ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУР ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Помимо фундаментальных исследований метод культуры изо­лированных тканей широко используется в сельском хозяйстве и промышленном производстве (рис. 7.5). Примером может служить массовое клональное микроразмножение плодовоовощных и де­коративных растений, а также их оздоровление от вирусных и других инфекций. С помощью культуры in vitro можно расширить возможности селекционной работы: получать клоны клеток, а за­тем и растения с запрограммированными свойствами. Благодаря способности клеток синтезировать в культуре вторичные метабо­литы возникла отрасль промышленности, осуществляющая био­логический синтез веществ, необходимых человеку.

Синтез вторичных метаболитов

В настоящее время известно примерно 2-10⁴ синтезируемых ра­стениями веществ, которые используются человеком, и их коли­чество постоянно увеличивается. Растения всегда служили источ­ником пищи, эфирных масел, красителей и, конечно же, лекар­ственных соединений. Так, мак снотворный (Papaver somniferum) является источником болеутоляющего вещества — кодеина; из на­перстянки (Digitalis lanata) получают дигоксин, тонизирующий сер­дечную деятельность; из хинного дерева (Cinchona ledgeriana) — антималярийное средство «хинидин». Особое место занимают нар­котики и стимулирующие вещества. В небольших, строго контро­лируемых количествах их используют в медицине. Однако при систематическом употреблении низких концентраций наркотиков возникают наркозависимость и стремление к увеличению упот­ребляемой дозы. Применение высоких концентраций наркотика убивает человека. Наиболее известны опиум и героин из Papaver somniferum, кокаин из Erythroxylon, никотин из различных сортов табака. Наиболее известный стимулятор — кофеин, содержащий­ся в растениях чая и кофе. Стимуляторы не токсичны в концент­рациях, рекомендуемых к применению. Однако высокие их кон­центрации негативно влияют на сердечно-сосудистую и нервную систему человека.

Большой интерес вызвало открытие пиретринов, выделенных из цветков Chrysanthemum cinerariaefolium. Эти вещества — мощ­ные инсектициды. Особая их ценность заключается в том, что пиретрины не вызывают привыкания у насекомых, а также не проявляют кумулятивного токсического эффекта.

Способность интактных растений синтезировать различные со­единения привела к предположению, что тем же свойством будут обладать клетки и ткани этих растений, выращиваемые в стериль­ных условиях. Для некоторых культур это оказалось справедливым. Но в отдельных случаях клетки либо не проявляли способности к синтезу необходимых веществ, либо синтезировали их в мини­мальных количествах. Понадобились долгие эксперименты по под­бору питательных сред, условий культивирования, исследованию новых штаммов, полученных благодаря генетической гетерогенности каллусных клеток или применению мутагенных факторов, чтобы добиться серьезных успехов в этой области.

В настоящее время промышленный синтез вторичных метабо­литов — очень перспективное направление. Синтез вторичных метаболитов происходит главным образом в суспензионной куль­туре клеток, в регулируемых условиях, поэтому он не зависит от климатических факторов, от повреждения насекомыми. Культуры выращивают на малых площадях в отличие от больших массивов плантаций с необходимыми растениями. Культуры клеток расте­ний могут синтезировать практически все классы соединений вто­ричного обмена, причем довольно часто в количествах, в несколько раз превышающих их синтез в целых растениях. Например, выход аймалицина и серпентина в культуре клеток Catharanthus roseus составляет 1,3 % сухой массы, а в целом растении — 0,26 %. В культуре клеток Dioscorea deltoidea диосгенин синтезируется в количестве 26 мг на 1 г сухой массы, а в клубнях растений его содержание составляет 20 мг на 1 г сухой массы. Кроме того, в культурах кле­ток может начаться синтез веществ, не характерных для исходно­го растения, либо расширяется набор синтезируемых соединений. В ряде случаев в клеточной культуре образуются вещества, кото­рые синтезировались интактным растением на ювенильной фазе развития, либо вещества, содержавшиеся в клетках филогенети­чески более ранних групп растений. Так, в культуре клеток Papaver bracteatum содержится сангвирин, характерный для ювенильных растений, и отсутствует тебаин, синтезируемый взрослыми рас­тениями. А в культуре клеток живокости (Delphinium) синтезиру­ются А-стерины, присутствующие у архаичных групп растений.

Синтез вторичных соединений может коррелировать с процес­сом дифференцировки в культуре клеток. Например, в суспензион­ной культуре Papaver somnifemm максимальный синтез алкалоидов начинается после того, как в ней дифференцируется достаточно большое количество специализированных клеток млечников, пред­назначенных для депонирования метаболитов. С другой стороны, культуры клеток табака и моркови синтезируют большое количе­ство никотина и антоцианина соответственно, хотя их клетки сла­бо дифференцированы. Не существует также однозначного ответа на вопрос, как связан синтез вторичных метаболитов с ростовыми процессами. У большого числа культур вторичные метаболиты син­тезируются и накапливаются в значительных количествах либо во время экспоненциальной фазы, когда ростовые процессы особен­но активны, либо в период стационарной фазы роста культуры клеток, когда прирост клеточной массы прекращается. Однако есть культуры, например культура клеток Catharanthus roseus, у которых синтез вторичных метаболитов сопровождает весь период роста.

Важная особенность культивируемой популяции клеток — ее стабильность в отношении синтеза и накопления продуктов вторичного синтеза. Так, в отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН под руководством Р. Г. Бутенко были получены разные штаммы клеток Dioscorea deltoidea, в том числе штамм-сверхпро­дуцент ИФР ДМ-0,5. Все эти штаммы сохраняли стабильность в отношении синтеза фуростаноловых гликозидов около 26 лет. Интересная особенность большинства клеток в культуре состоит в том, что обычно эти клетки не транспортируют синтезируемые метаболиты в питательную среду или другие клетки, хотя некото­рые культуры составляют исключение, в частности культура кле­ток мака, которые депонируют алкалоиды в млечники. Синтез вто­ричных метаболитов в культивируемых клетках связан с внутри­клеточными органеллами, в основном с пластидами и эндоплазматическим ретикулумом. В клетках, не способных к транспорту метаболитов, продукты вторичного синтеза обычно накапливают­ся в вакуолях и свободном пространстве (СП) клеток (табл. 6.3). На синтез вторичных метаболитов влияет целый ряд факторов. Прежде всего выход продукта зависит от генотипа растения-до­нора. Показано, что культуры клеток, полученных от высокопро­дуктивных растений, продуцировали большее число метаболитов. Другой важный фактор — состав питательной среды и концентра­ция ее компонентов, которые должны обеспечивать, с одной сто­роны, увеличение количества клеток-продуцентов, с другой —усиливать сам процесс синтеза. На рост, т.е. на увеличение био­массы, существенно влияет природа и количество углеводов, со­единений азота и фосфора, на синтез метаболитов — природа и концентрация фитогормонов. Так, при замене одного ауксина на другой, например нафтилуксусной кислоты на 2,4-D, трехкратно увеличился синтез антрахинона суспензионной культурой Morinda citrifolia.

Таблица 7.3. Внутриклеточная локализация синтеза и накопления вторичных метаболитов (по Р.Г.Бутенко, 1999)

Очень большое влияние на рост суспензионной среды оказывает ее непрерывное перемешивание, которое обеспечивает хорошую аэрацию и предотвращает осаждение клеток. В лабораторных условиях перемешивание достигается благодаря использованию качалок или роллерных установок. При промышленном выращи­вании суспензионных культур применяют специальные системы, в которых идут увеличение биомассы и синтез вторичных соеди­нений, — биореакторы. Эти системы обладают важными преиму­ществами: возможностью управлять процессом культивирования на основе показаний датчиков; кроме того, большой объем куль­тивируемого материала позволяет забирать значительные пробы, при этом стрессовые реакции у культуры клеток не возникают. В зависимости от способа перемешивания культуральной жидкости биореакторы делят на две группы.

Первая группа включает биореакторы, в которых суспензион­ная культура перемешивается только за счет подачи воздуха; во второй группе биореакторов культура перемешивается механичес­ким способом (рис. 7.6).

Выращивание культур растительных клеток в биореакторах про­водят в двух режимах. Первый режим — периодическое культивирование — заключается в том, что по окончании процесса откачи­вают и используют всю суспензию клеток. При втором режиме — проточное культивирование — в биореактор постоянно добавля­ют свежую питательную среду и одновременно отбирают тот же объем либо суспензии (открытое проточное культивирование), либо одной отработанной питательной среды, оставляя клетки в реакторе (закрытое проточное культивирование).

Существуют две разновидности открытого культивирования. Первая — турбидостат — подразумевает измерение и автомати­ческое поддержание концентрации клеточной биомассы в реак­торе на одном уровне путем изменения скорости протока. Вторая разновидность — хемостат — заключается в подаче в биореактор с постоянной скоростью питательного раствора при одновремен­ном откачивании с той же скоростью клеточной суспензии.

Существует еще одна современная технология получения вто­ричных метаболитов с помощью иммобилизованных клеток куль­туры, т. е. помещение их в определенный носитель или адсорбция в нем. Носитель с клетками помещают в питательную среду. Клет­ки остаются живыми. Они прекращают рост, но продолжают син­тез метаболитов, выделяя их в среду.

Довольно часто синтез вторичных метаболитов в суспензион­ной культуре останавливается на промежуточных этапах, не дохо­дя до необходимого продукта. Получение продукта возможно бла­годаря процессу биотрансформации. Сущность его состоит в из­менении промежуточных метаболитов с помощью культур других растений или клеток бактерий. Биотрансформация очень эффек­тивна в бактериальных клетках, поэтому растительные клетки используют, когда процесс не осуществляется в клетках микро­организмов. Вводимые в эти культуры вещества могут подвергать­ся гидроксилированию, эпоксидированию, глюкозилированию, этерификации, а также присоединяться к аминокислотам. Напри­мер, культура клеток женьшеня корневого происхождения спо­собна трансформировать (гликозилировать) фенольные соедине­ния — продукты деятельности суспензионной культуры клеток корня Рапах ginseng. Культуры клеток лебеды и картофеля могут биотрансформировать индолил-3-уксусную кислоту в индолил-3-ацетил-Ь-аспарагиновую кислоту (Н.И.Рекославская и др., 1991).

Еще один пример — биотрансформация карденолидов, гликозиды которых используют в медицине для лечения болезней сердца. Растения наперстянки {Digitalis lanata) в большом количестве синте­зируют дигитоксин вместо необходимого дигоксина. Для соответ­ствующей биотрансформации с успехом используют недифферен­цированную суспензионную культуру наперстянки. Иммобилизо­ванные клетки этой культуры способны долгое время с постоян­ной скоростью трансформировать бета-метилдигитоксин в р-метил-дигоксин (А.В.Альферманн и др., 1987).

Таким образом, использование суспензионных культур для син­теза вторичных метаболитов в промышленных масштабах имеет большие перспективы, и не только с точки зрения экономичес­кой выгоды получения более дешевой продукции в запланиро­ванных количествах. Важно, что использование культуры клеток спасет от уничтожения тысячи дикорастущих растений, ставших уже редкими, которые синтезируют необходимые человеку веще­ства. Увеличение выхода продукта может быть достигнуто благода­ря дальнейшей исследовательской работе по селекции специали­зированных популяций клеток и оптимизации условий культиви­рования. Большой интерес представляет также дальнейшее разви­тие методов биотрансформации метаболитов и иммобилизации культивируемых клеток.

Биотехнологии в сельском хозяйстве

Ускорение и облегчение селекционного процесса, а также создание растений с новыми качествами — это направления, которые достаточно успешно развиваются с помощью технологий кле­точной инженерии, культуры клеток и тканей.

Две группы методов, благодаря которым развиваются данные направления, представлены в табл. 7.4.

Некоторые из указанных технологий стали традиционными, другие находятся на начальных этапах разработки. Наконец, есть такие методы, которые явно вышли из ранга вспомогательных, ускоряющих селекцию технологий. К ним можно отнести криосохранение генофонда — технологию, в настоящий момент при­обретшую экологическую направленность; или клональное мик­роразмножение растений, тесно связанное с проблемой их оздо­ровления от вирусных и других инфекций. Поэтому обзор этих технологий вынесен за рамки данного раздела.

Технологии, облегчающие селекционный процесс. Одна из наи­более важных технологий этой группы — оплодотворение in vitro, помогающее предотвратить прогамную несовместимость, которая может быть вызвана следующими причинами:

1. генетически детерминированное (определенное) несоответ­ствие секрета рыльца материнского растения и пыльцы отцов­ского, которое тормозит рост пыльцевых трубок на рыльце пес­тика;
2. несоответствие длины столбика пестика и пыльцевой труб­ки, в результате чего пыльцевая трубка не достигает семяпочки(гетеростилия)
3. тканевая несовместимость партнеров, приводящая к оста­новке роста пыльцевой трубки в любой момент ее прорастания от рыльца пестика до микропиле семяпочки (гаметофитный тип не­совместимости)

Таблица 7.4 Клеточные технологии в селекции растений (по Р. Г. Бутенко, 1999)

Преодоление прогамной несовместимости возможно благода­ря выращиванию в стерильных условиях изолированной завязи с нанесенной на нее пыльцой или изолированных кусочков пла­центы с семяпочками, рядом с которыми или непосредственно на ткани которых культивируется пыльца.

Значительным препятствием для селекции служит также постгамная несовместимость, вызванная разновременным развитием зародыша и эндосперма при отдаленной гибридизации. В резуль­тате образуются невсхожие щуплые семена. Получить растение из таких семян можно только при использовании метода эмбриокультуры, т. е. выращивания изолированного зародыша на искусствен­ной питательной среде in vitro. Метод эмбриокультуры широко применяют при межвидовой гибридизации овощных растений, для микроразмножения ценных гибридов, для клеточной селекции.

Большое значение имеет создание гаплоидов, позволяющее ус­корить процесс селекции в 2 — 3 раза. Использование гаплоидных клеток и гаплоидных растений способствует обнаружению эксп­рессии введенного в клетку генома, редких рекомбинаций, ре­цессивных мутаций, которые в диплоидных растениях, как правило, маскируются доминантными генами. Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь, они образуют гибрид­ные клетки и растения с диплоидным числом хромосом. Обраба­тывая гаплоидные клетки колхицином, можно добиться удвоения числа хромосом и получить диплоидные гомозиготные растения. Все это значительно облегчает выявление и стабилизацию необ­ходимых признаков. Кроме селекции гаплоиды применяются так­же в генно-инженерных исследованиях. Впервые возможность по­лучения спонтанных гаплоидов при аномальном развитии пыль­ников, пыльцы и других объектов была показана в 1964 г. С. Гуха и С. Магешвари. В настоящее время в культуре гаплоидные растения получают из изолированных пыльников (андрогенез), изолиро­ванных семяпочек (гиногенез); из гибридного зародыша, у которого в результате несовместимости потеряны отцовские хромосомы (партеногенез). Новые сорта ячменя — Исток и Одесский-15 — были выведены благодаря комбинации партеногенетического метода с культурой изолированных зародышей за 4 года вместо 10—12 лет, необходимых для обычной селекции.

Создание генетического разнообразия исходных форм растений и скрининга генотипов. Сомаклональная изменчивость — прекрас­ный источник генетического разнообразия (сомаклональных ва­риаций), которое может быть реализовано в создании генетичес­ки измененных растений-регенерантов с новыми свойствами (сомаклональные варианты, или сомаклоны). Помимо повышения ге­нетического разнообразия, использование сомаклональных ва­риантов в 2 раза может ускорить процесс выведения нового сор­та даже для размножаемых семенами растений. Первые сомаклональные варианты табака были получены в Институте физиоло­гии растений им. К.А.Тимирязева (Н.А.Загорина, З.П.Шамина, 1970).

Сомаклональные вариации нельзя рассматривать как случай­ные спонтанно возникающие мутации. Генетические изменения, характерные для сомаклональных вариаций, сложны и носят ком­плексный характер. Частота таких генетических изменений на три порядка превышает частоту спонтанных мутаций. Кроме того, сома­клональные варианты отличаются от исходного растения не толь­ко качественными моногенными признаками, но и количествен­ными — полигенными (интенсивность роста, продуктивность, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды).

Отмечены случаи появления сомаклональных вариантов, сочетающих признаки, которые невозможно или трудно соеди­нить в одном генотипе традиционным селекционным путем. Так, Л.А.Кучеренко (1986) выделила из сомаклональных вариантов, возникших в каллусной культуре риса, растения, сочетавшие ско­роспелость и длиннозерность. На их основе за короткий срок был создан новый сорт риса.

По-разному сказываются на генетических изменениях и, следо­вательно, на появлении сомаклональных вариаций различные типы морфогенеза. Экспериментально установлено, что при соматичес­ком эмбриогенезе цикл «клетка—растение» совершается значи­тельно быстрее, чем при органогенезе. Поэтому степень различия между полученным и исходным родительским генотипом в случае органогенеза может быть значительно выше, чем при эмбриоге­незе.

Источником генетического разнообразия растительного мате­риала могут быть не только сомаклональные вариации, но и му­тагенез, в несколько раз повышающий образование стабильно устойчивых по искомым признакам клонов клеток.

После получения различных сомаклональных вариаций от ис­ходного растения наступает следующий этап — отбор необходи­мых сочетаний признаков. Данный вопрос решается с помощью клеточной селекции, которую проводят практически на любом объекте, введенном в культуру in vitro. Однако удобнее использо­вать суспензионную культуру или изолированные протопласты. Преимущество этих объектов состоит в быстром росте культуры и равномерном действии селективного фактора на все клетки. Для отбора сомаклональных вариаций соответствующие селективные факторы (соли в высоких концентрациях, гербициды и др.) до­бавляют в питательную среду для выращивания культуры клеток либо растущие культуры помещают в селективные условия (низ­кая или высокая температура, освещенность и т.д.). Существует несколько методов клеточной селекции:

1. Прямая (позитивная) селекция, при которой выживает только заданный тип мутантных клеток.
2. Непрямая (негативная) селекция, которая ведет к гибели деля­щихся клеток дикого типа и выживанию метаболически неактив­ных клеток. Этот прием требует дополнительной идентификации мутационных изменений у выживших клеток.
3. Тотальная селекция, при которой индивидуально тестируют­ся все клеточные клоны.
4. Визуальная селекция и неселективный отбор, когда необхо­димая вариантная линия выбирается среди прочих визуально или с помощью биохимических методов.

Для отбора клеток, устойчивых к неблагоприятным или стрес­совым факторам, наиболее часто применяют прямую селекцию. После выбора нужной популяции необходимо проверить стабиль­ность устойчивости к неблагоприятному фактору. Это длительный процесс, включающий многочисленные циклы выращивания и пересадки клеток на среды, содержащие селективный фактор или без него. Из стабильных клонов необходимо попытаться регенери­ровать растения. Получение растений-регенерантов, а также гиб­ридологический анализ подтверждают генетическую природу признака, а не адаптационный его характер. Следует, однако, отме­тить, что кропотливая работа по клеточной селекции не всегда приводит к нужному результату. Это связано с различием меха­низмов клеточной устойчивости и устойчивости растений. Либо клеточная устойчивость может быть только частью общего меха­низма, работающего в целом растении, как это наблюдается при создании устойчивости к засолению. Вместе с тем механизмы ус­тойчивости к низким температурам, гербицидам, высоким кон­центрациям алюминия имеют, по-видимому, сходный характер у клеток и у целых растений. В последнем случае есть возможность получить из устойчивых клеточных популяций растение-регенерант, устойчивое к тому же фактору. Затем из большого числа сомаклонов отбирают и проверяют в полевых условиях на ста­бильность те, которые имеют хозяйственно важные признаки, восполняющие отдельные недостатки исходного сорта. Так, после трехлетних полевых испытаний сомаклонов сорта Любимец уда­лось выделить линии, превосходящие сорт по урожайности, ус­тойчивости к фитофторе и степени зараженности вирусами.

Метод негативной селекции используется главным образом для выявления мутантов, ауксотрофных в отношении аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, витаминов и других важ­ных метаболитов (Ю.Б.Долгих, З.П.Шамина, 1982). Ауксотрофные мутанты очень ценны для фундаментальных исследований механизмов генной регуляции синтеза этих веществ в клетке и в растении.

Гибридизация соматических клеток осуществляется благодаря слиянию протопластов, изолированных из соматических клеток растений, и служит для создания новых генотипов, новых форм растений. Использование изолированных протопластов позволяет решать множество теоретических и практических задач. С их помо­щью можно вести селекцию на клеточном уровне, работать в ма­лом объеме с большим числом индивидуальных клеток, осуще­ствлять прямой перенос генов, изучать мембраны, выделять пла­стиды. Протопласты непременно участвуют в соматической гиб­ридизации. Термин «соматическая гибридизация», означающий процесс слияния протопластов соматических клеток, был введен Дж. Мельхерсом в 1974 г.

Соматическая гибридизация имеет важные особенности. Во-первых, этому процессу доступны практически любые скрещива­ния, перенос генов на далекие таксономические расстояния. Во-вторых, слияние протопластов способствует объединению цитоплазматических генов родительских клеток, чего не бывает при скрещивании половых клеток.

Самопроизвольное слияние протопластов происходит достаточ­но редко. Механизм этого процесса до конца не выяснен. Однако известно, что протопласты имеют отрицательный поверхностный заряд, который вызывает их взаимное отталкивание. Для слияния это отталкивание необходимо преодолеть специальными приема­ми, способствующими снятию или перераспределению поверх­ностного заряда мембран. Впервые искусственное слияние прото­пластов с помощью индуктора слияния (фьюзогена) было осу­ществлено в 1970 г. Коккингом и его сотрудниками. В настоящее время в качестве эффективных фьюзогенов используют полиэтиленгликоль (ПЭГ) и растворы с рН 9 —11 и высокой концентра­цией ионов кальция. Согласно одной из гипотез, объясняющих сли­яние протопластов при использовании ПЭГ, высокая концентра­ция этого вещества (20 — 30 %) способствует поглощению всей сво­бодной воды между протопластами, вызывая их слипание в резуль­тате дегидратации. Кроме того, поглощение свободной воды инду­цирует образование пор в мембране, через которые перетекает внут­риклеточное содержимое. Если повреждения мембран обратимы, слипшиеся протопласты регенерируют клеточную стенку (рис. 7.7). Кроме того, существует физический фактор — импульсы элек­трического тока, который также заставляет протопласты сливать­ся. Обработка электрическими импульсами, как и обработка ПЭГ, приводит к обратимому повреждению мембран. Применение пе­ременного тока вызывает диэлектрофорез, и протопласты, нахо­дящиеся между электродами, выстраиваются в ряд, примыкая друг к другу своими полярными поверхностями. Импульс постоянного тока приводит к образованию пор, через которые происходит сли­яние (рис. 7.8).

При соматической гибридизации развиваются клетки двух ти­пов: гибриды и цибриды. При образовании гибридов объединяет­ся ядерный геном обеих клеток. Цибридная клетка содержит ци­топлазму обоих партнеров, а ядро — одного. Такой результат дос­тигается при деградации одного из ядер после слияния или в том случае, если один из протопластов был лишен ядра.

Первый неполовой гибрид высших растений был получен в 1972 г. при слиянии изолированных протопластов двух видов таба­ка: Nicotiana glauca и Nicotiana langsdorfii. В настоящее время полу­чено много межвидовых, межсемейственных и межтрибных гиб­ридов, значительную часть которых нельзя считать нормальными растениями, а некоторые гибриды (гибрид арабидопсиса и тур­непса) представляют собой растения-монстры. Возникающие ано­малии — результат хромосомной несбалансированности. Описаны случаи возникновения гибридов между протопластами эритроци­тов крысы и дрожжевых клеток, моркови и человека и др. Любые исследования, любые манипуляции в области создания новых ге­нотипов должны быть тщательно и всесторонне продуманы, а ученые должны помнить об ответственности и научной этике. Профессор Колумбийского университета Э.Чаргафф предупреж­дал о том, что «в тысяче опытов, вероятно, ничего не случится, но затем в одном каком-то случае произойдет нечто очень непри­ятное». Он был «убежден, что именно попытка преобразовать или перехитрить природу почти привела к ее гибели».

Введение в протопласты макромолекул, клеточных органелл и бактериальных клеток. Чужеродный генетический материал мож­но переносить в клетку не только при соматической гибридиза­ции, но и при непосредственном введении ДНК или органелл, содержащих ДНК, в изолированные протопласты. Работы в этом направлении начаты не так давно, но уже получены интересные результаты. Так, поглощение экзогенных макромолекул ДНК по­казано у протопластов петунии, сои, моркови. Проведена транс­плантация органелл (ядер, митохондрий, хлоропластов) в про­топласты растений. Наибольшую важность представляют опыты по трансплантации хлоропластов одних растений в клетки других. П.Карлсон провел опыты по введению хлоропластов нормально­го зеленого растения Nicotiana suaveolens в протопласты пестроли­стного мутанта N. tabacum. В результате культивирования прото­пластов были получены зеленые каллусы, из которых регенери­ровали растение, оказавшееся пестролистным. Для того чтобы понять, содержит растение-регенерант элементы геномов двух видов Табаков или только одного, проанализировали белковую фракцию I, в которую входит ключевой фермент цикла Кальви­на — рибулозодифосфаткарбоксилаза (РДФ-карбоксилаза). Этот фермент состоит из двух больших субъединиц и двух малых. Боль­шие субъединицы кодируются геномом хлоропластов, малые — ядерными генами. Анализ состава белковой фракции I растения-регенеранта показал присутствие полипептидов, характерных и для пластид N. tabacum, и для пластид N. suaveolens. Перспектив­ность работ по трансплантации хлоропластов заключается в том, что введение высокоэффективных хлоропластов может способство­вать активации фотосинтеза и повышению продуктивности дру­гих растений.

Среди бактериальных клеток к созданию искусственных ассо­циаций с растительными клетками наиболее способны цианобактерии. Это может быть связано с тем, что они часто вступают в симбиотические отношения с другими организмами; что древние цианобактерии, вероятно, участвовали в формировании расти­тельных клеток в процессе эволюции; что цианобактерии способ­ны выделять в среду разнообразные вещества: углеводы, амино­кислоты, вещества гормональной природы и другие, которые могут быть использованы культивируемыми клетками растений. Расти­тельные клетки способны потреблять кислород, образующийся в процессе фотосинтеза цианобактерии, а цианобактерии потреб­ляют диоксид углерода, выделяемый растительными клетками при дыхании. Кроме того, азотфиксирующие цианобактерии могут накапливать азот в почве и обеспечивать до 15 % потребностей растений в нем. Например, симбиоз папоротника Azolla с Anabaena azollae применяют в сельском хозяйстве в качестве источника свя­занного азота на рисовых полях.

Большой интерес вызывает тот факт, что цианобактерий могут выступать в качестве фототрофного компонента ассоциаций с расти­тельными клетками. Использование питательных сред, в которых не хватает источника углерода, показало, что прирост раститель­ных клеток может быть обеспечен за счет усвоения ими продуктов фотосинтеза цианобактерий или их лизиса. Однако не все сочета­ния растений и цианобактерий оказывают взаимное благотворное влияние. Выявлена видовая специфичность взаимодействия партне­ров. Так, клетки культуры мака и Anabaena variabilis взаимно подав­ляли рост друг друга. В то же время на рост культивируемых клеток табака, женьшеня, диоскореи цианобактерий оказывали стимули­рующее влияние. В большинстве случаев существенное влияние од­ного партнера на ростовые процессы другого не выявлялось.

Совместное выращивание растительных клеток и цианобакте­рий имеет еще одну важную особенность. На дефицитной среде оно может приводить к увеличению синтеза вторичных метаболитов по сравнению с их накоплением в монокультуре на полной среде.

Введение азотфиксирующих цианобактерий в культуру расти­тельных клеток могло бы наряду с применением методов генной инженерии решить проблему азотфиксации. Показано, что в сме­шанных культурах каллуса табака и цианобактерий на среде Му-расиге и Скуга формировались побеги регенерантов табака с уча­стками сине-зеленого цвета, где локализовались цианобактерий. Вероятно, большие межклетники в каллусах табака способствуют проникновению цианобактерий сначала в межклетники каллус-ной ткани и в область меристемоидов, а затем — в формирующи­еся побеги. Цианобактерий сохранялись на поверхности и в тка­нях стебля и листьев при многочисленных пересадках, образова­нии вторичных каллусов и последующей регенерации из них по­бегов, т. е. образовывалась устойчивая ассоциация растительной и бактериальной клетки. Азотфиксирующие цианобактерий обеспе­чивали рост растительных клеток в суспензионных и каллусных смешанных культурах на питательных средах, дефицитных по азо­ту, а в ассоциациях с растениями — ив песчаной культуре, не содержащей связанного азота. Это действие обеспечивается, по-видимому, за счет продуктов азотфиксации, выделяющихся в среду. В свою очередь, цианобактерий могут получать от растений угле­воды. Причем цианобактерий, предварительно культивируемые с растительными клетками, получают от побегов в 2,5 раза больше меченых соединений углерода по сравнению с цианобактериями, взятыми из чистой культуры. В результате такого потребления ра­стение-хозяин может значительно снизить интенсивность собствен­ных ростовых процессов. Поэтому прежде чем приступить к практическому использованию искусственных ассоциаций, необходи­мо решить проблему обеспечения азотфиксирующего симбионта органическими веществами без нанесения существенного ущерба растению.

Клоналыюе микроразмножение и оздоровление растений

Клональным микроразмножением называют неполовое раз­множение растений с помощью метода культуры тканей, позво­ляющее получать растения идентичные исходному. В основе по­лучения таких растений лежит способность соматических клеток растений полностью реализовывать свой потенциал развития, т.е. свойство тотипотентности. Метод клонального микроразмно­жения получает все более широкое распространение во всем мире. В большинстве стран эта технология приобрела коммерческий ха­рактер.

В России первые работы по клональному микроразмножению были проведены в 60-х годах XX в. в лаборатории Р. Г. Бутенко (Институт физиологии растений им. К. А.Тимирязева). В настоя­щее время созданы и развиваются лаборатории клонального мик­роразмножения, связанные с нуждами селекции, размножением декоративных, лекарственных и других растений. Кроме того, тех­нология используется для размножения лучших экземпляров взрос­лых лесных деревьев, особенно хвойных, для сохранения редких и исчезающих видов растений.

Свое название эта технология размножения получила от тер­мина «клон» (от греч. clon — отпрыск), который предложил Веб-бер в 1903 г. Клональное микроразмножение имеет существенные преимущества перед традиционными способами размножения:

1. Высокий коэффициент размножения. Одно растение герберы за год при микроклональном размножении дает до 1 млн новых растений, тогда как при обычных способах размножения — толь­ко 50 — 100 растений. Большинство культивируемых в настоящее время сортов лилий размножается только вегетативно. Луковички возникают на материнских луковицах или на побеге в небольших
   количествах. Технология микроклонального размножения позво­ляет получить из одной чешуи луковицы за 6 месяцев 10⁵ новых растений (сорт Red Carpet).
2. Получение генетически однородного посадочного материала.
3. Возможность оздоровления растений, освобождения их от вирусов благодаря клонированию меристематических тканей.
4. Возможность размножения растений, которые в естествен­ных условиях репродуцируются с большим трудом.
5. Воспроизведение посадочного материала круглый год, что значительно экономит площади, занимаемые маточными и раз­множаемыми растениями.

6. Сокращение продолжительности селекционного периода, ус­корение перехода растений от ювенильной фазы развития к реп­родуктивной.

Технология микроклонального размножения. Обязательное ус­ловие клонального микроразмножения — использование объек­тов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса, от экспланта до растений в поле. Такому требо­ванию удовлетворяют апексы и пазушные почки органов стебле­вого происхождения, т. е. меристематические ткани. Их устойчи­вость к генетическим изменениям, вероятно, связана с высокой активностью систем репарации ДНК, а также с негативной се­лекцией измененных клеток.

Процесс клонального микроразмножения можно подразделить на 3 этапа:

1. Получение хорошо растущей стерильной культуры. На этом этапе необходимо правильно выбрать растение-донор, получить свободную от инфекции культуру, добиться ее выживания и быс­трого роста на питательной среде.
2. Собственно размножение, осуществляемое несколькими спо­собами:

• активизация пазушных меристем;
• индукция образования адвентивных почек тканями листа, стеб­ля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем и зачатками соцветий без первоначального образования каллусной ткани;
• микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доминирование;
• стимуляция образования микроклубней и микролуковичек; индукция соматического эмбриогенеза.

3. Подготовка к высадке в поле или к реализации. Это очень важный этап, во время которого в теплице укорененные растения, полученные in vitro, адаптируют к новым условиям внешней
среды: проводят закаливание растений, повышают их устойчи­вость к патогенным микроорганизмам и различным неблагопри­ятным факторам внешней среды. Существует много различных
способов адаптирования растений к пересадке in vivo. Это под­бор почвенного субстрата, создание определенной влажности, обработка химическими веществами (глицерин, парафин) для
предотвращения обезвоживания листьев. Некоторые древесные ра­стения лучше приживаются, если их заразить in vitro микоризообразующими грибами (Е.А.Калашникова, 1993). Упрощенный спо­соб адаптации пробирочных растений винограда был разработан в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Адап­тацию проводят прямо в пробирках, снимая с них пробки, когда
растения винограда дорастают до верха пробирки. Через 1,5 — 2 недели, когда верхушки побега с двумя развитыми листьями по­являются над пробиркой, растение готово к пересадке в почву.

Для предотвращения механических повреждений корневой систе­мы растение пересаживают в почву вместе с агаром, заглубляя его так, что над поверхностью почвы остаются только 2 развитых листа, которые выросли из пробирки и уже адаптировались к вне­шним условиям. Такая методика позволяет значительно упростить, ускорить и удешевить этап акклиматизации растений.

Клональное микроразмножение растений проводят разными способами.

Первый и основной способ — активизация пазушных меристем. Он состоит в снятии апикального доминирования и активизации развития меристем, существующих в растении. Этот способ основной и в обычном вегетативном размножении. И на интактном растении, и в случае клонирования снятие апикально­го доминирования достигается или удалением апикальной мери­стемы побега, или благодаря действию цитокинина. При клони­ровании цитокинины (6-бензиламинопурин, 6-фурфуриламино-пурин, зеатин) добавляют в питательную среду, что приводит к развитию многочисленных пазушных побегов. Эти побеги отделя­ют от первичного экспланта и культивируют на свежей питатель­ной среде. Активизацию пазушных меристем широко используют в промышленном размножении овощных сельскохозяйственных культур (картофель, томаты, огурцы, сахарная свекла, топинам­бур и др.), цветов (гвоздика, роза, гербера), плодовых и ягод­ных культур (яблоня, вишня, малина, крыжовник и др.), древес­ных растений (туя, можжевельник и др.). Однако бесконечно раз­множать таким способом растения нельзя, поскольку длительное воздействие цитокининов, входящих в состав питательных сред, вызывает аномалии в морфологии стебля, потерю способности побегов к укоренению, иногда — гибель растений. В опытах с размножением земляники было показано, что при клонировании необходимо чередовать 2 — 3 цикла получения побегов с их укоре­нением.

Второй способ — индукция развития адвентивных почек, т. е. по­чек, возникающих из растительных клеток и тканей, которые их обычно не образуют. Этот метод в значительной мере обусловлен тотипотентностью клеток. Почти любой орган или ткань расте­ния, свободные от инфекции, могут быть использованы в каче­стве экспланта и в определенных условиях образуют адвентивные почки. Данный процесс вызывают внесением в питательную среду определенных концентраций цитокининов и ауксинов, причем цитокинина должно быть гораздо больше, чем ауксина. Это наи­более распространенный способ микроразмножения высших рас­тений. Развивая адвентивные почки на апикальных и пазушных меристемах, размножают растения томата, лука, чеснока; на сег­ментах листовых пластинок — салат, глоксинию, фиалки; на тка­нях донца луковиц — лук, чеснок, гладиолусы, тюльпаны и дру­гие луковичные растения.

Третий способ — микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доминирование. Растения-регенеранты, полученные любым другим способом, можно черенковать в стерильных усло­виях, высаживать на свежую питательную среду, укоренять и адаптировать к полевым условиям либо снова подвергать микро­черенкованию для того, чтобы увеличить количество посадочного материала.

Четвертый способ — размножение в биореакторах микроклуб­нями. Это один из способов ускоренного размножения оздоров­ленного материала. О. Мелик-Саркисов сконструировал гидропон­ную установку, позволяющую получать около 7000 микроклубней с 1 м² при массе одного клубня 5 г. Предусмотрена последующая механизированная посадка их в грунт. В отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К. А. Тимиря­зева РАН создана эффективная полупромышленная замкнутая си­стема пневмоимпульсного биореактора для получения микроклуб­ней картофеля, в которой предусмотрена возможность воздействия на направление и скорость процессов клубнеобразования. Техно­логии клонального микроразмножения в биореакторах разработа­ны не только для сельскохозяйственных, но и для декоративных растений (лилии, гладиолусы, гиацинты, филодендроны и т.д.). Однако созданные установки пока носят лабораторный, модель­ный характер.

Пятый способ размножения — образование соматических за­родышей — основан на морфогенных изменениях — соматичес­ком эмбриогенезе. Впервые это явление было отмечено в середине 50-х годов XX в. в культуре клеток моркови. Формирование эмб-риоидов в культуре осуществляется в два этапа. На первом сома­тические клетки дифференцируются в эмбриональные в присут­ствии в питательной среде ауксинов, обычно это 2,4-дихлорфе-ноксиуксусная кислота (2,4-D). На следующей стадии развива­ются эмбриоиды. Этот процесс идет только при значительном снижении концентрации ауксина или полном отсутствии его в питательной среде. Соматический эмбриогенез может происхо­дить в тканях первичного экспланта, в каллусной и суспензион­ной культурах.

Поскольку соматические зародыши представляют собой пол­ностью сформированные растения, данный метод позволяет со­кратить затраты, связанные с подбором условий укоренения и адаптации растений-регенерантов. Кроме того, преимущество по­лучения соматических эмбриоидов состоит в том, что при исполь­зовании соответствующей техники капсулирования из них можно получать искусственные семена.

Соматический эмбриогенез в настоящее время применяют для размножения пшеницы, ячменя, моркови, редиса, винограда, некоторых древесных растений (дуб, ель, эвкалипт).

Факторы, влияющие на клональное микроразмножение.

Пита­тельная среда. Состав питательной среды — один из наиболее важ­ных факторов при микроразмножении. Обычно используют стан­дартные среды: Мурасиге-Скуга, Нича и др., но с добавлением на каждом этапе различных веществ. На первом этапе в питатель­ную среду часто вносят антиоксиданты, чтобы предотвратить ги­бель клеток из-за активизации гидролитических ферментов. Осо­бое значение имеют концентрация и соотношение фитогормонов в среде. Например, на втором этапе для усиления морфогенеза обычно добавляют цитокинины. Напротив, на третьем этапе при укоренении в питательной среде должно быть только небольшое количество ауксинов (либо используется безгормональная среда). Иногда в среду добавляют гиббереллин (ГК), который стимули­рует рост сформировавшихся почек. Важным регуляторным фак­тором служит сахароза. Обычная концентрация ее в среде состав­ляет 3 %. На растениях каперса было показано, что более высокая концентрация сахарозы в среде приводила к образованию пур­пурных, содержащих антоциан, почек возобновления. При кон­центрациях сахарозы менее 3 % наблюдалось формирование зеле­ных почек, способных к размножению.

Кроме того, существенное значение имеет состояние среды. Например, культивирование меристем земляники, вишни, чер­ной смородины лучше происходит в жидкой питательной среде, чем в агаризованной.

Состояние экспланта. Морфогенез в значительной мере опре­деляется возрастом и размером экспланта. Так, у эхеверии экспланты из молодых листьев образуют корни, из старых листьев — побеги. И только у листьев среднего возраста возникают и побеги, и корни, т. е. появляется возможность регенерации целого расте­ния. Размер экспланта прямо пропорционально связан с регенерационной способностью: чем крупнее эксплант, тем выше эта спо­собность. Большие экспланты могут самопроизвольно независимо от соотношения в питательной среде ауксинов и цитокининов об­разовывать почки. Но увеличение размера может привести к нега­тивным последствиям, так как появляется вероятность присутствия в экспланте клеток, содержащих вирусную, грибковую и другие виды инфекции. Оптимальная величина экспланта должна обеспе­чивать как активный морфогенез, так и полную стерильность.

На регенерационную способность экспланта влияют также физиологическое состояние и таксономическая принадлежность растения-донора. Например, экспланты, выделенные из растений в фазу покоя, обладают более низкой способностью к укорене­нию и развитию побегов по сравнению с эксплантами, изолиро­ванными в фазу активного роста. Двудольные травянистые расте­ния характеризуются большей регенерационной способностью, чем однодольные.

Физические факторы. Большое значение для успешного клонального размножения имеют физические факторы — температура, условия освещения, качество света, влажность.

Для улучшения клонального микроразмножения физические факторы необходимо подбирать с учетом естественного ареала произрастания культивируемого растения. Так, для тропических растений оптимальная температура культивирования будет при­ближаться к 27 °С, для растений альпийских лугов — к 18 — 20 «С, для большинства растений — к 25 «С. Жизнеспособность эксплантов увеличивается, если в начале выращивания поддерживать бо­лее низкие температуры. Оптимальная интенсивность освещения для большинства растений составляет 1000 — 3000 лк в течение 14—16 ч в сутки.

Существенное значение для регуляции морфогенеза имеет каче­ство света. У микрочеренков березы красный свет способствовал 100 %-му укоренению, а синий — увеличивал содержание ЦК в тканях растений и таким образом стимулировал образование по­бегов.

Относительная влажность в камерах, где растут пробирочные растения, поддерживается на уровне 65 — 75 %. При пересадке в почву эти растения нуждаются в повышенной влажности, что при выра­щивании в камерах достигается созданием атмосферы «тумана».

Оздоровление посадочного материала начинается с момента стерилизации экспланта в асептических условиях бокса, с обра­ботки ткани антибиотиками. Однако таким образом удается осво­бодиться главным образом от бактерий, грибных инфекций, не­матод. Вирусы, вироиды, микоплазмы остаются в тканях инфици­рованных растений. Именно из-за вирусных болезней погибает от 10 до 50 % урожая сельскохозяйственных культур, размножающихся вегетативно. Некоторые бобовые растения (соя) могут передавать вирусы даже при семенном размножении.

В 1949 г. было выяснено, что клетки меристематических тканей растений обычно не содержат вирусов. В 1952 г. Дж. Морель и Г. Мар­тин предложили, используя культивирование меристем, получать здоровые, избавленные от вирусной инфекции растения. Они об­наружили, что при выращивании верхушки побега, состоящей из конуса нарастания и 2 — 3 листовых зачатков, на ней образуются сферические образования — протокормы. Протокормы можно де­лить, и каждую часть культивировать до образования корней и листовых примордиев, получая в большом количестве генетичес­ки однородные безвирусные растения. В настоящий момент куль­тивирование меристем побега — наиболее эффективный способ оздоровления растительного материала от вирусов, вироидов и микоплазм. Однако при этом способе требуется соблюдать опре­деленные правила. Как уже говорилось, чем меньше размер меристематического экспланта, тем труднее вызвать в нем морфогенез.

Чем больше размер экспланта, тем легче идет морфогенез, в ре­зультате которого получается целое растение, но тем больше ве­роятность присутствия вирусов в экспланте. У многих видов и сор­тов растений зона, свободная от вирусных частиц, различна. Так, при клонировании апикальной меристемы картофеля размером 0,2 мм (конус нарастания с одним листовым зачатком) 70 % по­лученных растений были свободны от Y-вируса картофеля, но только 10 % — от Х-вируса. В некоторых случаях не удается найти оптимальное соотношение между размером меристематического экспланта и морфогенезом в нем, и при этом избавиться от ви­русной инфекции. Приходится дополнять метод культуры мерис­тем термо- или(и) хемитерапией. Так, предварительная термоте­рапия исходных растений позволяет получать свободные от виру­сов растения-регенеранты из меристемных эксплантов размером от 0,3 мм до 0,8 мм. Вместе с тем этот прием может вызвать отста­вание растений в росте, деформацию органов, увеличение латен­тных (скрытых) инфекций.

Хорошие результаты дает совместное применение метода куль­туры тканей и хемитерапии. При внесении в питательную среду препарата «Вирозол» (1 -рибофуранозил-1,2,4-триазолкарбоксамид) количество безвирусных растений увеличивается до 80 —100 %.

В настоящее время для диагностики вирусных растений ис­пользуют иммуноферментную технику, моноклональные анти­тела, метод молекулярной гибридизации меченых фрагментов РНК- и ДНК-вироидов и вирусов с вирусами тестируемого объек­та. Эти методы очень чувствительны, но трудоемки и дорого­стоящи.

После оздоровления с помощью вышеперечисленных техноло­гий нормальные растения-регенеранты размножают обычными методами клонального микроразмножения. Для некоторых расте­ний, например цитрусовых, получить морфогенез из меристем малого размера не удается, поэтому требуется разработка ориги­нальных методов. Лимоны и апельсины оздоровляют и размножа­ют, используя прививки меристем размером 0,14 — 0,18 мм на про­бирочные подвои, полученные из семян. Достоинство такого под­хода состоит и в том, что развивающиеся из меристем побеги не имеют ювенильных признаков, при этом цветение и плодоноше­ние ускоряются.