Принципы организации липидного бислоя

Биомембранология Болдырев А.А., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В.А.

• Фосфолипиды как структурная основа бислоя
• Трансмембранная асимметрия липидов
• Различные виды подвижности компонентов липидного бислоя
• Дефектные зоны. Роль холестерина
• Микровязкость мембран
• Фазовые переходы мембранных липидов
• Биологические функции мембранных липидов

ТРАНСМЕМБРАННАЯ АСИММЕТРИЯ ЛИПИДОВ

Клеточные мембраны замкнуты, они имеют внутреннюю и внешнюю поверхности, различающиеся по липидному и белковому составу – эту особенность мембран называют трансмембранной асимметрией. Характерная особенность биологических мембран – различный состав липидов по обе стороны бислоя. Известно несколько механизмов, обеспечивающих асимметричное распределение фосфолипидов в мембране. Один из них связан с термодинамической вероятностью распределения липидов в соответствии со стереоконфигурацией их молекул. Асимметрия липидов возникает, прежде всего, потому, что в случае замкнутого мембранного бислоя липиды с более объемными полярными «головками» стремятся находиться в наружном монослое, так как там площадь поверхности, приходящаяся на полярную «головку», больше. По этой причине фосфатидилхолины и сфингомиелины локализованы преимущественно в наружном монослое, а фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин, в основном, во внутреннем. Это, соответственно, приводит к различиям в заряде фосфолипидов и различной гидратации их полярных «голов» по обе стороны бислоя.

Второй механизм реализуется за счет различий в составе среды по обе стороны бислоя в условиях нативной клетки. С внеклеточной стороны мембрану омывает среда с высоким содержанием натрия и кальция, а со стороны цитоплазмы мембрана контактирует с магнием и калием. Различия ионного состава вне- и внутриклеточной среды вносят вклад в создание и поддержание изгибов, то есть в асимметрию бислоя. Именно этот фактор обеспечивает создание градиента кривизны, складок, сморщиваний, отшнуровку частей биологической мембраны в виде везикул.

РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ ПОДВИЖНОСТИ КОМПОНЕНТОВ ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ Молекулам в изотропной жидкости присущи разные виды подвижности: вибрационные колебания, вращение, трансляционные движения. В анизотропном бислое, напротив, молекулярная подвижность его компонент упорядочена. Различные типы подвижности проиллюстрированы на рис. 17.

Молекулы фосфолипидов способны к нескольким видам подвижности в бислое:

• изменение ориентации полярных голов
• латеральное движение,
• колебания ацильных цепей,
• образование кинков и их перемещение вдоль ацильных цепей (в поперечном направлении),
• ротационная подвижность (вращение вокруг длинной оси),
• переход с одной стороны бислоя на другую (по типу флипфлоп),
• выход из бислоя.

Рассмотрим некоторые виды подвижности молекул фосфолипидов подробнее. Латеральное движение. Способность липидов перемещаться в мембране в латеральном (продольном) направлении показана многими экспериментами. Например, для суспензии яичного лецитина при 25ºС молекула преодолевает путь, равный 2,5 мкм за 1 сек. Таким образом, латеральная диффузия в упорядоченной мембране позволяет веществам перемещаться с относительно высокой скоростью. Она делает возможным образование липидных кластеров. Латеральная диффузия оказывается возможной даже при температуре кристаллического состояния. По-видимому, единственный механизм, который мог бы удовлетворительно объяснить этот факт, заключается в латеральной неоднородности мембраны, наличии дефектных зон (пустот), куда могут вытесняться молекулы из соседних упорядоченных областей.

Упорядоченность мембран, измеряемая с помощью ЭПР спектроскопии, снижается при движении к метильному радикалу ацильной цепи, что свидетельствует об увеличении подвижности жирнокислотных цепей в этом направлении. Различные конфигурации молекул жирных кислот, возникающие при поворотах (вращении) вокруг единичной С-С связи, называют ротамерами, или конформерами, а изменение конформации молекулы за счет таких поворотов носит название транс-гош изомеризации.

Рис. 17. Виды подвижности липидных компонентов в бислое I – изменение ориентации полярных голов, II – быстрая латеральная диффузия в двумерном пространстве бислоя, III – быстрые колебания жирнокислотных цепей, IV – образование кинков и их продвижение по ацильным цепям, V – вращательная подвижность вокруг длинной оси, VI – медленный обмен между компонентами монослоев мембраны.

Вращательная подвижность молекул фосфолипидов, измеренная методом ЯМР, показала, что подвижность гидрофобных сегментов цепи повышается в направлении от сложноэфирной связи к метильной группе, т.е. к центру бислоя.

Трансмембранный переход «флип-флоп» типа. В липидных искусственных мембранах такие переходы осуществляются весьма медленно, например, полупериод перехода молекул холестерина с одной стороны бислоя на другую в липосомах из фосфатидилхолина занимает более 24 часов, однако, в принципе, такой переход возможен. Молекулы липидов не могут преодолеть липидный бислой в поперечном направлении путем перескока молекул с одной стороны бислоя на другую (флип-флоп), если в молекуле нет особых ферментов, известных под названием транслокаторов.

Липиды и в биологических мембранах с довольно большой частотой мигрируют с одной стороны мембраны на другую, то есть совершают «флипфлоп» переходы. Возможно, что гетерогенность липидного состава биологических мембран увеличивает вероятность «флип-флоп» перехода в природных мембранах. Одним из результатов этой гетерогенности является возможность образования гексагональной фазы (вывернутых везикул), кратковременное существование которых позволяет вовлекать молекулы липидов с одной стороны бислоя, а возвращать их на другую.

Следовательно, динамическое состояние бислоя с высокой подвижностью его компонентов определяется одновременно несколькими факторами. С одной стороны, это вращательная подвижность отдельных молекул фосфолипидов. Вблизи метильного конца она осуществляется для каждой молекулы независимо, но с приближением к полярной «голове» и возрастанием плотности упаковки (особенно начиная с 9 углеродного атома, ближе которого к поверхности бислоя не встречается цис-двойных связей) подвижность уменьшается.

ДЕФЕКТНЫЕ ЗОНЫ. РОЛЬ ХОЛЕСТЕРИНА

Различные виды подвижности липидных компонентов в бислое нарушают гомогенную упаковку и приводят к образованию различных дефектов. Высокая скорость вращения жирнокислотных радикалов вокруг С-С-связей, а также наличие в мембране в со46 ставе фосфолипидов цис-изомеров ненасыщенных жирных кислот делают бислой достаточно рыхлым. Образование дефектов такого рода демонстрирует рис. 18.

 

Рассмотрим сначала насыщенные углеводородные цепи. Наиболее стабильна транс-конформация (I), в которой цепь максимально вытянута и не меняет своего направления, тогда как в гош-конформации ее направление меняется (II) и образуется дефект упаковки. Последовательность гош-транс-гош для трех смежных С-С связей приводит к появлению в цепи излома (кинка), в результате чего участки цепи выше и ниже цепи излома оказываются значительно смещенными друг относительно друга (III) – образуется дефект. Возможность образования таких структур обеспечивает возникновение подвижных дефектов, способных захватывать целые блоки мембраны – кластеры. Их концентрация и подвижность зависит от температуры.

В случае ненасыщенных жирных кислот почти все двойные связи в мембранных липидах находятся в цис-форме. Как и в случае гош-формы, это приводит к изменению общего направления цепи – образуется дефект (рис. 19). Такие пространственные дефекты бислоя, индуцируемые включением в него ненасыщеных жирных кислот, являются более стабильными. В результате появления дефектов бислой становится более рыхлым.

 

Указаны толщина бислоя в ангстремах и площадь сечения, занимаемая каждой молекулой фосфолипида. Рассмотрим вызванное дефектами изменение геометрии бислоя. Растянутая углеводородная цепь жирной кислоты, содержащая 18 углеродных атомов, имеет длину примерно 23– 24 Å, что возможно в случае геля, то есть в случае высокоструктурированного (упорядоченного) состояния липидов. По этой причине можно было бы предположить, что бислой, составленный из фосфолипидов, жирные кислоты которых содержат 18–20 углеродных радикалов, должен иметь толщину более 47 Å. Однако реальная толщина мембраны редко превышает это значение (она составляет на 15–20% меньшую величину). Это указывает, что жирнокислотные радикалы бислоя не распрямлены полностью, а образуют рыхлые структуры. Из-за этого факта площадь мембраны оказывается несколько большей, чем следует из расчета теоретического пространства, приходящегося на одну молекулу фосфолипида. Встраивание холестерина в бислой делает возможным изменение формы мембран в результате значительной деформации обеих сторон липидного бислоя, так как в отличие от фосфолипидов холестерин может легко перемещаться из одного монослоя в другой. При таких воздействиях и толщина бислоя несколько возрастает.

Наличие в углеводородных цепях кинков, двойных связей (и других особенностей) приводит к увеличению площади поперечного сечения цепи (минимальное ее значение составляет около 19Å 2) при полностью транс-конфигурации; это может иметь важные последствия для упаковки липидов в бислое. В жидкокристаллической фазе появление в цепи гош-конформеров увеличивает эффективное поперечное сечение цепей по меньшей мере до 50Å 2. Толщина бислоя уменьшается за счет наличия в цепях гош-конформеров, приводящих к разупорядочиванию цепей, причем сами цепи в целом растянуты и расположены перпендикулярно поверхности бислоя.

В фазе геля насыщенные углеводородные цепи фосфолипидов находятся преимущественно в полностью транс-конформации. Минимальная площадь поперечного сечения молекулы диацильного фосфолипида равна около 38Å 2. Примерно такую же площадь занимает полярная головка фосфатидилэтаноламина, поэтому насыщенные фосфатидилэтаноламины в фазе геля упаковываются так, что их ацильные цепи располагаются перпендикулярно плоскости бислоя (как в липидных кристаллах).

На рисунках и схемах цепи фосфолипидов в бислое, как правило, представляют скошенными относительно перпендикулярной оси мембран. Угол наклона цепей определяется природой полярной головы молекулы: наклон возникает в том случае, если объем гидратированной головы молекулы больше площади сечения ее хвостовой части. Например, в случае кристаллов фосфатидилхолина минимальная площадь, приходящаяся на одну полярную головку, составляет примерно 50Å 2. Поэтому дипальмитоилфосфатидилхолин (38Å2) в фазе геля не может упаковываться так, как фосфатидилэтаноламин. В этом случае ацильные цепи дипальмитоилфосфатидилхолина отклоняются на 30о от нормали к бислою, благодаря чему их поперечное сечение увеличивается и достигается соответствие размеру полярной головки. При этом углеводородные цепи сохраняют полностью транс-конформацию. В случае, когда эти величины равны (например, для фосфатидилэтаноламина), скоса практически не наблюдается. Наличие перечисленных особенностей обеспечивает определенную рыхлость упаковки (микровязкость) мембранного бислоя при нормальных условиях.

МИКРОВЯЗКОСТЬ МЕМБРАН

Для мембран характерна высокая степень текучести бислоя, обеспечивающая способность липидов и белков к латеральной диффузии. Повышенная плотность упаковки (структуризация) бислоя увеличивает сопротивление диффузии молекул, транспортируемых через мембрану, повышает ее микровязкость. Так что скорость перемещения молекул зависит от микровязкости мембран, которая, в свою очередь, определяется относительным содержанием насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в составе липидов. Микровязкость мембран меньше, если в составе липидов преобладают ненасыщенные жирные кислоты, и больше при высоком содержании насыщенных жирных кислот. На этот параметр влияют также размеры углеводородных «хвостов» липидов, с увеличением длины которых микровязкость бислоя уменьшается.

ФАЗОВЫЕ ПЕРЕХОДЫ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ

В водной среде различные структуры (рис. 20), образуемые фосфолипидами (ламеллярные, мицеллярные, гексагональные) ведут себя как жидкие кристаллы, то есть анизотропные жидкости, обладающие признаками упорядоченности. Таким структурам присущи лиотропный мезоморфизм (зависимость структуры от гидратации) и термотропный мезоморфизм (зависимость структуры от температуры). Представления о лиотропном и термотропном мезоморфизме как свойствах мембран связаны между собой. Фазовые переходы липидов, осуществляющиеся по типу «гель – жидкий кристалл», происходят при температуре (Ткр), величина которой зависит от содержания воды в системе. Ткр достигает минимума, как только общее содержание воды превышает то количество, которое могут связывать липидные структуры.

 

Фазовая диаграмма для яичного лецитина, характеризующая соотношение различных мезоформ этого липида в разных условиях представлена на рис. 21. Примером того, как существенно влияет вода на фазовые переходы, является модификация фазового сос-тояния мембраны под влиянием перекисного окисления липидов (ПОЛ), когда Ткр снижается. Это явление объясняется увеличением содержания воды в бислое. Почему это происходит? Гидратация бислоя зависит от присутствия заряженных фосфолпидов, наиболее сильно она возрастает при индукции ПОЛ.

Рис. 21. Фазовая диаграмма смеси яичного лецитина с водой I – жидкокристаллическое состояние, бислой; II – двуфазная система: вода-бислойные структуры; III – область сосуществования ламеллярных и гексагональных структур; IV – гель. Ткр – кривая температуры фазового перехода.

Образующиеся в качестве промежуточных продуктов гидроперекиси являются высоко гидрофильными, они эффективно разрушают бислой, увеличивая доступность гидрофобных доменов мембраны для молекул воды. Именно по этим причинам ПОЛ имеет такое «разрушительное» влияние на мембранные структуры. В момент фазового перехода бислоя происходит несколько одновременных событий: возрастает подвижность полярных -N + -(CH3)3 групп; увеличивается вращательная подвижность С-С связей, что приводит к облегчению транс-гош перехода и образованию кинков; увеличивается скорость латеральной диффузии молекул (рис. 22). Следствием этого являются два важных обстоятельства: изменение геометрических размеров бислоя, которое объясняется латеральным расширением площади, занимаемой каждой молекулой фосфолипидов, увеличением гидрофобного объема мембраны.

Из-за неодновременности проявления этих свойств в ходе фазовых перестроек бислоя более упорядоченные области мембраны сосуществуют с уже расплавленными – наблюдается фазовое разделение (рис. 23).

В этих условиях для мембраны характерно существование разного рода дефектов, индуцирующих взаимодействие белковых молекул друг с другом, встраивание в бислой соединений, повышение проницаемости для ионов и т. д.

Фазовые переходы, индуцируемые температурой, – объективная характеристика бислоя, состоящего из одного или нескольких (не больше 2–3 компонентов). В случае гетерогенных систем методы регистрации дают результаты, не поддающиеся однозначной интерпретации. Фазовые переходы в мембране индуцируются не только изменениями температуры. Они могут быть вызваны сдвигом pH среды, электрическим потенциалом, двухвалентными катионами, способствующими образованию кластеров определенных фосфолипидов и разделению фаз; фазовые переходы также сопровождают действие гормонов на биологические мембраны. Таким образом, исследование термотропных переходов имеет не только теоретическое значение: аналогичные переходы осуществляются в биологических системах при подготовке животных к гибернации или выходе из зимней спячки, при термоадаптациях, адаптации мигрирующих рыб к морской воде и т. д.

Кроме перехода типа «гель – жидкий кристалл» липиды могут претерпевать превращения другого рода, приводящие к образованию гексагональной фазы Н II (рис. 20). Эти небислойные структуры легко образуют короткоцепочечные фосфолипиды с полярными головами (например, фосфатидилсерин, фосфатидная кислота). Образованию гексагональных структур способствуют такие явления как повышение температуры, увеличение ненасыщенности жирнокислотных цепей, высокая ионная сила при щелочном рН, а также понижение гидратации бислоя. Переход отдельных участков бислоя в фазу Н II приводит к нарушению целостности мембраны, формированию каналов проницаемости, образованию дефектных зон.

В искусственных мембранах были зарегистрированы переходы такого рода. В нативных мембранах, вероятно, они также могут образовываться. Для мембран хлоропластов переходам бислоя в гексагональную Н II –фазу приписывается важная регуляторная роль. Предполагают, что в мембранах саркоплазматического ретикулума мышц такие переходы могут индуцироваться в результате ферментативного обмена жирнокислотными цепями между длинноцепочечными фосфатидилсерином и короткоцепочечным фосфатидилхолином.

В мембранах эубактерий обнаруживается большое количество липида, склонного к образованию гексагональных структур – плазменилэтаноамина. Превращение его в глицероацетальплазмалоген препятствует образованию фазы Н II . Обратная реакция, выражающаяся в увеличении ненасыщенности мембранных компонентов и «разрыхлении» ее структуры, индуцирует образование гексагональной фазы в мембране. Как уже упоминалось, гексагональная фаза может облегчать флипфлоп переходы липидных молекул.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ

Микровязкость и фазовые переходы липидов определяют функциональную динамичность мембраны. Совершенно очевидно, что липидный состав различных мембран не является случайным, однако удовлетворительного объяснения этому феномену не найдено. Клеточная мембрана может содержать более 100 разных типов липидных молекул. Почему их так много и почему каждая мембрана имеет уникальный липидный состав, пока неясно. Но становится все более очевидным, что липиды активно участвуют в процессах, протекающих в мембранах. Рассмотрим некоторые факторы, возможно, предопределяющие липидный состав мембраны.

• 1. Смесь липидов обязательно должна быть способна образовать стабильный бислой, в котором могли бы функционировать белки.
• 2. Некоторые липиды способствуют стабилизации сильно искривленных участков мембраны, образованию контакта между мембранами или связыванию определенных белков, поскольку форма этих молекул благоприятствует нужной упаковке бислоя на соответствующих участках мембраны.
• 3. Некоторые липиды являются важными биорегуляторами. Наиболее изучена в этом отношении регуляторная роль производных фосфатидилинозитола в плазматических мембранах клеток эукариот. Некоторые мембранные липиды являются предшественниками вторичных посредников при передаче гормонального сигнала. Так, фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (ФИФ2) под действием фермента фосфолипизы С гидролизуется до диацилглицерола, ДАГ, активатора протеинкиназы С, и инозитол-1,4,5-трисфосфата (ИФ 3 ) – регулятора кальциевого обмена в клетке (см. раздел 8). ДАГ, ИФ 3 , протеинкиназа С и Са 2+ – участники фосфоинозитольной системы передачи сигнала, причем два первых образуются из мембранных компонентов, третий являетcя мембраносвязанным белком, а последний (кальций) – является ионом, проникающим через специальные каналы на клеточной мембране и запускающим этот процесс.
• 4. Некоторые липиды участвуют в реакциях биосинтеза. Например, в клетках E. сoli фосфатидилглицерол поставляет глицерофосфатный фрагмент при биосинтезе периплазматических олигосахаридов.
• 5. Отдельные липиды необходимы для поддержания оптимальной активности ряда ферментов. Они формируют среду для функционирования мембранных белков, способных принимать нативную конформацию лишь в гидрофобном окружении. Выделенные из мембран ферменты, лишенные липидного окружения, как правило, не проявляют каталитической активности, или изменяют ее при изменении гидрофобности среды. Такова, например, митохондриальная креатинкиназа, фермент, катализирующий образование креатинфосфата. Для проявления ее нормальной активности требуется взаимодействие с кардиолипином внутренней мембраны митохондрий.
• 6. Ганглиозиды (гликолипиды), как полагают, играют важную роль в регуляции роста клеток, являются специфическими рецепторами в плазматической мембране и ответственны за клеточную адгезию.
• 7. Кроме того, некоторые липиды выполняют «якорную» функцию, например, к молекуле фосфатидилинозитола через олигосахарид могут присоединяться специфические белки наружной поверхности клетки – образуется фосфатидилинозитолгликан. Пример такого заякоренного белка – ацетилхолинэстераза, катализирующая гидролиз ацетилхолина в синаптической щели. Этот фермент фиксируется на постсинаптической мембране, ковалентно присоединяясь к фосфатидилинозитолгликану. При участии фосфолипазы С (гидролизующей мембранные липиды) может происходить модификация мембраны и отделение белков от внешней поверхности клетки.
• 8. Липиды могут быть аллостерическими активаторами мембранных ферментов. Фермент протеинкиназа С катализирует реакции фосфорилирования белков. В неактивной форме протеинкиназа С находится в цитозоле. Однако после стимуляции клетки (повышении в клетке концентрации кальция) фермент быстро активируется ионами кальция и оказывается связанным с мембраной. 56 Функционально активная протеинкиназа С – комплекс, содержащий мономер фермента, молекулу диацилглицерола, один или более ионов кальция и четыре молекулы фосфатидилсерина.

Экспериментально было показано, что организмы часто могут выдерживать, причем без всяких последствий, существенные изменения липидного состава мембран. Например, с помощью генетической трансформации можно получить жизнеспособный штамм E. coli, в мембранах которых содержится до 34% фосфатидной кислоты, обычно отсутствующей в штаммах дикого типа. Очевидно, тот липидный состав, который характерен для штаммов дикого типа, не является обязательным для выживания клеток, по крайней мере, в условиях их выращивания в лаборатории.