Электронная микроскопия
Биология — Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. 1 том — 2013
5.6.1. Электронный микроскоп
К началу 1900-х годов дальнейшее продвижение в изучении структуры клетки приостановилось, потому что даже самый совершенный световой микроскоп не мог обеспечить увеличение свыше 1500. Ограничение определялось самой природой света. Свет — это одна из форм электромагнитного излучения (рис. 5.4), способного распространяться в виде последовательности волн.
Глаз человека воспринимает электромагнитные излучения в диапазоне длин волн от 400 нм (фиолетовый цвет) до 700 нм (красный цвет). Этот видимый свет составляет, однако, лишь небольшую часть полного электромагнитного спектра, включающего излучения с разной длиной волны (рис. 5.4).
Рис. 5.4. Электромагнитный спектр. Видимый свет составляет лишь небольшую его часть. (Длины волн даны не в масштабе.)
Излучения с любой длиной волны распространяются со скоростью света, но чем меньше длина волны, тем большую энергию она несет. Нельзя разглядеть объект размером меньше половины длины волны используемого излучения, потому что объект должен быть достаточно велик, чтобы препятствовать прохождению волн.
Мельчайший объект, который можно увидеть, используя видимый свет, должен быть поэтому не менее 200 нм в диаметре (половина длины волны в фиолетовой области спектра). Учитывая размеры некоторых клеток и клеточных органелл (о них мы говорили выше), легко понять, что, например, митохондрии (1 мкм, или 1000 нм) должны выглядеть в световом микроскопе просто как какие-то мелкие гранулы внутри клеток. Рибосомы же в нем вообще не видны.
Следовательно, световой микроскоп не позволяет познакомиться с детальной структурой митохондрий, рибосом и других клеточных компонентов.
Отдавая себе отчет в этих ограничениях светового микроскопа, ученые предпринимали попытки сконструировать микроскоп, в котором использовалось бы излучение со значительно меньшей длиной волны. Вначале для этого попытались использовать рентгеновские лучи, но вскоре выяснилось, что наилучшие результаты способен дать электронный микроскоп. В нем вместо светового излучения используется пучок электронов. Электроны — это отрицательно заряженные частицы, обращающиеся вокруг ядер атомов. При определенных условиях они ведут себя как волны. В сравнении с видимым светом они обладают двумя важными преимуществами.
Во-первых, у них чрезвычайно малая длина волны, почти такая же, как у рентгеновских лучей (рис. 5.4), и, во-вторых, поскольку они несут отрицательные заряды, их можно сфокусировать с помощью электромагнитных линз (электромагнитов). Электромагнитные линзы направляют пучок электронов точно так же, как стеклянные линзы направляют пучок световых лучей.
Электронный микроскоп дает возможность получить для биологических объектов увеличение порядка 250 000. С некоторыми материалами удается достичь еще большего увеличения и теперь иногда получают даже изображения отдельных атомов.
5.6.2. Разрешающая способность и увеличение
Разрешающей способностью называют способность прибора отобразить раздельно два мелких максимально близко расположенных объекта. Ниже предела разрешения эти объекты будут восприниматься как один объект. Разрешающая способность и увеличение — это не одно и то же. Как бы мы не увеличивали фотографию, мы никогда не сможем разглядеть на ней отдельные атомы. Возрастает увеличение, но разрешение остается на фотографии прежним. Мы увеличиваем фотографию, чтобы лучше видеть изображение, но если продолжать ее увеличивать, то в конце концов изображение распадется на ряд отдельных расплывающихся пятен. Понять, в чем заключается различие между увеличением и разрешением, можно также, сравнив изображения клетки, полученные в световом и в электронном микроскопе при одном и том же увеличении (рис. 5.5). На рис. 5.5 хорошо видно, что два эти изображения весьма сильно различаются по своей детализированности. В электронном микроскопе разрешение намного больше, поскольку у электронов длина волны намного меньше, чем у видимого света.
Рис. 5.5. Фотографии одних и тех же растительных клеток, сделанные с помощью светового (А) и электронного (Б) микроскопов при одном и том же увеличении (около х2500).
Предел разрешения в электронном микроскопе составляет на практике около 0,5 нм, тогда как для светового микроскопа он равен 200 нм. Это не значит, что электронный микроскоп лучше. Два эти микроскопа предназначены для разных целей. Световой микроскоп по-прежнему незаменим как прибор, позволяющий составить общее представление о клетках и тканях. К тому же и подготовить для него материал можно намного быстрее и проще. Он также позволяет наблюдать живые объекты, что совершенно невозможно сделать с помощью электронного микроскопа.
5.6.3. Принцип действия и ограничения электронного микроскопа
Электронные микроскопы появились в 1930-х годах и вошли в повсеместное употребление в 1950-х.
Рис. 5.6. Современный трансмиссионный электронный микроскоп.
На рис. 5.6 изображен современный трансмиссионный (просвечивающий) электронный микроскоп, а на рис. 5.7 показан путь электронного пучка в этом микроскопе. В трансмиссионном электронном микроскопе электроны, прежде чем сформируется изображение, проходят сквозь образец. Такой электронный микроскоп был сконструирован первым.
Рис. 5.7. Траектория пучка электронов в трансмиссионном электронном микроскопе.
Электронный микроскоп перевернут «вверх дном» по сравнению со световым микроскопом. Излучение подается на образец сверху, а изображение формируется внизу. Принцип действия электронного микроскопа в сущности тот же, что и светового микроскопа. Электронный пучок направляется конденсорными линзами на образец, а полученное изображение затем увеличивается с помощью других линз. В табл. 5.3 суммированы некоторые сходства и различия между световым и электронным микроскопами. В верхней части колонны электронного микроскопа находится источник электронов — вольфрамовая нить накала, сходная с той, какая имеется в обычной электрической лампочке. На нее подается высокое напряжение (например, 50 000 В), и нить накала излучает поток электронов. Электромагниты фокусируют электронный пучок.
Внутри колонны создается глубокий вакуум. Это необходимо для того, чтобы сократить до минимума рассеивание электронов из-за столкновения их с частицами воздуха. Для изучения в электронном микроскопе можно использовать только очень тонкие срезы или частицы, так как более крупными объектами электронный пучок почти полностью поглощается. Части объекта, отличающиеся относительно более высокой плотностью, поглощают электроны и потому на сформировавшемся изображении кажутся более темными.
Для окрашивания образца с целью увеличения контраста используют тяжелые металлы, такие как свинец и уран.
Таблица 5.3. Сравнение светового и электронного микроскопов
Электроны невидимы для человеческого глаза, поэтому они направляются на флуоресцирующий экран, который воспроизводит видимое (черно-белое) изображение. Чтобы получить фотоснимок, экран убирают и направляют электроны непосредственно на фотопленку. Полученный в электронном микроскопе фотоснимок называется электронной микрофотографией.
Преимущество:
1) высокое разрешение (0,5 нм на практике)
Недостатки:
1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;
2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;
3) дорого стоит и сам электронный микроскоп и его обслуживание;
4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;
5) исследуемые образцы под действием пучка электронов постепенно разрушаются. Поэтому, если требуется детальное изучение образца, необходимо его фотографировать.
5.6.4. Сканирующий электронный микроскоп
Еще один тип электронного микроскопа — это сканирующий электронный микроскоп, в котором пучок электронов последовательно перемещается от точки к точке по поверхности объекта, а отраженные от поверхности электроны собираются и формируют изображение наподобие того, какое возникает на экране телевизора.
Преимущества:
1) видны детали строения поверхности;
2) детали видны с большей глубиной резкости, т. е. большая часть образца одновременно находится в фокусе. Это создает удивительный эффект трехмерности (рис. 5.8);
3) можно работать с образцами большего размера, чем в трансмиссионном электронном микроскопе.
Недостаток:
1) разрешающая способность (5–20 нм) ниже, чем у трансмиссионного электронного микроскопа (0,5 нм).
Рис. 5.8. Микрофотография головы паука, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа.
5.7. Фракционирование клеток
Микроскопическая техника вносит огромный вклад в изучение клетки. Однако, когда речь идет о выявлении функций отдельных органелл, необходимы еще и различные другие методы исследования. Обычно, для того чтобы определить функцию той или иной органеллы, нужно отделить данную органеллу от других клеточных компонентов и заставить ее выполнять эту функцию in vitro. Для этого клетки разрушают (гомогенизируют), поместив их в подходящую среду (с надлежащим pH, ионным составом и температурой). Проделать это можно с помощью обычного миксера. Полученную смесь подвергают центрифугированию. Чем больше число оборотов центрифуги, тем более мелкие частицы осаждаются (рис. 5.9). Центрифугирование проводят в несколько приемов, постепенно увеличивая скорость. После каждого центрифугирования надосадочную жидкость отделяют от осадка, чтобы вновь подвергнуть ее центрифугированию. Каждый последующий осадок содержит все более мелкие органеллы. Такая методика известна как дифференциальное центрифугирование. Для достижения высоких скоростей требуется особая центрифуга, ее называют ультрацентрифугой.
Рис. 5.9. Фракционирование клеточных компонентов с помощью центрифуги. Развиваемые центрифугой центробежные ускорения измеряются числом g (g — ускорение силы тяжести).