Криоконсервация клеток и тканей. Способы и методы

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ

Сохранение разнообразия форм жизни — важнейшая пробле­ма, с которой столкнулось современное человечество. Еще Г. Ф. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Следовательно, сохранение биоразнообразия — один из важнейших механизмов стабильности жизни на Земле. Кроме того, для обеспечения питанием растущей численности населения нашей планеты необходимо выведение новых, более продуктивных сортов сельскохозяйственных расте­ний, а для успешной селекции важен постоянный приток генов из новых источников. Традиционным источником генетического материала служат дикие виды растений. Однако в связи с увели­чением числа городов, расширением сельскохозяйственных уго­дий, вырубкой лесов, ухудшением экологии эти виды постепен­но вытесняются, а многие из них находятся на грани вымирания, поэтому их необходимо сохранить.

СПОСОБЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА

Существует несколько способов сохранения генофонда живых организмов: заповедники, национальные парки, зоопарки. Запо­ведники и национальные парки — наиболее совершенная форма резерватов. Основной недостаток этих формирований состоит в том, что они требуют значительных территорий. Для сохранения 90—95 % существующих видов живых организмов территория за­поведников должна занимать около 30 % всей площади суши, от­дать которые при современной плотности населения и потребно­сти в сельскохозяйственных угодьях просто невозможно. Зоопар­ки и питомники требуют меньших территорий. Однако возвратить выращенных там животных в дикую природу удается достаточно редко. В последнее время большое внимание уделяется созданию и развитию новых способов: пересадочных коллекций каллусных клеток, депонированию культур клеток и, наконец, криосохране­нию, т.е. хранению объектов при очень низкой температуре, обычно это температура жидкого азота (-196 С).

Однако современное понятие «криоконсервация» несколько расплывчато из-за разнообразия объектов, каждый из которых требует своих температур и условий хранения. Этот метод позво­ляет сохранять соматические и половые клетки, семена растений, эмбрионы и личинки животных. Разработаны технологии дли­тельного сохранения с помощью криоконсервации генетическо­го материала разных объектов: грибов, споровых растений, выс­ших растений, некоторых млекопитающих, птиц, амфибий, рыб, иглокожих, моллюсков, насекомых, ракообразных.

Криосохранение имеет существенные преимущества по срав­нению с остальными методами. При сохранении в глубоко замо­роженном состоянии полностью прекращается обмен веществ, отсутствуют значительные физико-химические молекулярные из­менения не только в клетке, но и в окружающей водной среде. Таким образом, сохраняется генофонд, а следовательно, все свой­ства замороженного объекта.

В 1992 г. в Рио-де-Жанейро большинством государств мира была принята Медународная конвенция по сохранению биологи­ческого разнообразия, созданы Национальные программы по со­хранению природных генетических ресурсов. Одно из обязатель­ных условий этих программ — создание банков зародышевой плазмы: семян, меристем, пыльцы, зародышей, культур тканей, клеток и другого генетического материала. Такие банки долговре­менного хранения геномов позволяют:

  • собирать и сохранять редкие и исчезающие виды;
  • сохранять морфологическое, физиологическое и адаптацион­ное разнообразие внутривидовой изменчивости по культурным и дикорастущим видам;
  • служить незаменимыми источниками материала для селекции культурных растений;
  • обеспечивать размножение редких и исчезающих видов ди­корастущих растений и возвращение их в природу;
  • создавать искусственные популяции и фитоценозы.

 

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ СЕМЯН РАСТЕНИЙ

Семена всех растений в зависимости от продолжительности их жизни делят на три группы:

  • микробиотики, сохраняющие жизнеспособность до 3 лет;
  • мезобиотики — от 3 до 15 лет;
  • макробиотики — от 15 лет и более.

Для продления жизни семян разработано достаточно много технологий. В первую очередь это касается семян культурных ра­стений. Время их жизни увеличивают благодаря снижению тем­пературы хранения (низкие положительные температуры), сниже­нию влажности окружающей среды, герметизации при хранении, применению искусственных газовых сред и, наконец, криосохра­нению. Очень важно разработать технологии долговременного хранения семян, относящихся к группе микробиотиков, среди которых немало хозяйственно важных (цитрусовые), декоратив­ных (каштан, гербера) и лекарственных (дуб, каштан) растений.

В настоящее время для продления жизни семян любых расте­ний чаще всего применяют хранение при пониженных темпера­турах:

  • низкие положительные температуры (4 ± 1 С);
  • неглубокое замораживание (от -10 до -20 С);
  • глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азо­те при температуре -196 вС или в парах над ним -160 С.

Семена и некоторые другие элементы зародышевой плазы хра­нят, используя в большей или меньшей степени все три темпера­турных режима, в специализированных банках, сеть которых за последнее время сильно увеличилась. Если в середине 70-х годов XX в. таких банков насчитывалось немногим более 50, то сейчас их более 1300. В банках хранится более 6 млн образцов: 48 % — новые сорта и селекционные линии; 30 % — старые сорта; 15 % — дикорастущие родичи культурных растений и сорные виды. На­пример, в Швейцарии, в 24 государственных и частных банках сохранено 17 тыс. образцов семян кормовых, плодовых, лекар­ственных и ароматических растений. Большое внимание сбору и хранению лекарственных растений уделяют в Австрии и Китае. Создаются специализированные банки зародышевой плазы по древесным видам.

Самым дешевым и экологически безопасным было признано хранение семян в шахтах в вечной мерзлоте. Такие эксперимен­ты проводились в Якутске в подземной лаборатории Института мерзлотоведения Сибирского отделения РАН. Хранение в герме­тичных сосудах в течение трех лет семян пшеницы, ячменя, овса, ржи, овощных растений, кормовых трав при температуре -2,7 С не снижало их жизнеспособности. Однако вечная мерзлота есть не везде, поэтому глубокое замораживание и замораживание до сверхнизких температур (-200 °С и ниже) удобнее всего в техни­ческом отношении. Кроме того, при этих температурах практи­чески прекращаются все метаболитические процессы, что позво­ляет хранить растительный материал очень долго без существен­ных изменений. Сейчас изучена всхожесть семян после глубоко­го замораживания у более чем 400 видов растений, и уже эти ре­зультаты показывают, что устойчивость семян к низким и сверх­низким температурам видоспецифична, а также может зависеть от времени и места сбора. Разные растения неодинаково реагируют

на температурный фактор. Только недавно удалось добиться ус­пешного криосохранения семян шести форм наземных и эпифитных тропических орхидей, что открывает возможность создания криобанка сеян этих исчезающих растений (Т. В. Никишина и др., 2001). Криоконсервация семян некоторых культурных бобовых растений рекомендуется для повышения их всхожести. Глубокое замораживание семян вишни и черешни запатентовано как спо­соб их долговременного хранения. Реакция на низкие температу­ры у представителей семейства лилейных немного различалась: у ландыша после криосохранения увеличивалась частота хромосом­ных аберраций и снижалась жизнеспособность; у семян растений рода купена жизнеспособность также снижалась, но частота хро­мосомных аберраций не изменялась. У некоторых растений по­вышение частоты хромосомных аберраций наблюдалось даже при неглубоком замораживании. Семена таких растений, как жимо­лость, пиретрум, золотарник обыкновенный, частично погибают при любом замораживании (В. J1. Тихонова, 1999). Поэтому перед внедрением криоконсервации необходимо проводить всесторон­ние исследования ее всевозможных последствий, так как они мо­гут быть весьма разнообразны.

 

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ

Сущность метода криосохранения сводится к замораживанию специально подготовленных растительных клеток при использова­нии криопротекторов — веществ, ослабляющих повреждения кле­ток при замораживании и оттаивании. В настоящее время извест­ны два метода криосохранения: программное и сверх­быстрое замораживание. Программное замораживание изучалось уже давно, поэтому оно довольно широко применяется для сохра­нения животных и растительных клеток. Разработка сверхбыстро­го замораживания началась сравнительно недавно, однако счита­ется, что именно этот метод со временем станет наиболее перспек­тивным.

Трудности криосохранения растений связаны со спецификой растительных клеток. Клетки растений имеют большие разме­ры (в культуре тканей они изменяются от 15 до 1 ООО мкм), проч­ную целлюлозную стенку и вакуоли. Причем именно степень ва­куолизации играет основную роль в устойчивости клеток к дей­ствию низких температур. В зрелой клетке центральная вакуоль занимает до 90 % общего объема клетки, т. е. клетка представляет собой как бы резервуар с водой, которая необходима для ее нор­мальной жизнедеятельности. Поэтому основные факторы, спо­собные привести клетку к гибели при замораживании, — это образование льда и дегидратация. Обычно кристаллы льда сначала образуются во внешнем растворе вокруг клеток. Максимальная скорость их роста в зависимости от состава раствора находится в пределах температур от -20 до -60 С. При температуре -140 °С рост кристаллов льда совершенно прекращается. Следовательно, и при замораживании, и при оттаивании клеткам очень важно с оптимальной скоростью «проскочить» температуру образования льда. Кристаллы внеклеточного льда могут механически разру­шать клетки. Кроме того, они играют водоотнимающую роль, что приводит к значительной дегидратации клетки и возможной ее ги­бели от осмотического стресса. При очень быстром заморажива­нии лед может образовываться и внутри клеток, что ведет к раз­рушению в ней многочисленных мембран.

Избежать кристаллизации льда помогла бы витрификация воды, т.е. затвердение ее в аморфном состоянии. Получить витрификацию чистой воды практически невозможно. Но в колло­идных растворах скорость образования центров кристаллизации и роста кристаллов льда снижается и повышается температура, при которой их рост прекращается. Все это облегчает витрификацию. Добавление криопротекторов также затрудняет кристал­лизацию льда и способствует витрификации.

Наиболее известны такие криопротекторы, как диметилсульфоксид (ДМСО), различные сахара, глицерин, этиленгликоль и их производные. Действие криопротекторов состоит в снижении количества свободной воды, повышении вязкости раствора. Все криопротекторы делят на две группы: проникающие и непрони­кающие. Это разделение достаточно условно. Так, глицерин — первое вещество, определенное как криопротектор, может про­никать в клетку, если его добавлять при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добав­лять при температуре 0 С. Принято считать, что непроникающие криопротекторы специфически влияют на мембрану, повышая ее проницаемость. Применение сильных, проникающих в клетку криопротекторов ограничено их токсичностью. Обычно исполь­зуют смеси криопротекторов, так как в них токсичность одного из веществ снижается за счет присутствия другого.

Жизнеспособность клеток после замораживания зависит не только от предупреждения образования льда, но и от их состоя­ния. Крупные вакуолизированные клетки погибают гораздо чаще, чем мелкие меристемоидные. Поэтому на этапе подготовки куль­туры к замораживанию ее культивируют в условиях, способству­ющих образованию мелких клеток и синхронизации их деления. Кроме того, концентрирование клеток в культуре, т. е. увеличение ее плотности, способствует повышению выживаемости клеток после замораживания.

Таким образом, криосохранение достаточно надежно обеспе­чивает сохранение генофонда. Перспективность этого метода под­тверждается возобновлением после хранения в жидком азоте сус­пензионных культур моркови, явора, кукурузы, риса, сахарного тростника; каллусных культур тополя, маршанции, сахарного тро­стника; андрогенных эмбриоидов — беладонны, табака и др. Из восстановленных после замораживания культур моркови и таба­ка удалось регенерировать целые растения. После быстрого замо­раживания сохранили жизнеспособность меристемы земляники, малины, гвоздики, томатов, картофеля и ряда других растений. Однако для криосохранения требуется сложная работа по подбо­ру условий, обеспечивающих выживание клеток и, следователь­но, возможность последующей регенерации из них целых расте­ний. Необходимо учитывать генетические и морфофизиологиче­ские особенности клеток, способность к закаливанию, уровень проницаемости клеточных мембран, подбор криопротекторов, скорость снижения температуры при замораживании, условия от­таивания.

А Вам помог наш сайт? Мы будем рады если Вы оставите несколько хороших слов о нас.
Категории
Рекомендации
Можно выбрать
Интересное
А знаете ли вы, что нажав сочетание клавиш Ctrl+F - можно воспользоваться поиском по сайту?
X
Copyrights © 2015: FARMF.RU - тесты, лекции, обзоры
Яндекс.Метрика
Рейтинг@Mail.ru

Пожалуйста поддержите наш сайт.

Скроее всего Вы знаете, что Google приостановил монетизацию сайтов в РФ. Для поддержки нашего сайта пожалуйста используйте VPN соединение из любой страны кроме РФ. Нам важна Ваша помощь для продолжения публикации новых лекций и статей.