Клеточная инженерия. Клетки и ткани, методы культивирования

Клеточная инженерия. Клетки и ткани, методы культивирования

Клеточная инженерия — одно из наиболее важных направле­ний в биотехнологии. Она основана на использовании принципи­ально нового объекта — изолированной культуры клеток или тка­ней эукариотических организмов, а также на тотипотентности — уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференциров-ка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. При решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения зна­чительных количеств биологически ценных метаболитов расти­тельного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.

КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ, КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ПРЕДМЕТА

Бурное развитие клеточной инженерии приходится на 50-е годы прошлого века, хотя первые попытки выращивания изолированных кусочков ткани были сделаны гораздо раньше. В конце XIX — начале XX в. немецкие ученые X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Хаберландт (1902) сделали первую неудачную попытку стимуляции роста растительных тканей и органов, помещенных на фильтро­вальную бумагу, пропитанную сахарозой. Несмотря на отсутствие положительного результата, их работы представляют большой инте­рес. В них были высказаны идеи, которые намного опередили раз­витие науки того времени и которые нашли свое подтверждение несколько десятилетий спустя. Так, Фехтинг предположил, что полярность присуща не только организму или органу растения, но и самой клетке. Рехингер определил минимальный размер сег­мента, образующего каллус. Согласно его исследованиям, в кусоч­ках ткани тоньше 1,5 — 2,0 мм клетки не делились. Хаберландт впервые четко сформулировал идеи о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и о тотипотентности кле­ток, т. е. способности любой соматической клетки полностью реализовывать свой потенциал развития. Иначе говоря, о способнос­ти каждой растительной клетки давать начало целому организму.

Первые успехи были получены в 1922 г. американским ученым В.Роббинсом и немецким ученым В.Котте. Независимо друг от друга они показали возможность выращивания меристем кончи­ков корней томатов и кукурузы на синтетической питательной среде. Считается, что их работы легли в основу метода культуры изолированных корней растения.

Настоящее развитие метода культуры тканей и клеток высших растений началось в 1932 г. с работ французского ученого Р. Готре и американского исследователя Ф.Уайта. Они показали, что при периодической пересадке на свежую питательную среду кончики корней могут расти неограниченно долго. Кроме того, ими были разработаны методы культивирования новых объектов: тканей древесных растений камбиального происхождения, каллусных тканей запасающей паренхимы (Р. Готре), а также тканей расти­тельных опухолей (Ф.Уайт). С этого момента начинаются массо­вые исследования по разработке новых питательных сред, вклю­чающих даже такие неконтролируемые компоненты, как березо­вый сок или эндосперм кокоса, и по введению в культуру новых объектов. К 1959 г. насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильной культуре.

В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового клас­са фитогормонов — цитокининов — оказалось, что при совмест­ном их действии с другим классом фитогормонов — ауксинами — появилась возможность стимулировать деление клеток, поддер­живать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в конт­ролируемых условиях.

В 1959 г. был предложен метод выращивания больших масс кле­точных суспензий. Важным событием стала разработка Е. Коккин-гом (Ноттингемский университет, Великобритания) в 1960 г. ме­тода получения изолированных протопластов. Это послужило тол­чком к получению соматических гибридов, введению в протопла­сты вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морелом и Р. Г. Бутенко был предложен метод кло-нального микроразмножения, который сразу же нашел широкое практическое применение. Весьма важным достижением в разви­тии технологий культивирования изолированных тканей и клеток стало культивирование одиночной клетки с помощью ткани-«нянь­ки». Этот метод был разработан в России в 1969 г. в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН под руководством Р. Г. Бутенко. В последние десятилетия продолжается быстрый про­гресс технологий клеточной инженерии, позволяющих значительно облегчить селекционную работу. Большие успехи достигнуты в раз­витии методов получения трансгенных растений, технологий ис­пользования изолированных тканей и клеток травянистых расте­ний, начато культивирование тканей древесных растений.

МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусствен­ных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получи­ло название метода культуры изолированных тканей.

В связи с тем что в жизни человека наибольшее значение име­ют семенные растения, методы и условия для их культивирова­ния разработаны лучше, чем для голосеменных растений или во­дорослей, выращивание которых в стерильных условиях вызывает определенные затруднения. Однако независимо от принадлежнос­ти растений к той или иной таксономической группе существуют общие требования к выращиванию объектов в культуре in vitro.

Асептика. Прежде всего культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток тре­бует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы, которые мо­гут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирую-щие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар-боксе или в асептических комнатах. В первом случае асептика дос­тигается подачей профильтрованного стерильного воздуха, направ­ленного из ламинкар-бокса наружу, на работающего. Асептичес­кие комнаты стерилизуют с помощью ультрафиолетовых ламп, а работают в таких помещениях в стерильной одежде. Рабочую по­верхность столов в асептических комнатах и инструменты перед работой дополнительно стерилизуют спиртом.

Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фоль­гу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушиль­ном шкафу при температуре 160 °С в течение 1,5 — 2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и повышен­ном давлении в течение 15 — 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их сле­дует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 °С.

Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источ­ником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпи-фитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерили­зация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Некоторые из этих веществ, а также время стерилизации представлены в табл. 6.1.

После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем раство­ре их несколько раз промывают в дистиллированной воде и скаль­пелем удаляют наружный слой клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации.

Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной тка­ни. Наиболее часто внутреннее инфицирование встречается у тро­пических и субтропических растений. Поэтому кроме поверхност­ной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, ко­торые и убивают микробную флору внутри ткани. Следует, одна­ко, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к сте­рилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направ­ленно действующий антибиотик.

Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культиви­руют на многокомпонентных питательных средах. Они могут су­щественно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и мик­роэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтети­ческие аналоги. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) вхо­дят в состав любой питательной смеси в концентрации 2 — 3%. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способ­но к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Исключение составляет кал-лусная ткань мандрагоры, амаранта и некоторых других растений.

Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении со­отношения между этими фитогормонами или при добавлении дру­гих фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.

Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фос­фата способствует быстрому росту клеток. Истощение среды зна­чительно снижает рост и процессы вторичного метаболизма. Од­нако изначально низкое содержание фосфатов в питательной сре­де способно стимулировать синтез вторичных метаболитов. Уста­новлено, что культивирование каллусов солодки голой на среде с половинной концентрацией азота и фосфора в темноте увеличи­вает содержание фенольных соединений в 1,6 раза по сравнению с каллусами, растущими на полной среде. В среду могут быть до­бавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосовый орех, кон­ский каштан и др.), пасока некоторых деревьев, различные экст­ракты (солодовый, дрожжевой, томатный сок). Введение их в сре­ду дает интересные результаты, но такие эксперименты трудно воспроизводимы, так как действующий компонент, как правило, точно неизвестен. Например, добавление в питательную среду от­дельных фракций кокосового молока не давало никаких результа­тов, в то время как нефракционированный эндосперм вызывал деление клеток.

При приготовлении твердых питательных сред для поверхнос­тного выращивания каллусных тканей используют очищенный агар-агар — полисахарид, получаемый из морских водорослей. В качестве примеров в табл. 6.2 приведены составы наиболее рас­пространенных питательных сред.

Среда Мурасиге и Скуга — самая универсальная. Она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Так, изменение соотношения ауксина и кинетина при­водит к образованию либо корней (преобладание ауксина), либо стеблевых культур (преобладание кинетина).

Среда Гамборга и Эвелега хорошо подходит для культивирова­ния клеток и тканей бобовых растений и злаков, среда Уайта обес­печивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации, а среда Нича и Нич пригодна для индукции андрогенеза в культуре пыльников.

Физические факторы. На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы — свет, температура, аэрация, влажность.

Свет. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях слабого освещения или в темноте, так как они не способны фото-синтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторичного синтеза.

В качестве источника света используют люминесцент­ные лампы. Для большинства травянистых растений оптимум ос­вещенности составляет примерно 1000 люкс. Слишком низкая (300 люкс) или высокая (3000—10 000 люкс) освещенность подавляет рост. Освещение может влиять на метаболизм каллусных клеток. Так, в культурах чайного растения под действием света увеличивался биосинтез полифенолов. Напротив, в культуре клеток Scopolia parviflora свет подавлял образование алкалоидов. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенно­сти влияет качество света. Так, более 20 флавонов и флавоноловых гликозидов образуется в культурах клеток петрушки после освеще­ния ее непрерывным люминесцентным светом «холодный белый». Вместе с тем синтез флавоновых гликозидов активируется при по­следовательном облучении ультрафиолетовым светом, а затем све­том, лежащим в области «красный—длинноволновый красный».

Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. В то же время каллусы и культуры клеток диоскореи дельтовидной хорошо растут даже при температуре 32 °С. В отличие от роста культур клеток и тканей индукция их морфоге­неза требует более низких температур (18 — 20 °С). Влияние тем­пературы на метаболизм клеток in vitro изучено слабо. Есть дан­ные, что в каллусных культурах максимальное образование алка­лоидов наблюдалось при температуре 25 °С, а при повышении тем­пературы резко снижалось. В суспензионных культурах клеток Ipomoea содержание жирных кислот значительно увеличивалось, если их выращивали при субоптимальных температурах роста (15 °С). Поэтому при выращивании культуры in vitro необходимо тща­тельно изучать влияние всех абиотических факторов, в том числе температурного, на рост и метаболизм клеток.

Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом куль­тивируемых клеток в больших объемах ферментеров.

При сравнении разных типов ферментеров было показано, что синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре был наи­большим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.

Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60 — 70%.

Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от мно­гих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо изве­стно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необ­ходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических фак­торов на рост и физиологические характеристики этой культуры.