СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ

Глава 8. Анализ производных терпенов и циклопентанпергидрофенантрена

Гликозиды — эго группа физиологически активных веществ при­родного происхождения, оказывающих специфическое действие на сердечную мышцу, при этом их действие проявляется в весьма ма­лых дозах.

Препараты сердечных гликозидов находят применение для ком­пенсации недостаточности сердечной деятельности, многие из них оказывают и диуретический эффект.

Большинство гликозидов сердечного действия относятся к спис­ку А.

По своему строению гликозиды являются эфирами циклических форм сахаров (циклические ацетали), где сахарная часть и несахарная (агликон) соединены через полуацетальный гидроксил сахарной час­ти. Циклические формы сахаров, как известно, носят название полу­ацетальных форм, гак как они действительно представляют собой внутренние полуацетали, образовавшиеся в результате реакции альде­гидной и спиртовой групп в пределах одной и той же молекулы.

Образовавшийся из альдегидной или кетонной группы гидро­ксил отличается большой реакционной способностью.

Несахарная часть гликозидов называется агликоном; агликоны стероидной природы (в сердечных гликозидах) носят также назва­ние генины.

Сахарная часть может быть моносахаридом, дисахаридом, трисахаридом и т.д.

Гликозиды как циклические ацетали под действием кислот и ферментов легко расщепляются на составные части.

Ферменты (или энзимы) действуют избирательно и позволяют осуществлять ступенчатое отщепление сахаров. Ферменты часто находятся в тех же объектах, что и сами гликозиды, поэтому необ­ходимо соблюдать осторожность при выделении гликозидов из сы­рья.

Сырье сушат при 40—60 °С или помещают в сосуд с парами спирта, хлороформа — это способствует инактивации ферментов, а глико­зиды остаются нерасщепленными.

В отличие от сахаров, гликозиды (за некоторым исключением) не обладают восстановительной активностью, поскольку полуаце­тальный гидроксил блокирован. Исключение составляют гликози­ды с восстановительными группами (альдегидная группа). После разложения можно доказать восстановительные свойства сахаров, например с реактивом Фелинга (свободный сахар).

Строение сердечных гликозидов

Различают естественные гликозиды (первичные, генинные) и вторичные, образовавшиеся из первичных и содержащие на 1 или 2 молекулы сахара меньше, чем первичные.

Установление строения сердечных гликозидов карденолидов сво­дилось к установлению строения агликона.

Агликоны сердечных гликозидов содержат 23 или 24 углеродных атома и различаются между собой по степени окисленности. Они со­держат не менее 2 гидроксильных групп, некоторые — альдегидную труппу. Все агликоны содержат ненасыщенное лактонное кольцо.

Некоторые гликозиды содержат в 10-м положении не метильную ангулярную группу, а альдегидную (гликозиды строфанта, ландыша).

Исходя из многочисленных исследований было установлено, что в основе строения всех сердечных гликозидов лежит ядро цикло­пентанпергидрофенантрена, к которому в 17-м положении присое­диняется ненасыщенное лактонное кольцо с двойной связью с β, α — ­положении, а в 3~м положении через атом кислорода — остаток сахара:

Обязательными элементами проявления кардиотонической актив­ности является, кроме β, α -ненасыщенного ϒ-лактонного кольца при С₁₇, наличие третичной β-ориентированной ОН-труппы при С₁₄ и уг­леводного фрагмента при С₃, а также (в отличие от других природных стероидов), цис-сочленение колец С и D. Агликоны различаются кон­фигурацией и количеством заместителей. Пространственная конфигу­рация определяется сочленением колец А,В,С,D, а также расположе­нием заместителей при С₁₀, С₁₂, С₁₃, С₁₄.

Кроме упомянутого для кардиостероидов цис-сочленения колец С и Г), для них характерно цис- или транс-сочленение колец А и В и транс-сочленение колец В и С.

Сердечные гликозиды по характеру заместителя в 10-м положении можно разделить на 2 группы:

1) подгруппа наперстянки — в положении С₁₀ содержит –СН₃ группу;

2) подгруппа строфанта — в положении С₁₀ содержит альдегид­ную группу.

Вторичные гликозиды наперстянок состоят из агликонов и са­харной части одинаковой у всех 3 вторичных гликозидов.

На основе данных табл. 29 и 30, а также сведений о химическом составе агликонов можно вывести формулы первичных и вторич­ных гликозидов наперстянок.

Формула дигитоксина:

Формула дигиланида С (целанида).

Первичный гликозид наперстянки шерстистой — дигиланид С под названием целанид (Celanidum) и вторичный гликозид напер­стянки пурпурной — дигитоксин (Digitoxinum) включены в ГФ.

В ГФ включен также препарат строфантин К (Strophanthinum К). Его получают из семян строфанта Комбе. Препарат содержит в ос­новном 2 гликозида, состав которых приведен в табл. 31.

К-строфантин-β можно рассматривать как вторичный гликозид К.-строфатозида. Последний, теряя молекулу глюкозы, превраща­ется в К-строфантин-β. Формула К-строфантозида:

Сахарная часть гликозидов

Как отмечалось ранее, сахарный компонент может быть моно- и ди-, и три-сахаридом и т.д. У сахаров различают α и β-формы; D- и L-ряды и оптическую активность (+ или -). D-ряд — это моносаха­риды, у которых конфигурация атомных групп у последнего ассиметрического атома углерода такая же, как у правовращающего — глицеринового альдегида, L-ряд — соответственно как у L-глицеринового альдегида.

α-Форма — это форма сахара, у которого полуацетальный гидро­ксил направлен в ту же сторону, что и гидроксил у последнего ассиметрического атома углерода; в β-форме — они направлены в прогивоположные стороны.

Оптическая активность сахаров зависит от конфигурации атом­ных групп у всех ассиметрических атомов углерода.

Сердечные гликозиды могут содержать:

Дигитоксоза, цимароза и олеандроза являются 2,6-дезоксисахарами. Агликоны сердечных гликозидов практически нерастворимы в воде. Сахарный компонент сам по себе неактивный, способствует улучше­нию растворимости сердечного гликозида, повышает его проницаемость через клеточные мембраны, тем самым усиливая действие агликона.

Методы выделения сердечных гликозидов из растительного сырья

Сердечные гликозиды находятся в растениях в небольших коли­чествах — от 0,001 до 0,2 %.

Растительное сырье экстрагируют эфиром для удаления жиров и смол, а затем — спиртом или смесью спирта и хлороформа. При этом происходит инактивация энзимов, так как они представляют собой вещества белковой природы.

Полученный экстракт выпаривают в вакууме до густой консис­тенции и экстрагируют теплой водой. Сапонины, которые часто сопровождают сердечные гликозиды, осаждают ацетатом свинца, а избыток ацетата свинца удаляют добавлением серной кислоты; при этом образуется нерастворимый сульфат свинца.

При стоянии из водного раствора выпадает смесь неочищенных гликозидов. Для очистки суммы гликозидов, а также выделения каждого из них отдельно применяют методы фракционной крис­таллизации. В последнее время широко используются адсорбцион­ные методы на различных носителях (силикагеле, кизельгеле и др.).

Физические свойства сердечных гликозидов

Сердечные гликозиды — это твердые вещества, кристалличес­кие, плохо растворимы в воде, оптически активные.

Методы идентификации сердечных гликозидов

• Анализ сахаров

Сахара, входящие в состав сердечных гликозидов, дают все цвет­ные реакции, свойственные углеводам: восстанавливают реактив Фелинга, аммиачный раствор нитрата серебра (после гидролиза), образуют окрашенные соединения с ксантгидролом, n-диметиламино-бензальдегидом. Специфическими сахарами сердечных гли­козидов являются 2,6-дезоксисахара, для обнаружения которых применяют тест Келлера—Киллиани. Наиболее распространенным реактивом для открытия сердечных гликозидов по углеводному фрагменту является ксантгидрол (реакция Пезеца).

При нагревании смеси ксантгидрола (дибензо-ϒ-пиранола) с ис­пытуемым гликозидом в присутствии ледяной СН₃СООН и после­дующем прибавлении нескольких капель серной или фосфорной кислоты появляется красное окрашивание.

Аналогичную цветную реакцию дает антрон. Методика основа­на на образовании фурфурола или его производных из сахарных компонентов под действием концентрированной Н₂SО₄. Фурфурол с антроном затем дает продукт конденсации, окрашенный в зеле­ный или сине-зеленый цвет:

• Анализ стероидного цикла

Реакции стероидного цикла основаны на цветных реакциях, про­водящих при взаимодействии с реактивами, вызывающими дегид­ратацию гидроксильных групп (особенно при С₅ и С₁₀) стероидно­го скелета с образованием ангидропроизводных. Обычно эти реак­ции осуществляются в среде концентрированных кислот или под влиянием катализаторов Фриделя—Крафтса. При нагревании до 100°С раствора гликозиды в уксусном ангидриде с 20-25 % раство­ром треххлористой сурьмы появляется лиловое окрашивание.

Тест Либермана—Бурхарда. Раствор испытуемого вещества в ук­сусной кислоте смешивают с 2 мл смеси, состоящей из 50 частей уксусного ангидрида и 1 части концентрированной Н₂SО₄; при этом развивается розовое окрашивание, постепенно переходящее в зеле­ное или синее. Окраска определяется строением генина: строфан­тин и его гликозиды в этих условиях окрашиваются в оливково­зеленый цвет, переходящий в желтый.

Для сердечных гликозидов характерно явление галохромии: об­разование окрашенных соединений с концентрированными мине­ральными кислотами; наибольшее распространение получили цвет­ные реакции с серной кислотой.

Тест Рейхштейна. Несколько кристаллов гликозида смачивают 2 каплями 84 % Н₂SО₄ и отмечают изменение окраски во времени. Лабильность окраски специфична и используется для первичной идентификации сердечных гликозидов. Для идентификации карденолидов также используется их способность флюоресцировать в УФ- свете в виде пятен различной окраски при взаимодействии, напри­мер с фосфорной кислотой.

• Реакции на β,α-ненасыщенное лактонное кольцо

К этой группе относятся реакции, в результате которых при вза­имодействии сердечного гликозида с некоторыми полинитропро­изводными в щелочной среде образуется окрашивание.

• Сердечные гликозиды в присутствии щелочи дают с пикриновой кислотой (тринитрофенолом) оранжевую окраску (реакция Балье):

• Пятичленный лактонный цикл можно также обнаружить по обра­зованию окрашенных в красно-фиолетовый цвет продуктов взаимо­действия в щелочной среде с м-динитробензолом (реакция Раймонда).

Несовместимость сердечных гликозидов

1. Карденолиды несовместимы с кислотами и соединениями, ко­торые дают кислую реакцию среды. В данном случае происходит гид­ролиз по гликозидной связи (отщепление сахаров). Реакция проходит без видимых внешних изменений (с аскорбиновой кислотой и други­ми витаминами кислой реакции среды).
2. Сердечные гликозиды несовместимы со щелочами и соедине­ниями, которые дают щелочную реакцию среды NaНСО₃, барби­тал-натрия и др.).

В щелочной среде не происходит гидролиза гликозидной связи, а идет алломеризация с образованием неактивного гликозила (рас­щепляется лактонное кольцо).

На 1-й стадии происходит расщепление β,α-ненасыщенного лак­тонного кольца с образованием соответствующей оксикислоты:

Затем происходит образование полуацеталя:

Далее γ-кислота способна образовывать внутренний сложный эфир (лактон), что приводит к созданию новой циклической системы (лак­тонизация). Образовавшийся неактивный изоагликон имеет УФ- спектр, который резко отличается от такового нативного гликозида (возможность оценки чистоты методом УФ-спектрометрии).

1. Соли тяжелых металлов осаждают сердечные гликозиды из растворов.
2. Гликозиды несовместимы с дубильными веществами (отвар толокнянки и др.), препаратами валерианы (уменьшение фармако­логической активности сердечных гликозидов), производными бар­битуровой кислоты (уменьшение амплитуды сердечных сокраще­ний), с диуретиками (усиление действия сердечных гликозидов, гипокалиемия).
3. Карденолиды разлагаются при нагревании.

Методы количественного определения кардиоактивных стероидов

Кардиоактивные стероиды являются терапевтически важной груп­пой веществ. Для понимания роли этих соединений в жизни расте­ний проводились исследования их метаболизма в живом организ­ме. Результаты данных исследований позволили успешно применять указанные стероиды в медицине (налажен промышленный выпуск сердечных гликозидов). Однако для безопасного использования этих веществ необходимо проводить стандартизацию не только самих ЛС, но и природных источников всевозможными методами коли­чественного oпределения.

До настоящего времени количественная оценка кардиоактивных стероидов проводится в основном с помощью биологических тес­тов на животных. Биологические методы трудоемки, длительны, плохо воспроизводимы, малодостоверны (ошибки в пределах 10— 20%).Результаты биологического анализа зависят от индивидуаль­ных особенностей животных и не позволяют получить объектив­ную качественную и количественную информацию о действующем веществе.

Стандартизация сердечных гликозидов с помощью биологичес­кого метода основана на способности карденолидов вызывать в токсических дозах остановку сердца животных в стадию систолы. Их активность оценивают по сравнению с активностью стандарт­ных препаратов и выражают в единицах действия (ЕД) — кошачих (КЕД), лягушачих (ЛЕД), голубиных (ГЕД).

Известно значительное число методов, в основе которых лежит титриметрическое, фотометрическое, флюориметрическое и поля­рографическое определение кардиостероидов.

Химические методы

Кислотно-основное титрование в неводной среде (подгруппа строфанта).

И.А. Казаринов и Н.П, Дзюба предложили объемный метод, ос­нованный на способности альдегидной группы при С₁₀ (агликон строфант идина) образовывать оксим при взаимодействии с гидро­ксиламином в среде диэтиламина. Диэтиламин связывает соляную кислоту, образующуюся при оксимировании; избыток оттитровывают хлорной кислотой. Ошибка метода составляет 0,7—2,6%. Не­смотря на то, что метод быстр в исполнении, он не получил рас­пространения, так как пригоден только для анализа стандартных образцов и требует тщательной очистки реактивов от соединений, содержащих карбонильные группы.

Физико-химические методы

1. УФ-спектрофотометрический (используется при анализе сырья и стандартного вещества при 217—219 нм).
2. Фотометрический метод:
3. целанид — с ксантгидроловым реактивом;
4. реактив Татье — 2,4-дииитрофенилсульфон — рекомендуется для анализа сырья, лекарственных веществ и лекарственных пре­паратов (ГФ XI) (реакция на пятичленное лактонное кольцо).
5. Хроматографические методы (ВЭЖХ, ГЖХ).
6. Флюориметрические методы анализа.

Основаны на способности сердечных гликозидов флюоресциро­вать под действием сильных кислот и окислительных агентов после кратковременного облучения УФ-светом.

Под действием сильных кислот или окислительных агентов про­исходит дегидратация гликозидов с образованием ангидропроиз­водных.

Так, при действии на гитоксин фосфорной кислоты образуется диангидрогитоксин, который под влиянием УФ-света флюоресци­рует. При этом интенсивность флюоресценции пропорциональна концентрации гликозида, что позволяет проводить количественную оценку. Необходимо сопоставление химических и физико-хими­ческих методов с результатами биологических методов.

Испытание на чистоту

Чистота характеризуется различными физико-химическими па­раметрами (удельное вращение, ПК- и УФ-спектры, Т_пл). Кроме того, регламентируется содержание влаги (способствует гидролизу полуацетальной связи), сульфатной золы и тяжелых металлов (фак­торы, катализирующие окисление препаратов). Для оценки добро­качественности инъекционных растворов дополнительно оценива­ют их прозрачность и цветность.

Особое внимание обращают на наличие примесей посторонних гликозидов. Это относится прежде всего к ЛС, полученным из рас­тений, содержащих несколько сходных по структуре сердечных гли­козидов. Примесь посторонних стероидов обнаруживают с помощью бумажной хроматографии по величине R_f и флюоресценции пятен.

Хранение

Список А. В хорошо укупоренных банках оранжевого стекла, в сухом, защищенном от света месте.