Иммунобиотехнология. Моноклональные антитела

ИММУНОБИОТЕХНОЛОГИЯ

Иммунобиотехнология — это отдельная, самостоятельная область современной биотехнологической промышленности, направленная на разработку иммунодиагностикумов, терапевтических приемов, методов и технологий производства лекарственных средств для за­щиты от воздействия различного рода биологических агентов.

Человек обладает высокоспециализированной и организован­ной системой защиты от микроорганизмов, вирусов, белков, нук­леиновых кислот, антибиотиков, пестицидов, обозначенных как антигены, которая способна вызвать специфический иммунный ответ с образованием антитела.

Различают две системы иммунитета. Защитная реакция орга­низма в случае инфицирования бактериями осуществляется В-системой иммунитета. Её состав: костный мозг — основной источник В-лимфоцитов (от англ. Bone marrow — костный мозг) и основной набор различных классов антител, нейтрализующих бактерии и их токсины. В случае вирусной инфекции функцио­нирует Т-система иммунитета,включающая тимус (вилочковая железа), различные популяции Т-лимфоцитов, антиген-распознающие рецепторы, находящиеся на поверхности этих клеток, группу регуляторных молекул — цитокинов (гликопротеинов, передающих сигналы от клетки к клетке).

Тесное взаимодействие компонентов обеих систем с участием фагоцитирующих клеток (иммунокомпетентные клетки — ИКК) обеспечивает иммунный ответ организма. Макрофаги поглоща­ют, перерабатывают антиген в иммуногенной, доступной для Т- и В-лимфоцитов форме.

Т-клетки после распознавания антигена продуцируют цитокины, направляющие свое действие на В-клетки, которые далее при­ступают к выработке антител. Чужеродные и аномальные белки подвергаются протеолизу 26S иммунными протеасомами по АТФ- убквитинзависимому пути с образованием антигенных олигопеп­тидов длиной 8-11 аминокислот с С-концом, содержащим остатки гидрофобных аминокислот. Эти белки называют эпитопами. Они соединяются в цитоплазме с белками-транспортерами и переносят­ся в эндоплазматический ретикулум, где связываются с молекула­ми главного комплекса гистосовместимости I (ГКГ I) и выно­сятся вместе с ними на поверхность клетки в составе трансмемб­ранных пузырьков. Данная структура является сигналом для Т-лимфоцитов (Т-киллеров) для уничтожения дефектной клетки.

Иммунный ответ — сложный процесс межклеточного взаимо­действия лимфоидных клеток разных типов с участием специфи­ческих гормонов, в результате чего В-клетки синтезируют специ­фические антитела против определенного антигена. Функция каждого клеточного типа в антителопродукции строго определе­на: макрофаги поглощают, перерабатывают и экспрессируют ан­тиген в иммуногенной, доступной для Т- и В-лимфоцитов фор­ме. Т-клетки (Т-хелперы) после распознавания антигена проду­цируют цитокины, помогающие В-клеткам синтезировать анти­тела. В ходе эволюции молекулы антител превратились в струк­туры, обладающие необычной конформацией и динамическими свойствами (рис. 5.21).

Все антитела имеют общий тип пространственной организа­ции пептидных цепей. Прототипом структуры всех антител мож­но считать иммуноглобулин G (IgG). Молекула IgG состоит из че­тырех цепей — двух тяжелых (Н) (Мг = 440 ак) и двух легких (L) цепей (220 ак), удерживаемых вместе посредством сильных межмолекулярных взаимодействий и дисульфидных связей. Для этой структуры характерны доменная организация молекулы и выпол­нение специфических функций отдельными доменами: Fab (антигенсвязывающие области), Fc (константные области), СН2, СНЗ (центры связывания комплемента). Все четыре цепи соеди­нены между собой и достаточно подвижны.

Существует 5 разных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM в соответствии с типом тяжелых цепей а, 8, е, у и р. Разные Н-цепи придают «хвостовым» областям антител различную конформацию и определяют характерные свойства каждого класса антител (рис. 5.22).

Система комплемента (СК) дополняет (комплементирует) и усиливает действие антител. СК-система состоит примерно из 20 взаимосвязанных компонентов — белков с Мг от 24 до 400 кДа. Они образуются в печени и циркулируют в крови и тканевой жид­кости. Активация СК-комплексами образований «антиген—анти­тело» происходит за счет каскада протеолитических реакций, вы­зывающих гибель микроорганизмов и повышение способности фагоцитирующих клеток связывать и разрушать микроорганизмы.

Для антитела характерна необыкновенная, уникальная специ­фичность. Каждое антитело узнает только свой антиген (чужерод­ные макромолекулярные вещества — белки или полисахариды). Известно, что иммунизация низкомолекулярными веществами (например, лекарственными препаратами) не может вызывать иммунный ответ, поэтому для образования антител необходимо предварительно их ковалентно связать с иммуногенным высоко­молекулярным носителем. Сначала в лекарственное вещество для увеличения его функциональной активности вводят определенные функциональные группы, которые взаимодействуют с соответ­ствующими функциональными группами биополимера, образуя так называемый синтетический конъюгированный антиген. При иммунизации животного таким антигеном образуются поликло­нальные антитела, специфичные как к самому антигену, так и к антигенным детерминантам лекарственного препарата.

Установлено, что антитело, специфичное к своему антигену, узнает только одну его детерминантную группу (эпитоп). Каж­дая такая детерминантная группа состоит из небольшого количе­ства аминокислот, обычно из 6-8, образующих пространственную структуру, характерную для данного антигена (белка). В зависи­мости от размера молекулы белка в нем содержится несколько (от 5 до 15) детерминантных групп, у полисахаридов — от 3 до 6 остатков моносахаридов, что обусловливает образование к од­ному данному белку (или полисахариду) целого семейства анти­тел с разной специфичностью (табл. 5.2). Даже к одному эпитопу могут образовываться различные антитела, в результате чего в сы­воротке крови иммунизированных животных появляется большое и уникальное по составу семейство антител с абсолютной спе­цифичностью в распознавании этого антигена. Такие семейства антител давно применяют д ля нейтрализации бактериальных ток­синов (дифтерийного, столбнячного, бутулизма), змеиных ядов (кобры, гадюки), вирусов, попадающих в кровь, для идентифи­кации индивидуальных белков в клетке или тканевых экстрактах.

Однако при лечении многих заболеваний, а также при транс­плантации органов и тканей целесообразно использовать не поликомпонентные смеси антител, образующиеся в организме в ответ на действие антигена, а отдельные составляющие их ком­поненты, специфичные к одной определенной детерминантной группе. Такие антигены, специфичные лишь к одной определен­ной детерминантной группе антигена, однородные по структуре и составу и производимые в неограниченном количестве приня­то называть моноклональными антителами (МКА).

Получение моноклональных антител. Несмотря на суще­ственные достижения в области применения моноклональных антител в диагностике и терапии различных заболеваний, полу­чение этих антител связано с разного рода трудностями, что ог­раничивает их использование. Для получения антител обычно используют мышей, морских свинок, кроликов, кур, овец, коз, лошадей, которым делают инъекции антигена. В присутствии сти­муляторов иммунного ответа в крови накапливаются специфиче­ские антитела. Антитела выделяют с помощью сульфата аммония, спирта или полиэтиленгликоля. Очистку антител от примесей белков осуществляют путем ионно-обменной и аффинной хрома­тографии на соответствующих иммуносорбентах.

Для организации масштабного биотехнологического производ­ства моноклональных антител (МКА) в настоящее время исполь­зуют метод гибридомной технологии.

Важнейшая задача метода гибридомной технологии — полу­чение однородных антител со строгой специфичностью дей­ствия. Известно, что путем иммунизации животного (введения определенного антигена или только одной детерминанты) этого сделать нельзя ввиду образования большого количества генети­чески однородных семейств антителобразующих клеток АОК- клонов, каждый из которых синтезирует только один вариант ан­тител к его детерминантам. Таких клонов очень много, что обусловливает большое разнообразие антител, индуцируемых одним антигеном. Если определенную линию В-лимфоцитов можно было бы выделить и вырастить в культуре тканей (в пробирке) in vitro, то полученный клон продуцировал бы только один тип антител — МКА. Но это сделать невозможно, так как нормаль­ные клетки, будучи высаженными в культуру, вскоре погибают («смертность клетки»).

Метод гибридомной технологии, используемый для получе­ния МКА, предусматривает получение гибридных клеток за счет слияния соматических клеток. Разрушение оболочек клеток и их слияние осуществляются при использовании вируса или поли­этиленгликоля. Из разнородных клеток после такой обработки можно получить двуядерные гибриды, сохранившие способность к клеточному делению. В процессе клеточного деления хромо­сомы обоих ядер перемешивались и образовывали общее ядро. В результате возникал потомок двух соматических клеток или гибридома. Однако гибридомы нормальных соматических кле­ток, синтезирующих антитела со строго определенной специ­фичностью, также не могут быть использованы для получения МКА, так как после пересаживания в культуру они вскоре по­гибают.

Данная проблема была решена в результате использования опу­холевых клеток человека —плазмоци, вырабатывающих им­муноглобулины, чрезвычайно похожие по структуре на антитела, продуцируемые нормальными клетками. Плазмоцитомные анти­тела также образовывали смесь различных гибридных комбина­ций с антителами крови, среди которых обнаруживались и спе­цифически реагирующие пары «антиген—антитело».

Плазмоцитомы обладают рядом особенностей, позволяющих их использовать для получения МКА заданной специфичности. Плазмоцитомы возникают из одной (мутантной) генетически из­мененной клетки, вследствие чего она зарождается и развивается как клон иммуноглобулинобразующих клеток со строгой специ­фичностью действия.

Плазмоцитомы возникают непредсказуемо, спонтанно, и мож­но их легко индуцировать и получить таким образом неограни­ченно растущий клон клеток, продуцирующих иммуноглобулины, нередко обладающие специфичностью МКА.

Плазмоцитома, как опухоль, бессмертна в отличие от нормаль­ных предшественников, что позволяет культивировать ее в про­бирке и пересаживать многократно от одного животного друго­му. В силу автономии организм-хозяин не способен прекратить безудержный рост опухоли. Плазмоцитома сохраняет свойства и функции плазматической клетки, синтезирующей антитела, из которой она произошла.

Двумя исследователями Г. Кёлером (немецкий иммунолог) и Ц. Мильштейном (английский биолог) был разработан метод получения гибрида нормальной антителообразующей плазмати­ческой клетки и опухолевой клетки плазмоцитомы. Полученная гибридома от нормальной клетки унаследовала способность к синтезу антител, а от опухолевой — бессмертие и способность к неограниченному росту.

Отделение гибридомы с требуемой специфичностью от присут­ствующих в системе отдельных неслившихся клеток, а также гиб­ридов иного состава и специфичности осуществляют по специаль­ной схеме, включающей отбор клеток в селективной среде. Гибри­дизацию клеток проводят с применением особого мутанта мыши­ной плазмоцитомы, рост которого можно контролировать составом питательной среды, влияющим на направленность синтеза предше­ственников нуклеиновых кислот (нуклеотидов). Основной путь биосинтеза нуклеиновых кислот (из нуклеотидов) блокируется до­бавлением противоопухолевого препарата — Однако, клетки могут не гибнуть при наличии в среде аминоптериаминоптери­на, поскольку они способны синтезировать нуклеотиды и нуклеи­новые кислоты по так называемому резервному пути за счет реу­тилизации продуктов распада ранее синтезированных молекул — гипоксантина и тимидина. Добавление в питательную среду этих соединений снижает токсический эффект аминоптерина.

Для селекции гибридом получают мутант плазмоцитомы, не способный пользоваться резервным путем и погибающий в сре­де, которая содержит аминоптерин (А) и токсичные аналоги гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Выживают лишь редкие мутан­ты, не способные усваивать токсичные Г и Т и тем самым утра­тившие способность к синтезу собственных иммуноглобулинов.

Получение гибридом сводится к определенным операциям (рис. 5.23).

Гибридомы получают путем смешивания взвеси анти­телообразующих клеток (АОК) и клеток мутантной плазмоцито­мы с добавлением полиэтиленгликоля. После инкубации, необ­ходимой для слияния клеток, они отмываются от полиэтиленгли­коля и помещаются в среду, содержащую А, Г и Т (ГАТ-среда). В среде находятся оставшиеся свободными гибриды АОК х АОК, П К х ПК и АОК х ПК. После недолгою культивирования одиноч­ные АОК и гибриды АОК х АОК погибают, так как нормальные клетки смертны в культуре. Плазмоцитомные клетки и их гибри­ды погибают в присутствии аминоптерина, который блокирует ос­новной путь синтеза нуклеотидов, а токсичные Г и Т «не вклю­чают» резервный путь. Выживают только гибриды АОК х ПК, так как они сохраняют способность к антителообразованию по основ­ному пути, а бессмертие от плазмоцитомы Выжившие в ГАТ-среде клетки гибридом рассеиваются в спе­циальные пластиковые планшеты с 96 лунками вместимостью по 0,2 см3. В каждую лунку помещается около 10 гибридомных кле­ток, в присутствии некоторых клеток способствующих их росту. Обнаружение антител нужной специфичности проводят с помо­щью специальных микрометодов. Клетки с нужными антителами клонируют и повторно рассеивают по таким же лункам (из рас­чета одна клетка на лунку), вновь культивируют и анализируют на присутствие МКА. Полученные клоны можно заморозить при -70 вС и хранить длительное время. При их культивировании или прививке животным можно накапливать моноклональные анти­тела в культурной среде в больших количествах. МКА можно счи­тать чистыми химическими реактивами вследствие однородности их физико-химических свойств.

Применение моноклональных антител. МКА в силу своей высочайшей специфичности, стандартности и технологичности получения вытесняют и заменяют обычные поликлональные им­мунные сыворотки, применяемые для определения биологически активных соединений. Гибридомную технологию с успехом при­меняют в аналитических целях. С помощью гибридом можно по­лучить огромное количество антител к уникальному антигену (или к одному из его эпитопов), вывести линию одного клона, в то время как в крови иммунизированного животного среди множества других антител он не может проявиться ввиду чисто количе­ственных соотношений.

Благодаря гибридомам разработаны новые методы диагности­ки многих заболеваний, в том числе онкологических. С их помо­щью можно обнаружить антигены, характерные для злокачествен­ных опухолей определенных тканей, получить к ним монокло­нальные антитела и использовать их для диагностики и тестиро­вания опухолей. Во всем мире ведутся интенсивные исследования по использованию МКА в качестве специфических переносчиков токсических веществ в опухолевые клетки. В опухоль и ее мета­стазы с помощью МКА добавляют радиоактивные вещества, по­зволяющие обнаружить локализацию небольших узелков опухо­ли по накоплению в них радиоактивности. МКА с успехом при­меняют для диагностики многих инфекционных заболеваний, стандартизации определения групп крови, идентификации спе­циализированных клеток, например таких, как нейроны.

Очень важно использование МКА для изучения клеточных мембран. Мембранные белки, присутствующие в клетках в малых количествах, трудно выделить в чистом виде и измерить их био­логическую активность. Были получены гибридомы, продуциру­ющие антитела против тимоцитов крысы, а затем изолированы ряд клонов с активностью антител, специфичных для отдельных антигенов (белков) клеточной поверхности.

Использование МКА позволяет эффективно осуществлять ле­карственный мониторинг, разработку иммунодиагностических тест-систем, открывает перспективу получения высокоспецифич­ных вакцин и сывороток против определенных вирусных штам­мов и паразитов.