Клеточная инженерия животных. История, источники тканей

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ЖИВОТНЫХ

Краткая история предмета

Попытки сохранения жизнеспособности животных клеток и их выращивания в питательной среде были предприняты еще в конце XIX в. В 1885 г. исследователь У. Роуке сохранял в жизне­способном состоянии в теплом физиологическом растворе хо- рионаллантоисную оболочку куриного эмбриона. В 1897 г. Б. Лоэб установил, что клетки крови и соединительной ткани способны выживать в пробирках с сывороткой и плазмой крови. На той же среде ученый культивировал фрагменты печени, почек, щито­видной железы. Льюнгрен в 1898 г. установил, что в кислой сре­де экспланты кожи человека можно не только поддерживать в жизнеспособном состоянии, но и сохранять их способность к ре­имплантации. В 1907 г. Р. Харрисон усовершенствовал метод «ви­сячей капли». Благодаря этому в течение нескольких недель в капле лимфы лягушки сохранялись в жизнеспособном состоя­нии клетки зачатка нервной системы зародыша лягушки, кото­рые к тому же образовывали нервные волокна. Скорость роста этих клеток составляла 20 мкм за 25 мин. В 1910 г. методика, разработанная Р. Харрисоном, была модифицирована и приме­нена У. Барроузом для выращивания клеток тканей теплокров­ных животных.

Большой интерес вызвали в 1912 г. работы французского хи­рурга А. Каррела по созданию культуры «бессмертных» клеток сер­дца куриного эмбриона. Однако воспроизвести этот результат современники ученого не смогли. Владея хирургической техни­кой, Каррел при отсутствии антибиотиков сумел усовершенство­вать методы создания стерильных условий при пересадке клеток. В 1913 г. он применил новую питательную среду — плазму крови, обогащенную экстрактом эмбриона, которая ускоряла рост тка­ни в культуре. Наконец, в 1923 г. ученый создал специальный со­суд для культивирования клеток, который получил его имя — кол­ба Каррела. Однако первые попытки длительного культивирова­ния за счет периодического пересаживания клеток в свежую сре­ду были неудачными. Оказалось, что культуры клеток и тканей животных даже при пассировании (пересаживании) имеют ог­раниченную продолжительность жизни. Примерно после 50 пас­сажей они стареют и погибают. Исключение составляют опухо­левые клетки и клетки с аномальным количеством хромосом. В 1951 г. была создана первая линия опухолевых клеток человека, которую сейчас используют во всех лабораториях мира под назва­нием Hela. В этих клетках содержится 60—70 хромосом вместо обычных 46.

Культуры клеток и тканей нашли широкое применение в ви­русологии. Они используются в качестве субстрата для выращи­вания вирусов в целях изучения последних, а также для получе­ния противовирусных вакцин. Первые удачные эксперименты по получению большого количества вируса оспы крупного рогатого скота были проведены А. Каррелом, У. Риверсом (1927) и Т. Мей- тландсом (1928).

Параллельно с совершенствованием методов культивирования клеток и тканей появились важные разработки, позволяющие про­водить наблюдения за исследуемыми объектами. В 1928 г. А. Кан­ти создал метод кинефотомикрографии, с помощью которого по­явилась возможность фото- и киносъемок роста и развития кле­ток. Была разработана методика трипсинизации — получения индивидуальных клеток. Получение клонов из одной клетки впервые было осуществлено Г. Эрлом с сотрудниками в 1948 г.

Однако основной проблемой культивирования клеток и тканей животных в то время было точное воспроизведение условий вы­ращивания для получения стабильных результатов. Главным препятствием для этого было создание питательной среды с посто­янным составом.

Питательные среды

До середины XX в. питательными средами для выращивания клеток служили природные материалы, которые обладают значи­тельной индивидуальностью (лимфа крови, куриный желток и т.д.), что существенно снижало повторяемость результатов. В 1955 г. Игл разработал первый состав стандартной питательной среды (среда Игла), которая позволяла получать воспроизводимые результаты. Она содержит минеральные соли, аминокислоты, ви­тамины, антибиотики, телячью сыворотку, краситель феноловый красный в качестве индикатора pH. Для выращивания животных клеток pH питательной среды служит одним из важнейших фак­торов, значения которого должны находиться в пределах 7,2 —7,4. Поэтому солевые растворы, которые являются основой питатель­ных сред, служат, кроме того, еще и буферными системами, под­держивающими постоянство кислотно-щелочного баланса. На­пример, для клонального роста диплоидных фибробластов чело­века W138 оптимальные показатели pH — 7,30 ± 0,15; а для фиб­робластов из эмбриона цыпленка pH — 7,12 ± 0,18.

Особое значейие среди компонентов питательных сред име­ет сыворотка, которая выполняет несколько функций. За счет со­держащихся в ней компонентов обеспечиваются прикрепление клеток к субстрату и их распластывание на нем, транспорт ми­неральных и органических веществ, стимулирование роста и деления клеток. За усиление деления клеток отвечают специфи­ческие вещества — митогены. Для животных клеток роль мито- генов выполняют такие вещества, как фитогемагглютинин (ФГА), лектины. Очень важна концентрация питательных ве­ществ и факторов роста. Было выяснено, что после протекания питательной среды над клетками следующая группа клеток, ко­торую омоет эта среда, будет делиться хуже, чем клетки, кото­рые омывает среда, протекавшая над свободными от клеток уча­стками колбы. Следовательно, вторая группа клеток будет испы­тывать недостаток в питательных веществах и факторе роста, которые используют первые клетки. Фактор роста присутствует в среде в ничтожных количествах (10_10М), и клетки конкури­руют за него, что предотвращает неограниченный рост культу­ры клеток.

Сейчас разработаны модификации среды Игла и другие среды. Созданы среды, которые не содержат сыворотки, что увеличива­ет воспроизводимость полученных данных. Эти среды предназна­чены для выращивания определенных типов клеток. Примером могут служить среда Дубелько DME и DMEM (двойная модифи­кация среды Игла), среда Искова IMDM (представляет собой модификацию среды Дубелько). Первую среду используют для культивирования нетрансформированных клеток и гибридом, вторую — для культивирования лимфоцитов и кроветворных кле­ток.

Источники получения тканей

Для получения культур тканей обычно используют эмбрионы или организмы взрослых животных. Все ткани, полученные от животных в постнатальном периоде, могут рассматриваться как зрелые. Материал, полученный из взрослых животных, необходи­мо подвергнуть специальной обработке, чтобы обеспечить его стерильность перед культивированием. Обработка обычно заключается в применении антибиотиков и фунгицидных препаратов. Опухолевые ткани, изолированные из органов взрослых живот­ных, ведут себя во многом как нормальные зрелые ткани, отли­чаясь от последних более быстрым ростом в течение первых дней культивирования. Эмбриональные ткани стерильны, поэтому, чтобы получить стерильный материал, достаточно вести работу в асептических условиях.

Эмбриональные и взрослые ткани животных могут быть полу­чены из разных источников. Наиболее доступны эмбриональные ткани цыпленка, мыши, крысы. Среди взрослых тканей класси­ческими объектами для культивирования служат центральная нервная система, подкожные фибробласты, костный мозг.

Типы культур клеток и тканей

У животных различают культуру клеток и культуру тканей. В культуре тканей выращивают сообщества связанных между со­бой клеток, которые находятся в непосредственном контакте меж­ду собой. В культуре клеток одиночные клетки растут, образуя клоны. Рассмотрим основные типы культур клеток.

Первичная культура — небольшая популяция свежевыде­ленных клеток, полученных из органа взрослого животного орга­низма. Для ее приготовления кусочек ткани органа обрабатыва­ют трипсином, который разрушает ткань с образованием отдель­ных клеток. Клетки переносят на питательную среду. Время их жизни ограничено 2 — 3 неделями. В первичной культуре клетки, как правило, гетерогенны и характеризуются низкой пролифера­цией. Многие зрелые ткани в культуре растут с большим трудом, и проходит несколько дней, прежде чем рост становится замет­ным. Так, изолированные фибробласты растут очень слабо. Од­нако другие типы клеток, например эпителиальные клетки зре­лых тканей, развиваются в культуре хорошо.

Развитие клеток при пассировании, которое обеспечивает про­дление жизни и сохранение свойств клеток, получение более од­нородных популяций, клонирование и исследование клетки, мо­жет идти в двух направлениях. После нескольких пересевов кле­точная линия может погибнуть или превратиться в постоянную клеточную линию. Нормальные клетки, превращаясь в постоян­ную линию, не становятся злокачественными. Обнаружить появ­ление постоянной линии клеток можно по ряду морфологических и физиологических признаков (уменьшение размера, округление, увеличение ядерно-плазменного отношения, снижение времени удвоения клеток в культуре и т.д.).

Диплоидная культура — культура клеток, источником ко­торых являются эмбриональные ткани человека и животных. Эта культура растет на питательной среде дольше —примерно 2 меся­ца. Характерной чертой диплоидных культур является постоян­ство их биологических свойств, например диплоидного набора хромосом. Клетки сохраняются без изменений в течение прибли­зительно 50 пассажей. Культуры, выращенные из эмбриональных тканей, отличаются лучшей выживаемостью, более активным ро­стом, легче поддаются выращиванию, быстрее мигрируют по сравнению с соответствующими тканями, выделенными из взрос­лых организмов. Это объясняется низким уровнем дифференцировки эмбриональных тканей и присутствием в них клеток-пред­шественников. Дифференцировка нормальных клеток в культу­ре сопровождается обычно полным прекращением пролиферации клеток.

Стабильная {перевиваемая) культура — культура опухоле­вых клеток и клеток с аномальным числом хромосом. Размноже­ние этих культур ничем не ограничено. Даже при частичной дифференцировке, которая возможна в культурах опухолевых клеток, их способность к делению сохраняется. Они полностью адапти­рованы к существованию вне организма.

Культуры клеток лишены структурной организации, не взаи­модействуют между собой и восстановить эти взаимодействия достаточно трудно, так же трудно, как контролировать изменения свойств культивируемых клеток. В связи с этим в фундаментальных исследованиях часто отдают предпочтение культурам тканей, клеточным системам, которые сохраняют структурную организа­цию ткани.

Культура тканей или органов (органная культура) характери­зуется сохранением взаимосвязей между клетками, и в этом ее принципиальное отличие от культуры клеток. Все биохимические, физиологические, морфологические процессы в данной культу­ре приближены к тем, которые происходят в целом организме. Наибольшее сходство отмечено у эмбриональных тканей. Недо­статок культур тканей состоит в том, что они не способны к раз­множению.

Способы и условия культивирования

Культура клеток.. Для культивирования животных клеток используют непроточные культуры и проточные культуры. Не­проточные культуры характеризуются тем, что клетки выращива­ются в постоянном объеме питательной среды. Со временем из­менятся состав этой среды, что требует ее периодической замены. Проточные культуры характеризуются добавлением новой пита­тельной среды с одновременным удалением равного объема отра­ботанной. Этот способ культивирования применяют для выращи­вания суспензионных культур и монослойных культур на микро­носителях. Среда с питательными веществами постоянно обнов­ляется, что позволяет поддерживать неизменный состав и концен­трацию питательных веществ, количество клеток в культуре, а так­же выводить продукты их жизнедеятельности.

Существуют два типа клеточных культур: монослойные куль­туры и суспензионные культуры.

Монослойные культуры образуются в результате пролифера­ции прикрепленных клеток. Частота деления клеток в культуре возрастает с увеличением степени их прикрепления и распластывания на поверхности субстрата.. В суспензии клетки не прикреп­лены к твердой поверхности, имеют округлую форму, делятся очень плохо либо почти никогда не делятся. Вероятно, расплас­танные на субстрате клетки вследствие увеличения своей удель­ной поверхности могут поглощать питательные вещества и фак­тор роста с большей интенсивностью. Деление клетки зависит и от возможности ее вступать в контакт с субстратом, как бы ни мала была площадь этого контакта. Такие точечные контакты не дают клетке возможности распластаться, но служат местами вза­имодействия внутриклеточных актиновых филаментов с субстра­том. При выращивании в культуре клетки одного типа ткани ха­рактеризуются согласованной скоростью деления для поддержа­ния определенной плотности популяции, так же как это наблю­дается в тканях целого организма. На поверхности питательных сред эпителиальные клетки, или фибробласты, «приклеиваются» к ней, распластываются и делятся до тех пор, пока не образуют сплошной монослой.

Монослойные культуры характеризуются рядом особенностей:

• легкое манипулирование культурой (промывание клеток, за­мена питательной среды и т.д.);
• создание культуры на основе любого типа клеток;
• создание высокой плотности клеток, увеличение выхода необходимого продукта их жизнедеятельности и т.д.

Суспензионные культуры удобны для получения метаболи­тов и увеличения выхода клеток.

Культура тканей. Существует несколько методов культивиро­вания животных тканей.

Метод, известный под названием «техника часового стекла», был предложен Феллом и Робинсоном в 1929 г. В качестве субстрата для культивирования обычно используют сгусток плазмы крови цыпленка с добавлением эмбрионального экстракта кур. Часовое стекло с культурой во избежание высыхания помещают в замкну­тое пространство (чашка Петри), а затем в термостат при темпе­ратуре 37,5°С. Это классический метод для морфогенетического анализа эмбриональных органов. Однако он обладает нескольки­ми недостатками. Во-первых, сложный состав питательной среды затрудняет проведение биохимических исследований. Во-вторых, при культивировании питательная среда разжижается, в результа­те чего тканевой эксплант оказывается в растворе, что мешает нор­мальному росту тканей, органов или их фрагментов.

Следующие два метода позволяют успешно решить данную проблему.

Технология выращивания культуры тканей на плотной ага- ризованной среде была предложена Спраттом. Основой для таких сред служат жидкие питательные среды определенного состава, солевые растворы с добавлением агара в концентрации от 1 до 4%.

Троувелл предложил другой подход к решению проблемы — выращивание тканей и органов на поверхности металлической сетки. Края сетки загибают по углам как ножки столика, после чего его погружают в питательную среду так, чтобы поверхность сетки была вровень или чуть выше поверхности питательной сре­ды. При культивировании мягких тканей на сетку укладывают кусочки миллипоровых фильтров, а уже затем ткани. По техно­логии этот метод похож на методы «кормящего слоя» и «конди­ционирования среды» для культивирования одиночных клеток растений.

Использование культур клеток и тканей животных

Культуры клеток и тканей служат прекрасным объектом для фундаментальных общебиологических и медико-биологических исследований. С помощью культур клеток можно изучать процес­сы наследования генов, регуляцию их активности, процессы кле­точной дифференцировки. Культуры клеток позволяют исследо­вать действие на клетку физических, химических и биологических факторов. Широкое применение получили культуры фибробластов при изучении диагностики и патогенеза некоторых заболе­ваний, в том числе наследственных. Культуры тканей использу­ют для таких исследований как, взаимоотношения клеток. В тка­нях и самих тканей, дифференцировка клеток, закономерности размножения клеток, их трансформации. Культуры органов при­меняют для изучения закономерностей развития зачатков в нор­ме и при различных воздействиях.

Большое практическое значение культуры клеток, в частности культуры клеток беспозвоночных, имеют в вирусологии, где они используются для диагностики вирусов, а также служат субстра­том для получения живых противовирусных вакцин.