интерес представляют данные о воздействии на проростки озимой пшеницы кратковременно повторяющейся гипотермии. Оказалось, что уже после первого цикла действия гипотермии (-2⁰С, 1 час, с последующим отрастанием растений при 20⁰С в течение 2 часов) происходит синтез стрессовых белков с молекулярными массами 15, 32, 33, 55 и 150 кДа. После трех циклов такого охлаждения, судя по размерам пятен радиоактивно меченых полипептидов, количество некоторых стрессовых белков (в частности, белка с молекулярной массой 150 кДа) было не ниже, чем после четырехсуточной непрерывно гипотермии (Войников, Корытов, 1993). На основании этих данных авторами был сделан вывод о возможности существования триггерного механизма запуска синтеза стрессовых белков при гипотермии.

Как было показано, гены морозоустойчивости у пшеницы локализованы в хромосомах 7A, 1B, 4D, 5D (Шумская, 1987), а также 6A, 3B, 5B, 5D, 2A, 5A (Roberts, 1986), то есть этот признак имеет мультигенную природу. В то же время было показано, что 70% этого признака локализовано в хромосоме 5А (Poysa, 1984; Sutka, Kovacs, 1985). Поэтому неудивительно то, что в центре внимания исследователе в последнее время оказались конечные продукты экспрессии генов во время холодовой акклиматизации — полипептиды. Основной целью этих исследований является идентификация и изоляция полипептидов, появляющихся во время закаливания к холоду, установление их природной функции. В тоже время следует отметить, что из-за использования различных режимов закаливания и, как следствие этого, достижения растениями различно степени холодоустойчивости нередки расхождения в результатах исследований.

Изучение синтеза белка de novo

Основными методами, позволяющими судить о синтезе белков de novo, являются трансляция in vitro с изолированных матриц, электрофорез и изоэлектрическая фокусировка в сочетании с радиоизотопными методами. По результатам изучения трансляции in vitro изолированных матричных РНК были выявлены три типа реакции ядерных генов на гипотермию:

• уровень содержания большинства транскриптов оставался неизменным или слегка снижался;
• уровни содержания матричных РНК, кодирующих хлорофилл a/b связывающий белок и ряд других белков, сильно снижались;
• уровень же матричной РНК гена Rab 21 повышался при гипотермии (Hahn, Walbot, 1989).

Отмечалось также повышение уровня синтеза матричной РНК белка с молекулярной массой 14 кДа у риса (Koga-Ban et al., 1991) и появление матричных РНК белков с молекулярными массами 52.5, 38, 16.2 кД при яровизации озимой пшеницы (Bin et al., 1992). В то же время уровни содержания хлоропластных мРНК при гипотермии сильно снижались, а активность митохондриальных генов не изменялась (Hahn, Walbot, 1989). Однако некоторыми авторами (Кузнецов и др., 1992) отмечается увеличение содержания транскриптов генов хлоропластных белков при повышении терморезистентности озимой пшеницы, индуцируемо обработкой картолином-2 .

При помощи двумерного электрофореза, позволяющего в сочетании с флюорографией достигнуть высокого разрешения в идентификации белков, были получены следующие, весьма интересные данные. Холодовое закаливание этиолированных двухсуточных проростков пшеницы индуцировало накопление высокомолекулярного полипептида с молекулярной массой около 200 кДа (Sarhan, Perras, 1987). Для сравнения были взяты два холодоустойчивых сорта Fredrick и Norstar и менее устойчивый сорт Glenlea. Проростки подвергали длительному закаливанию от 10 до 30 суток, причем повышение содержания полипептида становилось заметным уже на десятые сутки и увеличение пятна на флюорограмме коррелировало со степенью холодоустойчивости сорта. Кроме того, повышалось содержание полипептидов с молекулярными массами 48, 47 и 42 кДа, а уровень содержания полипептидов с молекулярными массами 93, 89, 80, 68 и 63 кДа снижался в ходе закаливания.

Иммунологически родственны белку пшеницы с молекулярной массой 200 кДа белок ячменя с молекулярной массой 75 кДа также накапливался под действием низко температуры в течение первых семи дней закаливания. Впоследствии его содержание оставалось на высоком уровне. Накопление этого белка происходило быстрее у более морозоустойчивых сортов (Crosatti et al., 1994).

Накопление высокомолекулярных белков в ответ на холодовое закаливание было отмечено и другими авторами (Abromeit et al., 1992), причем у холодоустойчивого сорта Roughrider накопление семи белков с молекулярными массами 150 — 176 кДа было более выражено, чем у неустойчивого к холоду сорта Cappelle. Белки на электрофореграммах выявлялись уже после 48 часов закаливания.

После адаптации растений озимой пшеницы к низкотемпературному стрессу было отмечено накопление полипептидов с молекулярными массами 26-30 и 77-80 кДа (Петрова, 1992) и полипептидов с молекулярными массами 24 и 85 кДа (Карасев и др., 1991).

M. Perras и F. Sarhan изучали органоспецифичность белков холодового закаливания, а также сделали попытку определить, какие белки, синтезирующиеся при закаливании растений к холоду, относятся к стрессовым белкам, а какие являются белками роста и развития. Семидневные проростки пшеницы закаливали 10 и 40 суток, что соответствовало по физиологическому возрасту 9 и 14 суточным «контрольным» растениям. В закаленных растениях индуцировался синтез по меньше мере восьми белков. Полипептид с молекулярной массой 200 кДа (pI 6.5) синтезировался в листьях, корнях и верхушках стеблей. В листьях была выявлена индукция синтеза двух белков (36 кДа с pi 5.55 и 5.7), в верхушках стеблей — трех: 150 кДа (pi 5.3), 45 кДа (pi 5.75), 44а кД (pi 6.8) и в корнях — двух: 64 кДа (pi 6.2) и 52 кДа (pi 5.55). Во время закаливания синтез значительного числа белков замедлялся или ускорялся. Для сравнения были взяты три различающихся по холодоустойчивости сорта пшеницы. Было установлено, что скорость синтеза ряда белков коррелирует с холодоустойчивостью сорта. С одно стороны, индукция синтеза белка с молекулярной массой 200 кДа, а также увеличение скорости синтеза полипептида с молекулярной массой 75 кДа во всех тканях указывает на то, что генетическая регуляция, связанная с повышением морозоустойчивости, происходит на уровне целого растения. С другой стороны, поскольку в природных условиях надземные части растения закаливаются при более низких температурах и развивают более высокую холодоустойчивость, чем корень, индукция в тканях листьев, верхушках стебле и корнях различающихся стрессовых белков указывает на то, что регуляция некоторых генов морозоустойчивости является органоспецифичной. Было установлено, что процессы закаливания не связаны со стадией развития растения, поскольку одинаково закаливаются как этиолированные проростки, так и зеленые растения (Perras, Sarhan, 1989).

Раннее начало синтеза специфичных белков при холодовом шоке было зафиксировано у двух сортов ячменя. Все белки, синтез которых индуцируется гипотермией, были разделены на четыре группы:

• 1) белок с молекулярной массой 75 кДа, появляющийся спустя 6 часов закаливания при 5⁰С;
• 2) белки, синтезирующиеся через 24 часа при температуре 1⁰С;
• 3) белки, присутствующие в «контроле», содержание которых при гипотермии возрастает в несколько раз;
• 4) белки, содержание которых не изменяется (Cattivelli, Bartels, 1989).

При исследовании динамики синтеза стрессовых белков в проростках озимой пшеницы при закаливании к холоду (Войников, Корытов, 1991) были выявлены следующие группы белков:

• 1) белки, появляющиеся уже в течение первых суток закаливания при +3 ⁰С: 150 кДа (pI 6.1), 55 кДа (pI 6.3), 32 кДа (pI 6.3), 30 кДа (pI 4.6), 18 и 20 кДа (pI 3.2) и 15 кДа (pI 5.3);
• 2) белки, появляющиеся в течение 2-3 суток закаливания: 14-20 кДа (pI 3.2­5.3), 27-32 кДа (pI 4.6-9.4), 34-55 кДа (pI 7.9-9.5).

В то же время было отмечено прекращение синтеза ряда белков на четвертые сутки гипотермии (28 кДа (pI 7.8), 29 кДа (pI 9.4), 36 кДа (pI 8.3), 48 кДа (pI 8.3) и 54 кДа (pI 7.9)) и на седьмые сутки (34 кДа (pI 9.5) и 40 кДа (pI 9.2)).

Однако, начиная с четвертых суток закаливания, появлялись белки 41 кДа (pI 8.4), 49 кДа (pI 8.6) и 60 кДа (pI 8.8), синтез которых прекращался к 7­11 суткам закаливания. На основании полученных данных, авторами делается вывод о подразделении этих белков на две большие группы — «стрессовые» белки (с высоким уровнем индукции синтеза), которые синтезируются в первые 2-3 суток гипотермии и исчезают к 7-11 суткам и «белки адаптации» (с низким уровнем индукции синтеза), которые синтезируются при более длительно гипотермии (одиннадцать суток и далее).

Приведенные выше результаты позволяют сделать некоторые заключения. Во-первых, гипотермия вызывает сильное замедление (вплоть до прекращения) синтеза большинства белков, причем, по-видимому, на этот процесс влияют как нарушения в белоксинтезирующем аппарате, так и регуляция активности генома. Во-вторых, действие гипотермии приводит к синтезу de novo (в основном, по-видимому, на 80S рибосомах) ряда новых белков, что связано с усилением транскрипции соответствующих генов.