Белковая генная инженерия. Направленный мутагенез.

Белковая генная инженерия

Получение белков методами генетической инженерии остает­ся важнейшей задачей биотехнологии третьего тысячелетия. К на­стоящему времени методами генетической инженерии в мире получено более 100 различных протеинов. Однако особенности природных свойств многих из них (нестабильность, ограничен­ные пределы субстратной специфичности, потребность в кофак­торе, биодеградируемость, наличие механизмов регуляции актив­ности и др.) ограничивают возможности промышленного приме­нения получаемых белков. Необходимость преодоления указан­ных ограничений привела к возникновению в недрах современ­ной биотехнологии такого перспективного направления, как бел­ковая инженерия.

Цель белковой инженерии состоит в конструировании in vitro новых белков с заданными свойствами. Изучение направленно­го изменения свойств белков имеет помимо прикладного прин­ципиальное значение для понимания на молекулярном уровне структурно-функциональных отношений в биополимерах, ибо они составляют сущность жизненных процессов.

Наиболее реальным способом создания нового белка считает­ся внесение специфических изменений в клонированный ген из­вестного белка, что обеспечивает получение определенных изме­нений в первичной структуре последнего. Методической основой для введения в состав нуклеотидных последовательностей клониклони­рованной ДНК заранее запланированных изменений является олигонуклеотид-направленный (сайт-специфический) мутагенез.

Направленным, или сайт-специфическим, мутагенезом назы­вается совокупность методов получения мутаций, основанных на использовании генно-инженерных подходов.

Для осуществления направленного мутагенеза клонированных генов используют два типа связанных друг с другом эксперимен­тальных подходов: рациональный дизайн (rational design) и на­правленную эволюцию.

Стратегия получения нового белка, согласно первому подхо­ду, базируется на теоретических представлениях о будущей про­странственной структуре белка. Используя принципы биоинфор­матики и методы компьютерного моделирования, строят трехмер­ную модель протеина, на основе которой выводят первичную структуру полипептидной цепи желаемого белка. В этих работах часто применяют известные аминокислотные последовательно­сти, совершенствование биологических функций которых прово­дят методами направленного мутагенеза. Успех экспериментов в области рационального дизайна ограничивается в настоящее вре­мя неполнотой наших знаний о фолдинге белков и недостаточ­ностью мощностей современной компьютерной техники.

При осуществлении ускоренной эволюции белков создают большие (репрезентативные) библиотеки генов, совокупность нуклеотидных последовательностей которых перекрывает все пространство или определенную часть генома организма. После процедуры первоначального клонирования генов получают набор случайных аминокислотных последовательностей, среди которых отбирают варианты, близкие по биологической активности. Да­лее на базе отобранных вариантов аминокислотных последова­тельностей с помощью методов молекулярного клонирования ге­нов и направленного мутагенеза конструируют новые наборы му­тантных белков, которые подвергаются следующему раунду скри­нинга и т. д. Для сокращения объема экспериментальной работы в процессе реализации данного экспериментального подхода, как и в первом случае, обычно используют известную аминокислот­ную последовательность.

Направленный мутагенез позволяет получать мутации любого размера — единичные или множественные замены, делеции, вставки.

 

НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ

Простейшим способом внесения точковых мутаций в клони­рованный ген является олигонуклеотиднаправленный мутагенез с использованием ДНК бактерий М13. Ген-мишень, кодирующий измененную аминокислотную последовательность белка, обычно встраивают в двухцепочечную форму вектора на основе фага М13. С этой целью одноцепочечную форму вектора [(+)-цепь ДНК] гибридизуют с синтетическим олигонуклеотидным праймером, содержащим в нужном кодоне один некомплементарный нукле­отид (рис. 6.1).

 

Например, триплету ATT в составе ДНК фага (ко­дирует изолейцин) будет соответствовать триплет ГАА в составе олигонуклеотида. Олигонуклеотид используется в качестве прай­мера, 3′-конец которого служит для инициации, а ДНК плюс- цепи фага М13 — матрицей для синтеза второй цепи, комплемен­тарной матричной цепи по всей длине, за исключением области мутации. Репликацию осуществля­ют с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli (для пре­дотвращения выщепления прайме­ра в конце синтеза) при наличии в среде четырех дезоксирибонуклео- зидтрифосфатов, а соединение кон­цов обеспечивают посредством ис­пользования ДНК-лигазы фага Т4. Полученные двухцепочечные моле­кулы, содержащие некомплемен­тарные нуклеотиды, клонируют в клетках E.coli. В соответствии с по- луконсервативным механизмом репликации одна половина популя­ции фагового потомства содержит ДНК дикого типа, а другая — му­тантную ДНК с нуклеотидной за­меной. Мутагенный ген вырезают и клонируют в экспрессирующем векторе. В полученном таким спо­собом мутантном белке остаток изолейцина будет заменен на оста­ток лейцина.

Недостатком олигонуклеотиднаправленного мутагенеза с ис­пользованием фага М13 является его трудоемкость. В качестве аль­тернативы системе с использовани­ем фага М13 разработаны подходы с применением плазмидных ДНК, в которые встраивают двухцепочеч­ные мутантные гены-мишени.

В настоящее время разработаны различные методы образования де­лений практически любого разме­ра. Так, эффективный метод созда­ния делеций с использованием эк- зонуклеазы Ва131 (из Alteromonus expejina) позволяет последователь­но удалять нуклеотиды с 3′ и 5′- концов сайтов рестрикции. Для этого целевой ген, клонированный в плазмиде, расщепляют по уни­кальному сайту рестрикции. Образовавшиеся линейные молекулы ДНК инкубируют в присутствии экзонуклеазы Ва131. Фермент отщепляет нуклеотиды с обоих кон­цов молекулы прямо пропорционально времени инкубации ее с экзонуклеазой. В результате возникает набор полинуклеотидных фрагментов разной длины, несущий делеции разного размера по обе стороны сайта рестрикции. В полученные фрагменты вводят уникальные сайты рестрикции, а затем каждый из фрагментов клонируют в реципиентных клетках (рис. 6.2).

Достижения в области белковой инженерии напрямую связа­ны с применением прогрессивной технологии ПЦР-амплифика- ции. Сочетание сайт-специфического мутагенеза с полимеразной цепной реакцией оказалось незаменимым подходом к простому и быстрому получению больших количеств мутантных генов. Один из вариантов введения сайт-специфических мутаций в ам- плифицируемый фрагмент ДНК состоит в применении наряду с внешними праймерами (а + d) внутренних праймеров (Ь + с), име­ющих измененную нуклеотидную последовательность и компле­ментарных друг другу (рис. 6.3).

 

Ген-мишень встраивают в плазмиду между двумя уникальны­ми сайтами рестрикции и проводят амплификацию его левого и правого перекрывающихся между собой фрагментов с помощью нескольких раундов ПЦР. В первом раунде ПЦР в отдельных пробирках амплифицируют левый (праймеры а + b) и правый (прай­меры с + d) фрагменты гена, являющегося мишенью мутаций. В результате образуются два перекрывающихся фрагмента. Про­дукты ПЦР-амплификации очищают от праймеров, объединяют в эквивалентных количествах, а затем подвергают тепловой дена­турации. В итоге образуется некоторое количество частично двух­цепочечных молекул ДНК, спаренных в области гена-мишени. Их достраивают до полностью двухцепочечных молекул с помощью ДНК-полимеразы (отмечены пунктирными линиями на рисунке), и образовавшаяся молекула ДНК, содержащая требуемую мута­цию, служит матрицей в следующем раунде ПЦР-амплификации с парой праймеров (а + d), комплементарных противоположным концам молекулы. Амплифицированные молекулы обрабатыва­ют двумя рестриктазами (I и II), сайты расщепления которых на­ходятся на концах фрагмента, и клонируют в соответствующем векторе. Этот подход позволяет получить измененные гены с слу­чайными мутациями.

 

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ БЕЛКОВ

Направленное конструирование модифицированных белков — один из наиболее эффективных путей создания протеинов, удов­летворяющих требованиям высокоспециализированных жестких процессов, протекающих in vitro. В первую очередь методы бел­ковой инженерии позволяют повысить стабильность белков, их устойчивость к воздействию повышенных температур, окисляющих агентов, органических растворителей, ингибито­ров, протеаз. Для таких белков, как ферменты, важными в практическом отношении свойствами, которые желательно улучшить, являются кинетические параметры и субстратная спе­цифичность. В табл. 6.1 приведены примеры использования сайт-направленного мутагенеза для изменения конкретных свойств ряда белков.

Так, к значительному возрастанию стабильности белковой молекулы приводит возникновение в ней дополнительных дисульфидных связей. В серии экспериментов с помощью олигонуклеотиднаправленного мутагенеза были сконструированы шесть ва­риантов лизоцима фага Т4 с новыми внутримолекулярными дисульфидными связями. С этой целью два, четыре или шесть оп­ределенных аминокислотных остатков в полипептидной цепи бел­ка были заменены на остатки цистеина, в результате чего стало возможным образование в его молекуле одной, двух или трех S-S-мостиков соответственно. Мутантные белки клонировали в клетках E.coli, рекомбинантные белки очищали и устанавливали их термостабильность. Результаты эксперимента показали, что с увеличением числа дисульфидных связей в молекуле фермента его термостабильность закономерно возрастает. Однако вариант, об­ладающий тремя S-S-мостиками и характеризующийся наиболь­шей термостабильностью, полностью терял энзиматическую ак­тивность. Этот эффект объясняется тем, что некоторые дисульфидные связи препятствуют нормальному функционированию белка в результате нарушения пространственной структуры его молекулы.

Другой аспект исследования в области белковой инженерии ферментов связан с направленными изменениями их субстратной специфичности путем замены отдельных аминокислотных остат­ков, участвующих в формировании активных центров энзимов. Такой подход был использован группой И. Сигала, сотрудники которой заменили остаток сер70 в активном центре бета-лактамазы на остаток цистеина. В результате данной замены способность расщепления субстрата — пенициллина — мутантным энзимом уменьшалась в 50— 100 раз. Одновременно с этим мутантная р-лактамаза была более активна к цефалоспоринам — представи­телям бета-лактамных антибиотиков третьего поколения.

Названные исследования позволяют уточнить функциональ­ную значимость отдельных аминокислот в белках, механизмах действия конкретных ферментов и молекулярных основах регу­ляции их активности.

Особый интерес представляют исследования в области белко­вой инженерии, направленные на снижение нежелательных для человека и животных свойств генно-инженерных природных био­регуляторов — интерлейкинов, интерферонов, цитокинов, гормо­нов. Большую заинтересованность в практических возможностях белковой инженерии проявляют фирмы, производящие фермен­тные препараты для моющих и косметических средств, кожевен­ной, текстильной и пищевой промышленности.

Методами белковой инженерии конструируют белки, соединя­ющие в себе различные полезные функции (так называемые гиб­ридные, слитные или составные белки). Гибридными белками называют полипептиды, искусственно составленные из природ­ных доменов разного происхождения. Это возможно благодаря модульному принципу строения белков. Домены (модули), выпол­няющие схоДные биологические функции у разнообразных по фи­зико-химическим свойствам белков разных организмов, постро­ены однотипно. Функциональные домены полифункциональных белков складываются и действуют независимо друг от друга.

Гибридные белки получают с помощью метода ПЦР. С этой це­лью синтезируют праймеры, 3′-концы которых комплементарны границам переносимого домена гена А, а 5′-концы замещаемого домена гена В (рис. 6.4).

Ген В клонируют в однонитевом векто­ре [(+)-нить] и гибридизуют с одной из нитей дуплекса, образую­щегося в результате амплификации переносимого домен-кодиру- ющего участка. Нить дуплекса служит праймером для копирова­ния (+)-нити вектора. В результате возникает комплементарная полинуклеотидная цепочка, ген В которой будет содержать учас­ток, кодирующий домен гена АПолучение гибридных белков — необходимая часть экспери­ментов в области генетической инженерии, при осуществлении

которой часто требуется оценить скорость биосинтеза целевых бел­ков, проследить за их перемещени­ем и концентрацией. Для этого со­единяют фрагменты ДНК, содер­жащие открытые рамки считыва­ния, с генами белков — репортеров ((3-галактозидазы, люциферазы, хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, зеленого флуоресцентного бел­ка и др.).

В 80-е годы XX в. получены гибридные белки, объединяющие в одной полипептидной цепи два раз­личных белка — человеческий у-интерферон и интерлейкин-2 — и со­хранившие в ней обе биологические активности. Шведским исследова­телям удалось создать гибридный белок, содержащий тканевый акти­ватор плазминогена и фрагмент урокиназ, при этом времяполужиз- ни каждого из них значительно воз­росло. Полученные результаты по­ставили вопрос о возможности по­лучения лекарственных препаратов комбинированного действия Идея слияния генов разных бел­ков оказалось плодотворной для конструирования искусственных цитотоксинов направленного дей­ствия (рецепторопосредованных токсинов). Большинство природ­ных токсинов белковой природы включают не менее двух доменов. Один из них обладает действенным

эффектом, а другой (лиганд) распознает рецептор на поверхнос­ти клетки—мишени, помогая токсину проникнуть в нее. При за­мене второго домена на какой-нибудь другой пептидный лиганд токсин приобретает другую специфичность действия. Так; соеди­нение в пределах одной полипептидной цепи домена дифтерий­ного токсина и фактора роста клеток или меланоцитостимулиру- ющего гормона а человека позволило создать лекарственный пре­парат направленной доставки токсина к опухолевым клеткам.

В процессе дальнейшего усовершенствования системы адрес­ной доставки цитотоксических пептидов были сконструированы гибридные белки на основе экзотоксина A Pseudomonos nosa. В качестве адресной части (лиганда) в гибридном токсине использовали фрагмент полипептидной цепи СД4 — гликопроте­ина поверхности Т-клеток. СД4 является рецептором ВИЧ и в процессе вирусной инфекции взаимодействует с поверхностным гликопротеином ретровируса gpl20. Созданные молекулы гибрид­ного токсина позволяют избирательно поражать Т-клетки, инфи­цированные ВИЧ и несущие на своей поверхности белок gpl20. Высокоспецифичными токсичными средствами по отношению к лейкозным клеткам человека оказались также гибридные токси­ны, содержащие вариабельные домены моноклональных антител к части (р55) рецептора интерлейкина-2 человека.

Таким образом, несмотря на короткий срок развития, итоги и перспективы белковой инженерии настолько впечатляющи, что по праву позволяют считать ее точкой роста современной науки и производства

 

Zdravcity RU
А Вам помог наш сайт? Мы будем рады если Вы оставите несколько хороших слов о нас.
Zdravcity RU
Категории
Рекомендации
Помощь проекту
Интересное
А знаете ли вы, что нажав сочетание клавиш Ctrl+F - можно воспользоваться поиском по сайту?
X
Copyrights © 2015: FARMF.RU - тесты, лекции, обзоры
Яндекс.Метрика
Рейтинг@Mail.ru