Выделение и очистка вирусов

Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии. Зинченко А.И., Паруль Д.А. — 2005

Глава 2. Свойства вирионов

• • Выделение и очистка вирусов
    • Общая характеристика подходов к выделению и очистке вирусов
    • Выделение вирусов из зараженных клеток
    • Концентрирование и очистка вирусов
    • Критерии чистоты вирусных препаратов
  • Структурно-функциональная организация вирионов
    • Химический состав вирусов
    • Принципы вирусной архитектоники

Общая характеристика подходов к выделению и очистке вирусов

Физико-химическое изучение любого вируса, как правило, начинается с разработки метода его выделения и очистки. Обычно исходный материал представляет собой культуральную жидкость, тканевый экстракт и т.д. Во всех этих случаях вирус находится в смеси с боль­шим количеством разнообразных балластных веществ — белков, пигментов, структурных компонентов клеток и т.п. Без удаления этих примесей невозможно проводить биохимиче­ские исследования вирусов.

Для очистки большинства вирусов с успе­хом применяют дифференциальное ультра­центрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы делает возмож­ным более тонкое разделение частиц, седимен- тационные свойства которых незначительно отличаются друг от друга. Методом равновес­ной седиментации в градиентах плотности це­зиевых солей можно разделить частицы, обла­дающие различной плотностью.

В случае, если вирусы приходится выде­лять из больших объемов биологических жид­костей, прибегают к высаливанию сернокис­лым аммонием, осаждению органическими растворителями, осаждению в изоэлектрической точке. Наряду с этим используется ионо­обменная хроматография, гельфильтрация и т.д. Короче говоря, большинство методов, используемых для очистки белков, примени­мо и к вирусам. Однако существует и ряд спе­цифических методов, применяемых для очистки только вполне определенных вирусов.

Например, миксовирусы можно очистить, используя их способность адсорбироваться на эритроцитах.

Общей схемы, пригодной для очистки любого вируса, в настоящее время не существует. Поскольку свойства ви­руса, так же как и химические свойства примесей, могут значительно варьировать у различных вируссодержащих материалов, то и выбор приемов очистки будет зависеть от каждого конкретного случая.

Высокоочищенные вирусы можно получить только благодаря применению целого ряда методов.

Идеальным методом выделения вирусов был бы тот, который обеспечил бы сохранение их биологической ак­тивности при полном разрушении клеточных компонен­тов и мембран. Однако такого метода нет. В зависимости от характера исходного материала и природы вируса при­емы извлечения вирусов различны.

Выделение вирусов из зараженных клеток

Размалывание. Этот способ широко применяется в тех случаях, когда приходится работать с большим количест­вом вируссодержащего материала. Наиболее простым и почти универсальным приспособлением для размельче­ния нативной животной ткани является обычная или электрическая мясорубка.

Гомогенизация. Более основательное разрушение тка­ни достигается при помощи гомогенизаторов. Из препара­тивных гомогенизаторов наиболее популярны высокоско­ростные смесители типа «Warring». Они снабжены стек­лянными или стальными сосудами и набором четырехло­пастных стальных ножей, которые соединены с мотором, способным вращаться со скоростью до 15 ООО об/мин. Единственным недостатком такого гомогенизатора явля­ется то, что развиваемое большое гидродинамическое воз­действие в сочетании со вспениванием иногда инактиви­рует некоторые лабильные вирусы. Эти неблагоприятные условия исключаются при использовании гомогенизато­ров, состоящих из двух деталей: толстостенной конусной пробирки и пришлифованного к ней пестика из стекла или тефлона. К сожалению, производительность таких го­могенизаторов незначительна (3-8 г ткани за цикл).

Обработка ультразвуком. Очень широко используется также дезинтеграция клеток, зараженных вирусами, при помощи ультразвука. Если обрабатывать жидкость ульт­развуком, то при определенной интенсивности звука (око­ло 20 кГц/с) в среде возникает явление кавитации. Благо­даря очень быстрому чередованию давления и разрежения возникает большое число крошечных воздушных пузырь­ков, которые, разрываясь, образуют вокруг себя область с интенсивной ударной волной. При этом возникает мгно­венный жесткий локальный градиент давления, который и разрушает клетки.

Лизис клеток. Часто, чтобы разрушить зараженные клетки, используют ферменты (лизоцим, трипсин, гиалу- ронидаза и т.д.). Для лизиса дрожжей и грибов эффекти­вен комплексный ферментный препарат «Геликаза», по­лучаемый из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia. Клетки животных можно эффек­тивно разрушать мочевиной и детергентами (додецил-сульфат натрия, дезоксихолат натрия и др.).

На практике часто обработка ультразвуком сочетается с другими способами дезинтеграции, такими, как осмоти­ческий шок в дистиллированной воде (протопласты бакте­рий и грибов), многократное замораживание и оттаивание (ткани животных), гомогенизация, что значительно уменьшает время обработки ультразвуком. Последнее бла­гоприятно сказывается на выходе инфекционных вирус­ных частиц, поскольку ультразвуковая обработка приво­дит к значительному разогреву озвучиваемой суспензий.

Концентрирование и очистка вирусов

Осаждение солями. Вирусы, подобно белкам, осажда­ются из водных растворов при определенных концентра­циях солей, которые разрушают взаимодействие между молекулами воды и полярными группировками оболочки вируса. Вирус агрегирует и выпадает в осадок. Наиболее часто для этого применяют сульфат аммония.

Несмотря на простоту и дешевизну, метод высалива­ния сульфатом аммония обладает двумя недостатками. Во-первых, он неспецифичен для вирусов, поскольку вместе с ними высаливаются и белки клетки-хозяина, во-вторых, при этой процедуре происходит деструкция не­которых вирусов.

Осаждение в изоэлектрической точке. Большинство вирусов преципитирует в кислой зоне pH, поскольку их изоэлектрические точки лежат в пределах 3,5-6,5.

Осаждение в изоэлектрической точке — наиболее прос­тая и доступная операция из всех применяемых методов концентрирования и очистки вирусов. Однако при pH ни­же 5,0 также выпадают в осадок многие белки клетки-хо­зяина, что ограничивает возможность применения этого метода. К тому же подобная процедура не всегда жела­тельна при очистке некоторых лабильных вирусов.

Осаждение спиртами. При добавлении к вируссодер­жащей суспензии охлажденного метанола или этанола ви­рус преципитирует вследствие уменьшения (как и в рас­смотренном выше случае обработки сульфатом аммония) степени гидратации его белковой оболочки. Оптимальная концентрация спирта для каждого вируса подбирается эм­пирически. Эта величина колеблется от 15 до 35% . Проце­дура проводится при максимально возможных низких температурах для избежания денатурации вирусных час­тиц. Метанол более выгодно использовать, чем этанол, так как, применяя его, можно работать при более низких тем­пературах.

Однако этот метод так же, как и метод высаливания суль­фатом аммония, имеет недостатки. Он неспецифичен для вирусов (осаждается значительное количество балластных белков) и не может быть использован для некоторых виру­сов животных, которые не устойчивы к спиртам (сложные вирусы, содержащие липопротеидные оболочки).

Обработка ферментами. Благодаря особой структур­ной организации вирионов, большинство вирусов, несмот­ря на их нуклеопротеидную природу, устойчиво к действию протеолитических ферментов и нуклеаз, в то время как клеточные нуклеиновые кислоты и белки легко разрушаются этими ферментами. Используя эту различ­ную чувствительность вируса и клеточных примесей к ферментам, можно при помощи ферментов провести час­тичную очистку вирусов.

Ультрафильтрация. Метод концентрирования и очист­ки вирусов с помощью мембранных ультрафильтров име­ет преимущества перед другими методами, как один из наи­более мягких и щадящих. Мембранные фильтры изготав­ливают из этерифицированной целлюлозы. Размер пор у фильтров разных типов варьирует от 0,01 до 8 мк. Фильт­ры устойчивы к температуре (до 125°С), к воздействию разбавленных кислот и щелочей и неполярных раствори­телей. В идеале, используя последовательную ультра­фильтрацию через две мембраны с убывающим размером пор (одна задерживает частицы более крупные, чем вирус, а вторая — только вирус), можно получить в чистом виде любой вирус. Недостатком метода является то, что часто происходит засорение фильтра или адсорбция вируса на фильтре.

Разделение в двухфазных системах. Метод основан на том, что распределение веществ в водной полимерной двухфазной системе зависит от их размера и поверхност­ных свойств и характеризуется определенным коэффици­ентом распределения. Например, вирусы и примеси в сис­темах, содержащих декстран и полиэтиленгликоль, име­ют разные коэффициенты распределения между двумя фазами. Поэтому в одной фазе собирается вирус, а в дру­гой — примеси. Метод прост и не требует сложного обору­дования. Преимущество его состоит также в том, что кон­центрирование и очистка вируса производятся в «мяг­ких» условиях. Кроме того, можно обрабатывать большие количества вируссодержащего материала.

Дифференциальное ультрацентрифугирование. Метод ультрацентрифугирования основан на разделении частиц по их различной способности седиментировать в центро­бежном поле, в частности по такому параметру, как конс­танта седиментации. В свою очередь, скорость осаждения частиц в центробежном поле зависит от сочетания таких параметров, как масса и так называемая «парашютность» частицы, которая зависит от ее размера и формы.

Термин «седиментация» означает осаждение частиц под действием силы тяжести. Вирусы настолько малы, что обычной силы тяжести недостаточно для их осажде­ния. Для этого создается искусственное поле силы тяжес­ти. Приборы, позволяющие добиться увеличения гравита­ционного поля до таких величин, при которых происхо­дит седиментация макромолекул, называют ультрацент­рифугами. Современные ультрацентрифуги позволяют увеличить поле силы тяжести в центрифужной пробирке с исследуемым веществом более чем в 300 тыс. раз.

Скорость осаждения частиц, приведенная к единице центробежного ускорения (коэффициент седиментации, S), является специфической характеристикой макромоле­кул и выражается формулой

где х — расстояние от оси вращения, см; t — время, с; ω — угловая скорость, рад/с.

Коэффициент седиментации имеет размерность време­ни, так как со имеет размерность, обратную времени (ради­ан — величина безразмерная). Значения коэффициента се­диментации для различных макромолекул имеют величи­ны порядка 10^-14-10^-13 с. Для удобства величина 10^-13 принята за единицу коэффициента седиментации. Эту ве­личину обозначают S (единица Сведберга).

Коэффициент седиментации обычно зависит от концент­рации изучаемого вещества. На практике бывает необ­ходимым знать седиментационные характеристики ве­ществ при оседании в сравнимых и идеальных условиях, т.е. условиях, когда взаимодействие между частицами от­сутствует. Для этого величина коэффициента седимента­ции, измеренная в воде при 20°С, рассчитывается для бес­конечного разведения раствора и обозначается как S°₂₀,_w — константа седиментации.

В современных ультрацентрифугах достигается ско­рость вращения ротора 60 000 об/мин и выше. Для час­тиц, находящихся на расстоянии 5-6 см от оси вращения, эта скорость соответствует центробежной силе, превыша­ющей силу тяжести в 250 тыс. раз.

Ядра клетки оседают при 800 g, митохондрии — при 10 000 g₉ а большинство вирусов — при 30 000-100 000 g за 0,5-3 ч. При низкоскоростном центрифугировании из вируссодержащей суспензии удаляются обломки клеток и их компоненты. Затем при центрифугировании над осадка при 100 000 g осаждают вирусные частицы, а основная часть белков и других низкомолекулярных соединений ос­тается в надосадочной жидкости. Таким образом, с по­мощью цикла дифференциального центрифугирования удается разделить вирусную суспензию на ряд фракций, со­держащих однородные по скорости седиментации частицы.

Следует отметить, что для большинства вирусов ис­пользование только одного метода дифференциального центрифугирования недостаточно, чтобы получить высо- коочищенную вирусную суспензию. Как правило, конеч­ный препарат содержит некоторые нормальные компо­ненты клеток, имеющие очень близкие с вирусами седиментационные характеристики. К сожалению, мно­гие вирусы, особенно палочкообразные, могут образовы­вать после центрифугирования осадки, которые затем очень трудно вновь суспензировать.

Ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Это понятие относится к скоростному центрифугированию частиц в столбе жидкости с плотностью, увеличивающей­ся по направлению от оси ротора. Такой градиент плотнос­ти может быть образован с помощью, например, сахарозы, глицерина, фиколла или солей тяжелых металлов (цезия, рубидия).

Существуют две наиболее важные разновидности метода:

• метод зонального ультрацентрифугирования;
• метод изопикнического (или равновесного) ультра­центрифугирования.

Метод зонального ультрацентрифугирования для разде­ления частиц в зависимости от коэффициента седимента­ции применяется с 1953 г. При этом исследуемую суспен­зию наслаивают на преформированный градиент. Градиент обычно готовят пологим, и если центрифугирование про­должать длительно, то все частицы могут осесть. Поэтому центрифугирование надо прекращать до момента оседания частиц. Но вместе с тем времени должно быть достаточно для того, чтобы частицы могли мигрировать через гради­ент. В результате указанной процедуры в центрифужной пробирке формируются зоны, каждая из которых состоит из частиц с близкими седиментационными свойствами.

Для извлечения вируса из центрифужной пробирки со­держимое ее фракционируют. Обычно это осуществляется путем прокалывания дна пробирки и последовательного сбора фракций.

При равновесном ультрацентрифугировании частицы суспензируют в растворе хлористого цезия или сульфата це­зия. После продолжительного центрифугирования в про­бирке создается устойчивый градиент плотности. Частицы собираются на том уровне, где плотность среды равна их собственной плотности. При этом значение плотности час­тиц, полученное таким образом, зависит от используемой среды и отличается от значения плотности для сухих частиц или для частиц, исследуемых в другой среде, так как концент­рированные растворы солей в значительной степени изме­няют степень гидратации белков оболочки. Поэтому в этом случае принято говорить о «плавучей» плотности частиц.

Рассмотрим принцип работы самоустанавливающегося изоплотностного градиента (рис. 2.1).

Рис. 2.1. Схематическое изображение разделения двух вирусов с различной плавучей плотностью путем равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl

Левую центрифужную пробирку наполняют водным раствором CsCl (р = 1,28 г/мл), в котором суспензируется некоторое количество вируса осповакцины и вируса гриппа. После центрифугирования в течение 20 ч при 41 000 об/мин молекулы CsCl концентрируются на дне пробирки, обра­зуя градиент плотности. При этом вирионы из нижней части градиента всплывают (так как они легче, чем нахо­дящийся здесь раствор CsCl), а вирионы из верхней части градиента, наоборот, осаждаются — до зоны, которая име­ет ту же плотность, что и частицы вируса. В данном случае это зоны с плотностью 1,28 г/мл (вирус осповакцины) и 1,25 г/мл (вирус гриппа).

Разрешение, достигаемое при ультрацентрифугирова­нии в градиентах плотности CsCl и Cs₂SО4, очень велико. Например, при помощи этого метода удается легко разде­лить частицы бактериофагов, отличающиеся друг от дру­га по плотности всего на 0,05 г/мл. Этому различию в плотности соответствует относительное различие в содер­жании ДНК порядка 1%.

Адсорбционная хроматография. Метод основан на раз­личной степени адсорбции вирусов и примесей при фильт­ровании через слой твердого адсорбента. Решающее значе­ние имеют поверхностные свойства вирусной частицы и адсорбента, а также состав буфера, в котором суспензиро­ван вирус. При элюировании соответствующим буфером вирусные частицы могут быть отделены от примесей. В качестве адсорбентов в вирусологической практике обычно используются фосфат кальция, гидроксилапатит, фосфат алюминия, цеолит.

Хроматография на молекулярных ситах (гельфильтрация). Метод основан на способности пористых материалов разделять смесь веществ по размеру и молекулярной массе компонентов. Молекулярные сита не обладают сорбцион­ным сродством к фракционируемым веществам. Обычно в качестве таких пористых материалов применяют гранули­рованные гели полисахаридов (сефадексы, агароза), поли­акриламид (биогели) и пористое порошковое стекло.

Схематически процесс гельфильтрации можно пред­ставить следующим образом (рис. 2.2). Молекулы более крупные, чем размер пор в гранулах, не проникают внутрь них и поэтому движутся по колонке с жидкой фазой вне гранул. Мелкие молекулы проникают внутрь гранул и движутся относительно медленнее. Степень проникнове­ния зависит от размера и формы молекул. Вследствие это­го элюирование молекул из слоя гранул геля происходит в порядке уменьшения размера молекул. Когда из колонки элюируются все молекулы, она вновь готова к следующе­му эксперименту. Эта автоматическая регенерация — одно из преимуществ гельфильтрации.

Рис. 2.2. Схема фракционирования вируса и примеси на колонке с мо­лекулярным ситом

Метод гельфильтрации нашел широкое применение в ви­русологической практике, так как он наиболее безвреден для лабильных вирусов. Кроме того, он очень удобен при исполь­зовании на последней стадии очистки многих вирусов, по­скольку при этом можно удалить из препаратов сульфат ам­мония и другие низкомолекулярные вещества (например, использующиеся для формирования градиентов плотности).

Адсорбция на эритроцитах. Этот метод очень удобен для очистки тех вирусов, которые способны адсорбиро­ваться на эритроцитах и элюироваться с них. К таким ви­русам относятся вирус полиомы и многие представители миксовирусов. Впервые феномен адсорбции-элюции ви­русов с участием эритроцитов был обнаружен в 1941 г. В частности, было показано, что вирус гриппа адсорбируется поверхностью эритроцитов при 0-25°С и спонтанно элюируется с них при 37°С и выше. Этот метод позволяет при минимальном техническом оснащении лаборатории получать достаточно очищенные препараты вирусов. Сле­дует отметить, что в настоящее время вместо нестабиль­ных нативных эритроцитов используют куриные эритро­циты, обработанные формалином. Такие «формалинизи- рованные» эритроциты более устойчивы к изменениям состава среды и менее загрязняют своими обломками ви­русный элюат. При этом их можно (в отличие от нативных эритроцитов) использовать неоднократно.Цикл адсорбции и элюции с применением эритроцитов проводят перед основными этапами очистки вируса, напри­мер, перед ионообменной хроматографией, гельфильтраци-, ей или дифференциальным ультрацентрифугированием.

Ионообменная хроматография. Ионообменниками на­зывают такие соединения, которые содержат фиксирован­ные заряженные функциональные группы и подвижные противоионы. Последние могут обратимо обмениваться с другими ионами того же заряда, не изменяя физических свойств нерастворимой матрицы. Ионообменниками мо­гут быть органические и неорганические соединения — алюмосиликаты, синтетические смолы, полисахариды, целлюлоза и т.д.

Тип ионообменника определяется активностью групп в матрице. Введение фенольных, карбоксильных или сульфогрупп придает матрице катионообменные свойства, а введение алифатических или ароматических аминогрупп — анионообменные свойства (табл. 2.1).

Разделение компонентов при этом виде хроматографии осуществляется не за счет разницы в их размерах, а за счет различий в их зарядах. Фракционирование вируссо­держащих смесей, нанесенных на колонки, осуществля­ется пропусканием через колонку буферных растворов с возрастающей ионной силой или же растворов с возраста­ющей (или убывающей) величиной pH.

Применяя ионообменники, удается сравнительно легко и быстро проводить препаративную очистку и концентриро­вание различных вирусов. В то же время имеются сообще­ния и о неудачах при использовании метода ионообменной хроматографии для очистки вирусов. Некоторые вирусы при элюции с ионообменников теряют до 90% активности.

Таблица 2.1. Основные типы целлюлозных ионообменников

Критерии чистоты вирусных препаратов

Вирусный препарат можно считать чистым, если в нем не обнаруживаются какие-либо посторонние примеси. Оп­ределение степени загрязненности зависит от чувстви­тельности применяемых методов исследования. Следует помнить, что применяя какой-либо один метод, нельзя до­казать гомогенность препарата.

Важным критерием чистоты считается кристаллиза­ция. Часто как доказательство чистоты вирусного препа­рата используется наличие спектра поглощения в ультра­фиолете, характерного для нуклеопротеидов.

Важнейшим методом оценки гомогенности вирусной суспензии является наблюдение за скоростью седимента­ции частиц при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Требованием для гомогенного препа­рата является симметричность соответствующего ему пи­ка на седиментационной диаграмме.

Еще более чувствительным критерием гомогенности служит наличие одного пика при равновесном ультра­центрифугировании в градиенте плотности CsCl или Cs₂SC>4.

Применение метода электронной микроскопии для вы­явления примесей целесообразно, если этот материал име­ет достаточный размер и по внешнему виду отличается от вируса.

Примесь клеточных веществ, которые способны диф­фундировать и обладают антигенными свойствами, мож­но выявить с помощью очень чувствительных серологи­ческих методов, таких, как иммунодиффузия и иммуно­электрофорез.

Для вирусов с хорошо установленным элементарным составом (например, ВТМ) такие методы, как определение отношения фосфора к азоту, позволяют обнаружить при­меси, содержащие азот или фосфор, если они присутству­ют в значительном количестве. При определенных обстоя­тельствах могут быть применены также более сложные химические методы, например анализ концевых групп белков, позволяющих обнаружить всего-навсего одну аминокислоту.

Из вышеизложенного следует, что для вирусных пре­паратов нет одного вполне удовлетворительного метода определения чистоты. Поэтому в практической работе ис­пользуют и критически сопоставляют результаты, полу­ченные при помощи как можно большего числа разнооб­разных методов.