3.7. Определение биомолекул
Биология — Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. 1 том — 2013
В этом разделе мы опишем некоторые простые опыты, с помощью которых можно определять различные вещества, играющие в клетках важную биологическую роль. Существуют и более сложные методы идентификации и разделения клеточных компонентов. Первое место среди них занимают хроматография и электрофорез; их мы рассмотрим в приложении (т. 3).
Желательно сначала освоить методику анализов, работая с чистыми образцами веществ, подлежащих определению. Овладев методикой и научившись различать соответствующие изменения окраски, можно затем приступить к исследованию различных тканей.
Опыт 3.1. Определение биомолекул в чистом виде
ВНИМАНИЕ! При всех описанных здесь анализах нагревание следует проводить на водяной бане при температуре кипения воды. Прямое нагревание пробирок на огне недопустимо.
Материалы и оборудование
- Лакмусовая бумага
- Пробирки
- Штатив для пробирок
- Бунзеновская горелка
- Пипетки
- Шпатель
- Шприц (1 мл)
- Раствор иода в иодистом калии
- Реактив Бенедикта
- Разбавленная серная кислота
- Гидрокабронат натрия (питьевая сода)
- Судан III
- Реактив Миллона
- Реактив Фелинга
- 5%-ный раствор гидроксида калия
- 1%-ный раствор сульфата меди
- Раствор дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ)
- 1%-ный раствор крахмала (желательно из кукурузной муки)
- 1%-ный раствор глюкозы
- 1%-ный раствор сахарозы (следует использовать химически чистую сахарозу, не содержащую примеси какого-либо редуцирующего сахара)
- Оливковое или кукурузное масло
- Абсолютный спирт
- Яичный альбумин
- 1%-ный раствор лактозы
- 1%-ный раствор фруктозы
Углеводы
РЕДУЦИРУЮЩИЕ САХАРА. К редуцирующим сахарам относятся все моносахариды, например глюкоза и фруктоза, и некоторые дисахариды, например мальтоза. Среди наиболее распространенных сахаров единственный нередуцирующий сахар — это сахароза (дисахарид). Используйте для анализа 0,1—1%-ные растворы сахарозы.
| Процедура | Наблюдаемый результат | Объяснение |
| Реакция Бенедикта
Влить в пробирку 2 мл раствора редуцирующего сахара. Добавить равное количество раствора Бенедикта. Встряхнуть и осторожно довести до кипения, продолжая непрерывно встряхивать, чтобы жидкость не выбросило из пробирки |
Синяя окраска раствора сменяется зеленой, а затем желтоватой; в конце выпадает кирпично-красный осадок | Раствор Бенедикта содержит сульфат меди. Редуцирующие сахара восстанавливают растворимый синий сульфат меди, содержащий ионы меди(II) [Cu 2+ ], до нерастворимого кирпично-красного осадка оксида меди(I). Оксид меди выпадает в осадок |
ПРИМЕЧАНИЕ. Реакция полуколичественная, иначе говоря, она позволяет лишь грубо оценить количество редуцирующего сахара, присутствующего во взятой пробе. Окраска осадка переходит от зеленой к желтой, оранжевой и кирпично-красной с увеличением количества редуцирующего сахара. (Зеленый цвет — это результат смешения появившегося желтого осадка с синим раствором сульфата меди.)
| Процедура | Наблюдаемый результат | Объяснение |
| Реакция Фелинга
Влить в пробирку 2 мл раствора редуцирующего сахара. Добавить 1 мл реактива Фелинга А и 1 мл реактива Фелинга В. Встряхивая, довести до кипения |
Начальная синяя окраска смеси переходит в зеленую, затем в желтую, после чего выпадает кирпично-красный осадок | То же, что и для реакции Бенедикта |
ПРИМЕЧАНИЕ. Реакция Фелинга не столь удобна, как реакция Бенедикта, потому что реактивы А и В приходится до анализа хранить отдельно. Чувствительность ее также ниже.
НЕРЕДУЦИРУЮЩИЕ САХАРА. Наиболее распространенный из нередуцирующих сахаров — это сахароза, относящаяся к дисахаридам. Если известно, что редуцирующие сахара в исследуемом растворе отсутствуют (т. е. если предыдущая реакция дала для этого раствора отрицательный результат), то появление кирпично-красного осадка в реакции, описанной ниже, свидетельствует о присутствии какого-то нередуцирующего сахара. Если же было доказано, что в исследуемом растворе содержатся редуцирующие сахара, то в описанной ниже реакции будет получен более обильный осадок, нежели в предыдущей реакции.
| Процедура | Наблюдаемый результат | Объяснение |
| Влить в пробирку 2 мл раствора сахарозы. Добавить 1 мл разбавленной соляной кислоты.
Кипятить в течение 1 мин. Осторожно нейтрализовать гидрокарбонатом натрия, проверяя лакмусовой бумажкой (осторожность требуется потому, что жидкость вскипает). Провести реакцию Бенедикта |
Как в реакции Бенедикта | При кипячении с разбавленной соляной кислотой дисахарид гидролизуется до моносахаридных единиц. Сахароза расщепляется на глюкозу и фруктозу. Обе они представляют собой редуцирующие сахара и в реакции Бенедикта дают соответствующие результаты |
КРАХМАЛ. Растворим в воде очень слабо, образует в ней коллоидные суспензии. Анализ можно проводить как с суспензией, так и с сухим крахмалом.
| Процедура | Наблюдаемый результат | Объяснение |
| Иодная реакция
Влить в пробирку 2 мл 1%-ного раствора крахмала. Добавить несколько капель раствора I 2 /KI Второй вариант: нанести раствор на сухой крахмал |
Под действием раствора I2 /KI крахмал окрашивается в темно-синий цвет | Образуется полииодидный комплекс с крахмалом |
ЦЕЛЛЮЛОЗА И ЛИГНИН. См. приложение А2 (окрашивание) в т. 3.
Липиды
К липидам относятся масла (например, кукурузное и оливковое), жиры и воска.
| Процедура | Наблюдаемый результат | Объяснение |
| Проба с суданом III
Судан III — красный краситель. Добавить 2 мл масла к 2 мл воды, налитой в пробирку. Добавить несколько капель судана III и встряхнуть |
Окрасившийся в красный цвет слой масла располагается поверх воды. Вода остается неокрашенной | Жировые глобулы окрашиваются в красный цвет и всплывают, потому что их плотность ниже плотности воды |
| Эмульсионная проба
Добавить 2 мл жира или масла в пробирку, содержащую 2 мл абсолютного спирта. Сильно встряхнуть для растворения липида. Добавить равное количество холодной воды |
Образуется мутная белая суспензия | Липиды с водой не смешиваются. При добавлении воды к спиртовому раствору липида образуется эмульсия; мельчайшие липидные капельки, взвешенные в воде, отражают свет, вследствие чего эмульсия кажется белой и опалесцирует |
| Проба с жировым пятном
Нанести каплю исследуемого образца на бумагу. Выждать некоторое время, чтобы дать испариться воде, которая могла туда попасть. Можно слегка прогреть бумагу — это ускорит процесс |
На бумаге останется прозрачное пятно |
Белки
Для этих анализов очень подходит альбумин куриного яйца
| Процедура | Наблюдаемый результат | Объяснение |
| Реакция Миллона
Влить 2 мл раствора или суспензии белка в пробирку. Добавить 1 мл реактива Миллона и вскипятить. ВНИМАНИЕ! Реактив Миллона ядовит — будьте осторожны! |
Выпадает белый осадок, который при кипячении коагулирует и окрашивается в красный или оранжево-розовый цвет | Реактив Миллона — это раствор ртути(II) в азотной кислоте, содержащей примесь азотистой кислоты. Аминокислота тирозин содержит фенильную группу, реакция которой с реактивом Миллона приводит к образованию красного комплекса ртути(II). Это неспецифическая реакция, характерная для всех фенолов. Белок при нагревании обычно коагулирует, т. е. дает плотный осадок. Из всех белков, используемых для такого анализа, не содержит тирозина один только желатин |
| Биуретовая реакция
Влить в пробирку 2 мл раствора белка. Добавить равный объем 5%-ного гидроксида калия и перемешать. Добавить 2 капли 1%-ного раствора сульфата меди и перемешать. Нагревания не требуется |
Медленно появляется розовато-фиолетовая или пурпурная окраска | Это реакция на соединения, содержащие пептидные связи. В присутствии разбавленного раствора сульфата меди в щелочной среде атомы азота пептидной цепи образуют окрашенный в пурпурный цвет комплекс с ионами меди(II) [Cu 2+ ]. Биурет (производное мочевины) тоже содержит группу —CONH— и поэтому дает такую реакцию |
Витамин С (аскорбиновая кислота)
Данный метод можно при необходимости использовать для количественного определения. В этом случае указанные объемы следует отмерять очень точно. Подходящим источником витамина С может служить свежий апельсиновый или лимонный сок в смеси с дистиллированной водой (1:1). Можно использовать также имеющиеся в продаже таблетки витамина С.
| Процедура | Наблюдаемый результат | Объяснение |
| Стандартом служит 0,1%-ный раствор аскорбиновой кислоты. Влить 1 мл ДХФИФ в пробирку. Набрать в шприц на 1 мл 0,1%ный раствор аскорбиновой кислоты. Добавить аскорбиновую кислоту к ДХФИФ по каплям, слегка помешивая иглой шприца. (Не встряхивать. Встряхивание раствора может привести к окислению аскорбиновой кислоты кислородом воздуха. Можно проверить самому, как отразится на результатах опыта встряхивание и кипячение) Продолжить это до тех пор, пока синий раствор ДХФИФ не обесцветится. Отметить израсходованный объем аскорбиновой кислоты | Исчезновение синей окраски — раствор обесцвечивается | ДХФИФ — синий краситель — восстанавливается аскорбиновой кислотой (сильным восстановителем) до бесцветного соединения |
ДНК См. табл. 5.5.
Опыт 3.2. Определение биомолекул в тканях
Биохимику часто приходится выявлять присутствие тех или иных биомолекул или определять их количество в живых тканях, т. е. вести качественный или количественный анализ. Иногда эти определения можно выполнять непосредственно на самой ткани, но нередко им должен предшествовать тот или иной процесс экстракции или очистки.
Полезно потренироваться на каких-либо обычных пищевых продуктах или на растительном материале, определяя в них те биомолекулы, о которых шла речь в опыте 3.1. Там, где это возможно, мы предлагаем процедуру экстрагирования, которая позволит использовать для анализа чистый бесцветный раствор. Усвоив смысл таких процедур, студент сможет при необходимости сам предложить аналогичные методики.
Материалы и оборудование
- Все, что перечислено в опыте 3.1 (от начала и до раствора ДХФИФ)
- Ступка с пестиком
- Микроскоп
- Предметные и покровные стекла
- Лезвие бритвы
- Часовое стекло
- Раствор Шульца
- Флороглюцин + концентрированная соляная кислота
- Клубень картофеля
- Яблоко
- Вата
- Одревесневший стебель
- Семена/орехи
- Намоченный горох
- Бобы
Микроскопическое исследование тонких срезов ткани
Метод пригоден для знакомства с теми отложениями запасных веществ, которые можно видеть под микроскопом, например с крахмальными зернами в клубне картофеля.
Микроскопическое исследование срезов с соответствующим окрашиванием или какой-либо иной химической обработкой
Метод пригоден для выявления перечисленных ниже веществ.
Редуцирующие сахара. Поместить срез в несколько капель реактива Бенедикта и осторожно нагреть до кипения; при необходимости добавить воды, чтобы предотвратить высыхание.
Крахмал. Поместить в разбавленный раствор I 2 /KI.
Белок. Поместить срез в несколько капель реактива Миллона и осторожно нагреть до кипения; при необходимости добавить воды, чтобы предотвратить высыхание.
Масла и жиры. Окрасить исследуемый материал, например семена, суданом III, после чего промыть водой и(или) 70%-ным спиртом. Приготовить срезы и заключить в соответствующую среду.
Целлюлоза, лигнин и т. п. См. табл. 5.5.
Исследование прозрачных водных растворов
Обесцветить ткань, если в этом есть необходимость. Присутствующие в ткани пигменты могут мешать цветным реакциям, но обычно эти пигменты легко удалить из ткани органическими растворителями, например 80%-ным этанолом или 80%-ным пропаноном (ацетоном) (беречь от соприкосновения с открытым огнем). Следует, однако, помнить, что эти растворители могут удалять из ткани липиды и растворимые сахара. Методика пригодна для извлечения хлорофилла из листьев.
Гомогенизация материала.
Сахара и белки. Кусочки предназначенного для исследования материала растереть в кашицу с небольшим количеством воды при помощи ступки или миксера. Растертый материал процедить через несколько слоев тонкой кисеи или нейлона, предварительно смоченных водой, и либо отфильтровать, либо отцентрифугировать для удаления твердых частиц. Это может и не потребоваться, если суспензия окажется высокодисперсной и практически бесцветной. Прозрачный раствор анализируют как обычно, а если нужно, приготовляют из него соответствующие разведения. Твердый осадок, если он представляет интерес, также может быть подвергнут анализу.
Липиды. Растереть материал, перенести в пробирку и вскипятить. Липиды отделяются в виде капелек масла. Провести окрашивание суданом III. Можно вместо этого приготовить эмульсию из тонко наструганного ядра ореха или других пищевых продуктов (которые могут быть и окрашенными) и провести эмульсионную пробу.
Описанная методика пригодна для выявления в различных материалах указанных ниже веществ.
- Фрукты (например, яблоки или апельсины) (витамин С, сахара)
- Орехи (масла)
- Семена клещевины (масло)
- Семена гороха (белок)
- Семена сосны (белок, масло)
- Картофель (крахмал, витамин С)
- Яйца (белок)
Исследуемые материалы можно подразделить на фракции и затем каждую такую фракцию, например семена, мякоть плодов, кожуру или сок, исследовать по отдельности.