5.12. Микроскопические методы

Биология — Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. 1 том — 2013

5.12.1. Подготовка материала для работы с микроскопом

Биологические объекты можно исследовать как живыми, так и фиксированными. В последнем случае для более тщательного изучения материал можно разделить на части и обработать различными красителями, чтобы выявить и идентифицировать те или иные структуры. Из исследуемого объекта можно приготовить временные или постоянные препараты.

5.12.2. Постоянные препараты

Фиксация

Фиксация — это сохранение материала в состоянии, близком к естественному. Для этого необходимо быстро умертвить ткани, что лучше всего удается с небольшими кусочками живого материала. Используемое для этого вещество называется фиксатором. Быстрой фиксацией достигается сохранение изначальной структуры объекта, причем ткани уплотняются настолько, что с них можно готовить тонкие срезы.

Обезвоживание

Обезвоживание проводится при подготовке материала к заливке или для заключения его в соответствующую среду (см. ниже), которая не смешивается с водой. Воду необходимо удалить также потому, что иначе препарат будет со временем разрушен бактериями. Для того чтобы сохранить ультраструктуру, обезвоживание надо проводить постепенно, обрабатывая материал рядом водных растворов этанола или пропанона (ацетона) со все возрастающей концентрацией, и закончить обработку «абсолютным» (безводным) этанолом или пропаноном.

Просветление

Некоторые из общеупотребительных сред для заливки и заключения не смешиваются со спиртом. Поэтому его надо постепенно замещать средой (просветляющим веществом), с которой заливочная среда смешивается, например ксилолом. Это приводит также к тому, что материал становится прозрачным.

Заливка

Для того чтобы с помощью микротома получить очень тонкий срез, необходимо, чтобы материал был залит в соответствующую опорную среду. При приготовлении препаратов для световой микроскопии объекты заливают в парафин, которому затем дают остыть. Для электронной микроскопии приходится использовать более твердые вещества (пластмассы или смолы), поскольку здесь необходимы особо тонкие срезы, а значит, и опора должна быть более плотной.

Изготовление срезов

Как правило, толщина кусочков материала слишком велика, чтобы сквозь них могло пройти достаточное для исследования под микроскопом количество света. Обычно приходится срезать очень тонкий слой исследуемого материала, т. е. готовить срезы. Срезы можно делать бритвой или на микротоме. Вручную срезы готовятся с помощью остро отточенной бритвы. Для работы на обычном микроскопе срезы должны быть толщиной 8–12 мкм. Ткань закрепляют между двумя кусочками сердцевины бузины. Бритву смачивают жидкостью, в которой хранилась ткань; срез делают через бузину и ткань, причем бритву держат горизонтально и двигают ее к себе медленным скользящим движением, направленным чуть вкось. Быстро сделав несколько срезов, следует выбрать из них самый тонкий, содержащий характерные участки ткани.

Срез с ткани, залитой в ту или иную среду, можно сделать на микротоме. Для светового микроскопа срезы толщиной в несколько микрометров можно сделать с залитой в парафин ткани с помощью специального стального ножа. На ультратоме изготавливают чрезвычайно тонкие срезы (20–100 нм) для электронного микроскопа. В этом случае необходим алмазный или стеклянный нож.

Срезы для светового микроскопа можно приготовить, не заливая материал в среду; для этого используют замораживающий микротом. В процессе приготовления замороженного среза образец сохраняется в замороженном и, следовательно, в твердом состоянии.

Окрашивание

Как правило, биологические структуры на препаратах прозрачны, поэтому для получения контраста между ними приходится прибегать к различным средствам. Самым распространенным является окрашивание. Некоторые красители, используемые в световой микроскопии, перечислены в табл. 5.5.

Таблица 5.5. Красители, применяемые для окрашивания растительных и животных тканей

 

Определенные красители в низких концентрациях не токсичны для живых тканей и поэтому могут применяться для окрашивания живого материала. Их называют прижизненными (витальными) красителями. К ним относятся, например, метиленовый синий и нейтральный красный.

При окрашивании парафиновых срезов парафин удаляют с помощью растворителя, а срез перед окрашиванием частично обводняют.

Заключение

Полностью окрашенные срезы заключают на предметном стекле в специальную среду, например в канадский бальзам или эупарол; она не пропускает воздух, так что срез может сохраняться в ней неограниченно долго. Заключенный в среду срез накрывают покровным стеклом.

Последовательность описанных выше действий типична, когда речь идет о приготовлении тонких срезов для постоянных препаратов. Однако часто в порядок действий вносят два следующих изменения:

а) если срез сырого материала готовят вручную, то сначала делают срез, а потом его фиксируют;

б) окрашивать можно после фиксации или же в процессе обезвоживания на какой-либо его стадии. Например, красителем, растворенным в 50%-ном этаноле, можно окрасить срез после его обезвоживания в 50%-ном этаноле.

Описанная процедура приготовления препаратов в основном сходна как для светового, так и для электронного микроскопов, хотя существуют некоторые различия в деталях (они перечислены в табл. 5.6).

Таблица 5.6. Различия в подготовке материалов для светового и электронного микроскопов

 

5.12.3. Временные препараты

Временные препараты для светового микроскопа в отличие от постоянных можно сделать сравнительно быстро. Они пригодны для проведения быстрых предварительных исследований. Материал для этого фиксируют, окрашивают и заключают в ту или иную среду. Срезы можно приготовить до фиксации или мацерации (древесину, например, мацерируют). Срез свежего материала можно сделать вручную с помощью бритвы непосредственно в 70%-ном этаноле, который служит фиксатором. Для окрашивания и заключения можно использовать ряд временных красителей; некоторые из них, пригодные для окрашивания растительного материала, приведены в табл. 5.5. Каждый срез следует поместить на чистое предметное стекло (предварительно протертое спиртом) и капнуть на него несколько капель красителя. При окрашивании флороглюцинолом добавляют также одну каплю концентрированной соляной кислоты. Затем препарат накрывают тонким покровным стеклом, чтобы предотвратить попадание воздуха и пыли и предохранить от загрязнения объектив большого увеличения (рис. 5.39). Если образец начнет подсыхать или если заранее известно, что потребуется длительное изучение (более 10 мин), то после окрашивания препарат следует заключить в глицерол.

5.13. Рисунки в биологии

Цель

1. Документировать результаты работы для использования в дальнейшем.

2. Дополнить визуальное наблюдение и дать возможность рассмотреть исследуемый объект более полно и точно.

3. Способствовать запоминанию, зарисовывая то, что вы видите.

Правила

1. Необходимо использовать бумагу для рисования соответствующей толщины и качества. С нее должны хорошо стираться карандашные линии.

2. Карандаши должны быть острыми, твердости HB, не цветными.

3. Рисунок должен быть:

а) достаточно крупным — чем больше элементов составляют исследуемый объект, тем крупнее должен быть рисунок; он должен, как правило, занимать более половины листа;

б) тщательно выполненным — должны соблюдаться соотношения различных частей объекта. Если объект имеет несколько сходных частей, необходимо точно вырисовывать их мелкие детали;

в) нарисован тонкими и отчетливыми линиями — каждую линию необходимо продумать и затем нарисовать без отрыва карандаша от бумаги; не штриховать и не раскрашивать;

г) надписи должны быть по возможности полными, идущие от них линии не должны пересекаться; оставляйте вокруг рисунка место для надписей (желательно располагать их вертикально). К надписям могут быть сделаны примечания по поводу, например, интенсивности или оттенка окраски, усыхания ткани, каких-либо необычных или, наоборот, характерных особенностей образца.

4. При необходимости следует делать два рисунка: а) схематичный рисунок, показывающий основные черты, и б) только детали мелких частей. Например, при малом увеличении нарисовать план поперечного сечения растения, на котором будут видны только различные ткани, но не отдельные клетки, и при большом увеличении — детальное строение клеток (крупно нарисованную часть рисунка обводят на плане клином или квадратом).

5. Рисовать следует только то, что вы действительно видите, а не то, что, как вам кажется, вы должны видеть, и, конечно же, не копировать рисунок из книги.

6. Каждый рисунок должен иметь название, указание об увеличении и о проекции образца (например, ПС, ПрС и т. д.) и объяснительную записку. Все это следует помещать в определенном месте, например в правом верхнем углу страницы. Если возможно, должен быть указан также масштаб.

7. Идущие от надписей линии (их следует проводить по линейке) должны заканчиваться точно у той структуры, к которой относится надпись, причем надписями должны быть снабжены все структуры, которые могут представлять интерес.

Опыт 5.1. Окрашивание крахмала в растительных тканях

Разбавленный раствор йода в йодистом калии (I 2 /KI) можно использовать для окрашивания крахмала в тканях в темно-синий цвет. Крахмал — это углевод, запасаемый обычно в растительных клетках в виде мелких зерен. Крахмальные зерна легко наблюдать, если провести по предметному стеклу разрезанным клубнем картофеля, а затем окрасить мазок раствором I 2 /KI. Помимо крахмала раствор I 2 /KI окрашивает также лигнифицированные ткани (такие, как ксилема и склеренхима) в ярко-желтый цвет, а нелигнифицированные — в бледно-желтый. Ядра в клетках выглядят при этом более яркими, чем цитоплазма.

Материалы и оборудование

• Микроскоп и источник света
• Окулярмикрометр и объектмикрометр
• Чистые стекла, предметное и покровное
• Тонкая кисточка для переноса срезов
• Ткань для протирки линз
• Обыкновенная бумага
• Игла с ручкой
• Пипетка для красителя (если бутылочка с красителем не снабжена капельницей)
• Фильтровальная бумага
• Раствор йода в йодистом калии 5%-ный раствор глицерола в бутылочке с капельницей
• Срез органа какого-нибудь растения, например стебля яснотки белой (Lamium album)

Приготовление раствора I2/KI

Растворить около 1 г йода и 2 г йодистого калия в 300 мл воды. Если нужен более концентрированный раствор, можно взять меньше воды. (Следует соблюдать предосторожности, обычные при работе с йодом.) Тонкие свежие срезы можно приготовить с помощью бритвы, зажав стебель между двумя кусочками сердцевины бузины. Делать их следует в 70%-ном спирте.

Методика

1. Перенесите кисточкой предназначенный для изучения срез на предметное стекло и поместите его в центр стекла.

2. Добавьте две капли раствора I2/KI и одну каплю 5%-ного глицерола (чтобы замедлить испарение и не дать образцу слишком быстро подсохнуть).

3. Накройте срез покровным стеклом, как показано на рис. 5.39.

4. Внимательно изучите срез под микроскопом. Особо отметьте распределение темноокрашенных крахмальных зерен. В препарате могут обнаружиться воздушные пузырьки с темным контуром, явно пустые. На них не следует обращать внимания.

5. Зарисуйте план поперечного сечения стебля яснотки белой при малом увеличении. Главная цель — точно обвести контуром площадь, занимаемую каждой тканью. При этом полезно учесть, что: а) у яснотки белой в каждом углу ее ребристого стебля имеется особая опорная ткань — колленхима. б) размеры сосудистых пучков варьируют. Между сосудистыми пучками иногда закладываются дополнительные тяжи ксилемы и флоэмы и тогда вся эта проводящая ткань может в конечном счете образовать один сплошной цилиндр.

6. Снабдите нарисованный при малом увеличении план надписями и укажите линейное увеличение рисунка.

7. Отметьте, какие ткани содержат крахмал. Особенно много крахмальных зерен в так называемом крахмалоносном влагалище. Его следует зарисовать и снабдить надписью, а под рисунком, в примечании, описать, как распределяются в его клетках крахмальные зерна.

8. Проверьте утверждение, что средний размер клеток паренхимы в кожице стебля яснотки белой во внутренних ее слоях больше, чем в наружных.

Для этого проведите соответствующие измерения с помощью окулярмикрометра во внутренних и наружных участках кожицы. Подробно опишите использованный метод. Запишите полученные результаты в делениях окулярмикрометра. Переведите эти величины в микрометры, для чего откалибруйте свой окулярмикрометр. Подтвердили ли ваши измерения утверждение, о котором идет речь?