2

Глава 10. Биопрепараты растительного происхождения

Глава 10. Биопрепараты растительного происхождения

10.1. Культура изолированных клеток, тканей и органов растений
10.2. Особенности культивирования изолированных клеток и тканей растений
10.3. Методы культивирования изолированных клеток и тканей
10.4. Культура растительных клеток как источник лекарственных веществ

10.1. Культура изолированных клеток, тканей и органов растений

Культура клеток, тканей и органов растений представляет собой части растений, наращиваемые в асептических условиях на искусственных питательных средах, и включает:
– каллусные культуры на гелеобразной (твердой) питательной среде,
– суспензионные культуры клеток в жидкой питательной среде,
– культуру протопластов, изолированные органы растений.

Первые попытки культивировать изолированные клетки и ткани растений были предприняты в конце XIX в. известными немецкими учеными Т. Габерландтом, Ж. Фёхтингом и С. Рехингером. Они пытались выращивать in vitro небольшие кусочки тканей растений, помещая их на влажную поверхность фильтра в растворе сахарозы. По аналогии с культурами животного происхождения, где использовались питательные среды природного происхождения (плазма крови, зародышевая жидкость), физиологи растений пытались выращивать клеточную массу, используя соки и экстракты растений. Первые опыты оказались не совсем удачными, поскольку транспорт и превращение питательных веществ у целого растения и изолированных растительных клеток существенно отличается. Лишь к началу 20-х гг. прошлого века ученые отказались от использования природных сред неопределенного состава в пользу синтетических сбалансированных сред. Основой послужили среды, используемые для выращивания целых растений.

Описанный период может считаться лишь предысторией метода культуры тканей и клеток растений. Настоящее развитие этого метода началось с работ Филиппа Уайта в США и Роже Готре во Франции. В результате их исследований в 30-х гг. XX столетия было установлено, что изолированные органы, ткани и клетки растений могут расти в культуре in vitro неограниченно долго при пассировании (пересадках) их на свежую питательную среду при определенных условиях. Многие ткани, введенные ими в культуру, существуют в пассированной культуре в настоящее время.

Культура клеток и тканей лекарственных растений – сравнительно молодая отрасль науки. Впервые культуру тканей лекарственного растений, а именно барвинка розового, получил Уайт в 1945 г. В 1947 г. в лаборатории Готре была получена культура ткани белены червой и доказана ее способность вырабатывать соответствующие алкалоиды. В кронце 50-х гг. XX в. был разработан метод массового выращивания клеток и тканей глубинным способом в жидких питательных средах.

В СССР первые лаборатории по исследованию культур изолированных тканей и клеток лекарственных растений были открыты на базе Института физиологии растений АН СССР под руководством член- корр. АН СССР Р.Г. Бутенко, в Ленинградском химико-фармацевтическом институте, во Всесоюзном институте лекарственных растений и в Томском медицинском институте (ТМИ). В ТМИ лаборатория была организована при кафедре фармакогнозии и ботаники под руководством профессора Д.Н. Березнеговской.

С культурами изолированных тканей и клеток работают по разным направлениям почти во всех странах Европы, в том числе и.в России, а также Северной и Южной Америке, Азии, особенно в Китае, Индии, Японии.

10.2. Особенности культивирования изолированных клеток и тканей растений

Изолированные ткани и клетки растений могут успешно расти только при отсутствии конкуренции с микроорганизмами. Все работы по культивированию растительных объектов необходимо производить в асептических условиях. Если в состав питательной среды входят термолабильные вещества, их фильтруют через мембранные стерилизующие фильтры и добавляют в простерилизованную среду, охлажденную до 30-40 °С.

Изолированные фрагменты растения (экспланты), помещаемые на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами, поэтому их также необходимо стерилизовать. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплайт, промывают несколько раз водой очищенной. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ, несколько раз промывают водой и стерильным скальпелем удаляют наружные поврежденные слои клеток. Небольшие кусочки эксплантанта помещают на поверхность питательной среда с гелеобразующим компонентом. Клетки, изолированных растительных тканей могут делится и давать начало длительно растущей недифференцированной массе, называемой каллусом.

В настоящее время изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах, которые отличаются по своему составу в зависимости от вида культуры. В состав всех питательных сред обяхательно входят необходимые растению макроэлементы. Лучшей формой азотного питания являются нитраты (калия или аммония), в некоторых случаях дополнительно используются аминокислоты. Кроме азотистых соединений необходимы фосфор, сера, кальций, сульфаты. Отсутствие в питательной среде микроэлементов уже в первом пассаже (пересадке) может уменьшить интенсивность роста тканей на 30-40%, а при последующих – гибель тканей. В зависимости от вида изолированной культуры могут в небольших количествах использоваться: железо, бор, цинк, марганец, медь, алюминий, никель, йод и др.

Для успешного роста культур необходимы также источники углерода, поскольку даже зеленеющие, выращиваемые на свету ткани неаутоттрофны. Лучшим источником углеводного питания, является сахароза, используемая обычно в концентрации 2-5%. Реже используется глюкоза или другие сахара.

Большинство тканей, культивируемых in vitro, способны к синтезу всех нужных для их жизнедеятельности витаминов, если все питательные элементы присутствуют в средах. Однако большинство культур синтезируют витамины в субминимальных количествах, поэтому дополнительное внесение витаминов в среду также способствует росту клеток, особенно это относится к витаминам группы В. Чаще используют витамины В1, В2, B3, а также кальция пантотенат, биотин, кислоты: аскорбиновую, никотиновую, фолиевую.

Обязательными компонентами питательных сред должны быть фитогормоны. К ним относятся ауксины, регулирующие рост и дифференцировку клеток и цитокинины, индуцирующие клеточное деление. Природный ауксин в растении представлен в основном в виде β-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Для практических целей чаще применяют не ИУК, а синтетические ауксины (α-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), фенилуксуснаяя кислота (ФУК), фенилмасляная кислота (ФМК) и др.) В отличие от природных ауксинов эти соединения не разрушаются ИУК-оксидазой в клетках растений.

В качестве источников цитокининов в средах используют кинетин, зеатин, 6-бензиламинопурин и др. Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК, РНК, белков, а также в дифференцировке клеток. В состав некоторых сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают усвоение клетками железа.

На рост и развитие растительных тканей и клеток in vitro большое влияние оказывают физические факторы: свет, температура, аэрация, влажность воздуха. Большинство изолированных культур выращиваются в темноте. При необходимости они могут расти и на свету, образовывая хлорофилл, но при этом проявляют низкую способность к фотосинтезу. В некоторых случаях свет может использоваться как фактор, обеспечивающий морфогенез или активизирующий процесс синтеза биологически активных веществ. Для освещения чаще используют люминесцентные лампы с интенсивностью светового потока 1000-1500 люкс. Оптимальная температура для успешного роста большинства культур составляет 25-27 °С, для индукции их морфогенеза требуются более низкие температуры (18-25 °С). Влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60-70%. Интенсивная аэрация требуется при культивировании клеток в больших объемах с использованием жидких питательных сред. Аэрацию биомассы клеток осуществляют барботированием стерильным воздухом. При выращивании клеток в малых объемах (колбах) аэрация достигается постоянным перемешиванием суспензий клеток с помощью качалок различной конструкции.

10.3. Методы культивирования изолированных клеток и тканей

Твердофазный способ культивирования. Каллусные культуры

При этом способе культивирования используются так называемые твердые питательные среды, содержащие гелеобразующий компонент, чаще всего агар-агар как наиболее близкий по природе субстрат растительного происхождения. Такая среда имеет вид плотного геля, и каллусные клетки находятся на ее поверхности.

Для получения каллусных культур небольшие фрагменты тканей разных органов высших растений помещают на поверхность питательной среды (пробирки, колбы). Через 4-6 недель культивирования экспланта образуется первичный каллус (масса недифференцированных клеток), который необходимо разделить и перенести на свежую питательную среду. Каллусная ткань, выросшая на твердой питательной среде, имеет рыхлую аморфную структуру в виде массы тонкостенных клеток белого или желтоватого цвета. Качественный химический состав каллусной ткани обычно незначительно отличается от соответствующего интактного растения.

Твердофазный способ культивирования чаще используется в лабораторных условиях для первичного получения , изолированных растительных культур, предварительной оценки культур в качестве возможных продуцентов БАВ, а также для выращивания посевного материала. За 4-6 недель среда истощается, что определяет необходимость производить пересев. В противном случае ткани могут погибнуть.

Высшие растения состоят из множества дифференцированных клеток с различными функциями: клетки зеленой ткани листа создают органические вещества в результате фотосинтеза, клетки корня поглощают из почвы минеральные вещества и подают их в другие части растения и т.д. Но все дифференцированные клетки образовались от одной оплодотворенной яйцеклетки материнского растения — зиготы. Эта клетка содержит в себе всю генетическую основу целого растения. Из нее образуются специализированные ткани, различные по химизму происходящих в них процессов, форме и структуре. Клетка (зигота) является родоначальником целого растения, она тотипотентна, т.е. многофункциональна. Кроме зиготы тотипотентность в природных условиях могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому – вегетативное размножение черенками, от листа и др. Тотипотентность реализуется также при травмах растений. На раневой поверхности в результате неорганизованной пролиферации клеток происходит образование нароста – каллуса, способствующего заживлению ран (от лат. callus – мозоль, толстая кожа).

При образовании каллуса в культуре in vitro происходит неорганизованный рост клеток и их дедифференциация, т.е. потеря первоначальных функций, свойственных ткани или органу, из которых был получен каллус. Клетки как бы обезличиваются, их функции практически одинаковы и существуют за счет питательной среды. Однако при изменении условий культивирования можно вызвать вторичную дифференциацию и получить целое растение. По сравнению с клетками животных и человека растительные клетки обладают большим преимуществом. Они способны в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать целое растение. Решающую роль во вторичном образовании органов (корней и почек) из изолированных клеток и тканей играет соотношение фитогормонов (ауксинов и цитокининов) и их концентрация в питательной среде.

Как бы долго ни выращивались клетки в изолированной культуре, они твердо «помнят» свое происхождение: клетки моркови образуют зародыш целого растения моркови, клетки катарантуса розового – также соответствующее растение и т,д. Культивируемые ветки высших растений – это уникальная клеточная популяция, в которой каждая клетка представляет собой отдельный организм, способный к автономному развитию. При регулярном пассировании способность клеток к делению и росту может поддерживаться очень долго. Есть ткани, которые поддерживаются в культуре in vitro по 60-70 лет.

Глубинное суспензионное культивирование

Для посева в жидкую питательную среду необходимо получить посевной материал в виде суспензии клеток. Поэтому первичная калеточная ткань, которая используется в качестве посевного материала, должна быть более рыхлой и легко фрагментироваться на отдельные клетки. Для отделения крупных агрегатов клеточную массу перед пересевом фильтруют через нейлоновые или металлические сита. При пересевах на 100 мл среды используют 2-3 г свежей каллусной ткани.

В лабораторных условиях для культивирования тканей в жидких питательных средах обычно используют колбы емкостью 100-500 мл с небольшим объемом питательной среды. Сосуды с суспензией клеток помещают на качалки с частотой вращения 100-120 об/мин. В таких условиях обеспечивается аэрация тканей и нарастающая масса клеточных агрегатов распадается на отдельные фрагменты.

Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размножаются значительно медленнее, чем клетки животных или микроорганизмов, время их удвоения составляет 1-3 суток. Поэтому при суспензионном культивировании стационарная фаза роста клеток, при которой культура достигает максимума сухой биомассы, наблюдается обычно через 2-3 недели. Истощение питательной среды и накопление продуктов жизнедеятельности клеток определяют необходимость обновления культуральной среды или пересева культуры на свежую питательную среду.

В промышленных условиях используется метод непрерывного культивирования к ферментерах (биореакторах) различной конструкции, имеющих конструктивные особенности, которые учитывают специфику растительных клеток. Метод основан на поддержании баланса между разбавлением среды и удалением части суспензии.

Если в культуральную систему периодически добавлять свежую среду, то деление клеток может поддерживаться неограниченно долго. Это послужило основой для создания систем, позволяющих осуществлять непрерывное культивирование.

Культуральные системы, функционирующие непрерывно, разделяют на полупроточные и проточные. При полупроточном режиме выращивания через определенные интервалы времени производится отбор части суспензий и разбавление оставшейся части суспензии свежей средой. Культивирование в ферментерах такого типа может продолжаться несколько месяцев.

Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непрерывное снабжение культуральной системы свежей питательной средой и одновременным удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры могут функционировать в течение нескольких лет.

Глубинное культивирование в ферментерах имеет ряд преимуществ по срвнению с твердофазным статическим способом:
– автоматически поддерживаются все необходимые параметры: температура, pH среды, степень аэрации, скорость работы мешалки и пр.;
– постоянный, контроль содержания в культуральной среде основных элементов питания;
– культуральная система периодически пополняется свежей питательной средой,
– постоянно осуществляется микробиологический контроль с целью предотвращения инфицирования и гибели культур;
– контроль активности роста и деления клеток;
– контроль образования БАВ.

Необходимо отметить, что для получения БАВ может использоваться не только биомасса клеток, но и культуральная среда. В некоторых случаях получаются штаммы и клеточные линии, почти полностью выделяющие БАВ в культуральную среду, что значительно облегчает процесс их выделения из такого специфического вида сырья.

Культура протопластов

Протопласт – это клетка, лишенная оболочки. Такая «голая» клетка потенциально способна восстанавливать новую оболочку, делиться, образовывать клеточные агрегаты, из которых можно получить клеточную культуру с новыми свойствами, а затем новое растение — регенерант. Отсутствие клеточной стенки облегчает проведение различных генетических манипуляций, связанных с реконструированием генома, а также дает возможность получать популяции гибридных клеток в результате слияния протопластов.

Существует два способа разрушения клеточной оболочки – механический и ферментативный. Последний менее травматичен для клеток и чаще используется. Для получения протопластов растительный материал (например, суспензия клеток мезофилла листа или суспензия культуры изолированных клеток) обрабатывается препаратами пектиназ и целлюлаз или более сложными смесями ферментов. Для получения суспензии клеток целого растения предпочтительнее использовать листья стерильных растений, культивируемых in vitro, поскольку при получении «голых» протопластов также необходимо соблюдать стерильность.

После разрушения клеточных стенок суспензию протопластов очищают от остатков клеток и тканей фильтрованием, смесь ферментов удаляют центрифугированием с последующим промыванием в культуральной среде. После очистки протопласты ресуспендируют в питательной (культуральной) среде. Изолированные протопласты широко используются в качестве модельных систем в физиологических, цитологических, фитопатологических и других экспериментах, а также генно-инженерных манипуляциях.

В настоящее время разработаны способы получения новых гибридов в результате слияния изолированных протопластов различных растений. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный заряд, то для их соединения необходимо его нейтрализовать. Для индукции слияния протопласты обрабатывают полиэтиленгликолем. Частота слияния протопластов может быть увеличена добавлением декстрана, поливинола или под влиянием электрического поля. После слияния происходит регенерация кяеточной стенки, она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться. При слиянии протопластов разных родительских растений образуются новые клетки, из которых через культуру каллуса можно регенерировать новое растение с заданными свойствами.

В результате слияния протопластов возникают два вша новых клеток:
– гомокарионы (гомокариоциды), состоящие из клеток одного родителя;
– гетерокарионы (гетерокариоциды), состоящие из клеток обоих родителей.

Больший представляют гетерокарйоны, которые после слияния отбирают микроскопически. Для отбора исходные протопласты окрашивают флуоресцентными красителями различных цветов. Если происходит слияние протопластов мезофилла листа (зеленые) и культуры изолированных клеток (бесцветные), то получаются гетерокарионы, состоящие из бесхлорофилльных и хлорофиллосодержащих зон, что позволяет вести отбор без предварительного окрашивания.

В результате объединения растительных геномов (ядер и цитоплазмы) формируются новые комбинации генов, которые практически невозможно получить обычными методами селекции. Метод позволяет скрещивать представителей разных видов и родов растений и широко используется при выведении новых сортов пищевых, декоративных, технических, а также лекарственных растений.

Слиянием протопластов получен гибрид томата и картофеля — «томофель», гибриды некоторых лекарственных растений: дурмана индийского и белладонны, скополии гималайской и белладонны, гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше тропановых алкалоидов, чем родительское растение.

Микроклональное размножение (культура органов растений)

Культуры клеток и тканей для массового размножения растений и оздоровления посадочного материала, в том числе лекарственных растений, нашли широкое применение в растениеводстве. Этот метод, названный микроклональным размножением, позволяет от одной меристемы получить (регенерировать) достаточно большое количество Новых растений, в том числе и в культуре in vitro.

Обязательным условием для микроклонального размножения является идентичность полученного растительного материала исходному материнскому растению. Для обеспечения максимальной генетической стабильности клонируемого материала в качестве исходного экспланта используют молодые слабодифференцированные ткани, в частности кончики молодых стеблей и корней, пазушные почки, зародыши, части молодых проростков и другие меристематические ткани. Культуры клеток, полученные из меристематических тканей, дают возможность получить безвирусные клоны. Распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема, как правило, их лишена. Восстановление целого растения с помощью изолированных культур может происходить разными путями.

Прямая регенерация – это получение растений «в пробирке» непосредственно из верхушечных побегов, пазушных почек и т.д.

Косвенная регенерация — получение целых растений из меристематических тканей, но с промежуточной стадией каллуса. В обоих случаях дифференциация и органогенез управляется фитогормонами. Выросшее в пробирке переносится в грунт.

Следует подчеркнуть, что такой своеобразный способ вегетативного размножения основан на свойстве тотипотентности растительных ниток, это по сути – клонирование растений. В отличие от клонирования животных, которое очень активно обсуждается лишь последнее десятилетие, метод микроклонального размножения, растений используется уже более 40 лет. Впервые этот метод успешно применил французский исследователь Ж. Морель в 1960 г. для размножения орхидеи. Из одного безвирусного экспланта ему удалось в течение года получить около 4 млн. новых растений, свободных от вирусной инфекции. Метод клонального микроразмножения может использоваться для создания элитного и суперэлитного посадочного материала.

Основное преимущество метода микроклонального размножения, по сравнению с другими классическими методами — это значительно более высокий коэффициент размножения. Если обычным способом (черенками, луковицами, корневищами и т.д.) от одного растения можно получить от 2-3 до 100 растений в год, то методом микроклонального размножения их число можно увеличить от нескольких тысяч до миллиона.

К настоящему времени показана возможность клонировать «в пробирке» около тысячи видов растений, более чем у ста видов этот метод имеет коммерческое значение. Среди них — декоративные, плодово-ягодные, овощные, древесные, а также некоторые лекарственные растения.

Метод культуры тканей и клеток успешно используется для выведения новых сортов, в том числе и высокопродуктивных лекарственных растнеий. Для создания нового сорта классическим способом в грунте требовалось 10-30 лет. Благодаря методу культуры тканей этот период можно сократить до нескольких месяцев, поскольку сезонность значения не имеет.

10.4. Культура растительных клеток как источник лекарственных веществ

Природные запасы лекарственных растений уменьшаются, а синтез БАВ либо не осуществлен, либо нерентабелен. Поэтому технология получения биомассы на основе культуры клеток приобретает большое значение для производства лекарственных средств.

Преимущества использования клеточных культур заключаются в следующем:
– решается проблема дефицита исходного сырья, особенно ценных исчезающих видов, не поддающихся плантационному культивированию;
– возможно получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и др.;
– имеется возможность получения новых веществ, не синтезируемых соответствующим целевым растением;
– возможно управление биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и другими способами;
– имеется возможность индустриализации и удешевления производства некоторых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог.

Вместе с тем, развитие производства БАВ из изолированных клеточных культур в промышленных масштабах сдерживается рядом причин. Некоторые культуры изолированных клеток и тканей либо не синтезируют БАВ, характерные для соответствующего целого растения, либо вырабатывают их значительно меньше. В сравнении с микроорганизмами растительные клетки растут значительно медленнее, время их удвоения в среднем в 20 раз больше, чем клеток микроорганизмов. Вследствие длительности производства высок риск инфекций и гибели культур. Кроме того, большие объемы суспензионных культур растительных клеток состоят как из единичных клеток, так и агрегатов различного размера, которые не идентичны, что усложняет процесс производства БАВ. Вторичные метаболиты многих растительных культур не выделяются в питательную среду, что создает трудности их экстрагирования. Из-за больших размеров растительные клетки очень чувствительны к перемешиванию и снабжению кислородом. Себестоимость производства лекарственных средств на основе культуры изолированных растительных клеток достаточно высока. Промышленный выпуск такой продукции рентабелен лишь для особо ценных БАВ, стоимость которых на мировом рынке очень высока, сырье мало доступно, синтез пока не осуществлен и продуктивность культур достаточно высока.

В настоящее время получено более 30 видов различных изолированных клеточных культур лекарственных растений, продуцирующих БАВ на уровне соответствующего интактного растения, либо в большем количестве.

Первый отечественный биопродукт из культуры изолированных клеток — настойка «Биоженьшень» – разработан в лаборатории культуры тканей Института физиологии растений РАН, под руководством Р.Г. Бутенко. Препарат получен на основе высокопродуктивного клеточного штамма культуры клеток женьшеня и используется для изготовления лосьонов, кремов, а также тонизирующих напитков. Комплекс гинзенозидов (сапонинов женьшеня), выделяемый из культуры тканей, предлагается в качестве противоэпилептического средства.

Культивируемые in vitro клетки раувольфии змеиной являются перспективным источником гипотензивных и противоаритмических индольных алкалоидов. Методами клеточной селекции с использованием химических мутагенов и оптимизации условий выращивания получен высокопродуктивный штамм, накапливающий противоаритмический алкалоид аймалин, содержание которого составляет около 50% от суммы алкалоидов, синтезируемых культурой.

Получены изолированные клеточные культуры из различных видов барбариса, а также василисника малого. Суспензионная клеточная культура василисника малого продуцирует берберин — растительный антибиотик и противоопухолевое средство, при этом более 80% синтезируемых тканями алкалоидов секретируются в культуральную жидкость. В Японии налажено биотехнологическое производство противоопухолевого алкалоида берберина из культуры клеток коптиса японского, а также производство нафтохинонового пигмента шиконина — природного антибиотика широкого спектра действия из культуры клеток воробейника. На основе шиконина российские ученые разработали мазь «Эритромин», которая обладает антимикробной активностью в отношении антибиотико-резистентных микроорганизмов, многих патогенных бактерий, а также грибов.

Перспектива использования культуры тканей тиса обыкновенного связана с возможностью получения таксола – вещества, обладающего противоопухолевой активностью. Для лечения одного больного в течение года требуется 120-130 г сухой коры нативного растения, сырьевые запасы которого истощаются. Национальный институт рака США выделил около 1 млн. долларов для разработки экономически целесообразного способа получения таксола из культуры клеток.

Активно продолжаются работы с культурой клеток барвинка розового, продуцирующего противораковые алкалоиды. Стоимость субстанции винкристина на мировом рынке достигает 30 тыс. долларов за 1 кг, винбластина — около 20 тыс. за кг.

В Германии разработали способ получения кислоты розмариновой из культуры клеток каллуса. Кислота розмариновая – вещество, обладающее противоопухолевой активностью, и природный антибиотик широкого спектра действия. Из культуры клеток табака получен убихинон 10. На основе убихинона получают препарат для лечения инсультов и купирования спаечных процессов.

Категории
Рекомендации
Подсказка
Нажмите Ctrl + F, чтобы найти фразу в тексте
Партнеры
А знаете ли вы, что нажав сочетание клавиш Ctrl+F - можно воспользоваться поиском по сайту?
X
Copyrights © 2015: FARMF.RU - тесты, лекции, обзоры
яндекс.ћетрика
Рейтинг@Mail.ru

У вас включен AdBlock!

Привет! Мы создали этот сайт с различными интересными статьями. Для нас очень важно, чтобы вы отключили AdBlock. Ведь именно за счет рекламы живет этот сайт. Огромное спасибо.

Уведомление для пользователей AdBlock

У вас включен AdBlock!

Привет! Нас зовут Дима и Аня. Мы создали этот сайт с различными интересными статьями. Для нас очень важно, чтобы вы отключили AdBlock. Ведь именно за счет рекламы живет этот сайт. Огромное спасибо.