Методы исследования. Введение в биохимию

Методы исследования. Введение в биохимию

Введение.
Биологическая химия – одна из фундаментальных теоретических наук, которая изучает состав, структуру и свойства химических соединений, формирующих живые системы, а также их взаимодействие и взаимопревращение в процессе метаболизма.
Основное содержание курса биохимии в медицинском ВУЗе составляет медицинская биохимия.
Медицинская биохимия изучает молекулярные основы физиологических функций человека, молекулярные механизмы патогенеза болезней, биохимические основы предупреждения и лечения болезней, биохимические методы диагностики болезней и контроля эффективности лечения.

Получение биологического материала.
Наиболее распространенным материалом для клинико-лабораторных исследований являются кровь и моча.
Кровь рекомендуется брать утром после 8-12 часового голодания. Если требуется получить плазму – в пробирку заранее вносят антикоагулянт для предохранения крови от свертывания. В зависимости от цели и задач применяют следующие антикоагулянты: аксалат натрия, ЭДТА, гепарин, тринатрий цитрат и др. Для получения сыворотки – антикоагулянт не добавляют, а пробирки с кровью закрывают ватной пробкой и помещают в термостат на 10-15 мнут (t= 37˚С). Сгусток фибрина отделяют от стенок пробирки стеклянной палочкой или стальной спицей, сыворотку переливают в центрифужную пробирку и центрифугирую 10 минут при 1500 об/мин. Считается, что объем выделяемой сыворотки составляет примерно 1/3 взятого объема крови.
В процессе выполнения экспериментов на животных (примеры кафедральных научных работ) с целью изучения метаболизма в тканях получают экстракты тканей и клеточные органеллы.
После декапитации крыс и взятия крови, изучаемые ткани немедленно помещают в жидкий азот для прекращения работы ферментных систем. Делают навеску ткани, которую растирают в кислотах (ТХУ или НСlО4) – происходит кислотная денатурация ферментов. После центрифугирования полученный экстракт нейтрализуется KHCO3 или NaOH. Приготовленный таким образом образец может быть использован например для определения концентрации метаболитов ЦТК, ПФП, гликолиза. Часть образца, используемая для аналитического определения содержащихся в нем компонентов, обозначается как проба.
Применяя микроизмельчители тканей, получают тканевую «кашицу», которую затем гомогенезируют в гомогенезаторе Поттера. Приготовленные подобным образом гомогенаты подвергаются дифференциальному центрифугированию в градиенте сахарозы для выделения субклеточных структур.
Для этой цели используют рефрижераторные высокоскоростные центрифуги:

число оборотов, время

органеллы

объект

1

3 000 об/мин, 5 мин

Ядра, интактные клетки

ДНК, РНК, ферменты синтеза пуриновых и пиримидиновых оснований.

2

10 000 об/мин, 10 мин

Митохондрии

Ферменты тканевого дыхания, ЦТК, окисления жирных кислот. Цитохромоксидаза. Моноаминооксидаза.

3

постмитохондриальная фракция

Цитозольная фракция

Ферменты гликолиза, ПФП, синтеза холестерина, жирных кислот.

4

40 000 – 70 000 об/мин, 60 мин

Лизосомы

Кислые гидролазы или катепсины.

5

100 000 об/мин, 90 мин

Рибосомы, микросомы

РНК-рибосомальная, трансляция белка, цитохром Р450, глюкозо-6-фосфотаза.

Клеточные органеллы, полученные для изучения активности ферментов, с целью увеличения их проницаемости и доступности фермента и субстрата подвергают 2-3 кратному замораживанию-оттаиванию, добавлению ПАВ, обработке ультразвуком.

Принципы методов центрифугирования, хроматографии, фотоэлектрокаллориметрии.

Методы исследования. Спектрофотометрия.
При выполнении клинико-биологических исследований применяют спектрофотометры, позволяющие измерять спектры поглощения в ультрафиолетовой области (200-400 нм) и видимой области (400-700 нм). Широко используется при регистрации активности ферментов оптический тест Варбурга, заключающегося в регистрации оптической плотности НАД при 340 нм.

Например:

ПВК + НАДН·Н ←ЛДГ→ лактат + НАД.
уменьшение оптической плотности увеличение оптической плотности

Данный метод, обладая высокой специфичностью, простотой используется и для количественного определения субстратов и нуклеотидов.

Методы исследования. Потенциометрические методы.
Потенциометрические методы исследования основаны на измерении ЭДС, создаваемой электрохимическим элементом.
1). рН-метрия. Применяемое для измерения рН оборудование состоит из стеклянного электрода, электрода сравнения и рН-метра. Этот прибор широко применяется для приготовления буферных реакционных растворов, активности ферментов, электрофорезе белков сыворотке крови, определения рН слюны, мочи, желудочного сока.
2). Ион-селективные электроды.
Стеклянный электрод по сути дела является ион-селективным, т.к. он чувствителен к ионам водорода. В настоящее время имеются электроды, чувствительные к Са, Na, Р, Cl, Mg, Fe и т.д. Определение их концентраций в крови, в эктрактах тканей может быть использовано в диагностике различных заболеваний. Например при рахите в сыворотке крови уменьшается концентрация ионов кальция, а при кистозном фиброзе пот содержит избыток ионов хлора. При анализе золы волос больных И.Б.С. отмечено десятикратное уменьшение концентрации Са.

Методы исследования. Гистохимические методы.
С помощь этих методов получают информацию о локализации и активности ферментов в тканевых срезах. Ферменты выявляются солями тетразолия, диазония, нафтола и тяжелых металлов. Учитывая, что ферментный спектр лимфоцитов отражает метаболический статус любой ткани, применяют полуколичественный цитохимический метод выявления активности ферментов крови. Например, при И.Б.С. увеличивается активность гидролитических ферментов лимфоцитов (щелочной фосфотазы) и уменьшается активность окислительно-восстановительных ферментов (СДГ,ГДГ).
Известные в мире биохимические автоанализаторы могут быть условно подразделены на три основных типа.

  1. Одноцелевые биохимические автоанализаторы, с помощью которых в анализируемой пробе определяется лишь один компо­нент биологической жидкости и ткани. К числу таковых могут быть отнесены, например, анализатор «Глюкоза-2» фирмы «Бекман», автоматическое устройство для определения уровня глюко­зы в сыворотке (плазме) крови германо-российского производ­ства (ESAT-6660), автоматический титратор для определения со­держания кальция и т.д.
  2. Автоматы для определения так называемых родственных компонентов. Это, например, автоанализатор аминокислот, принцип действия которого основан на хроматографическом их разделении (по Штейну и Муру); автоматический атомно-абсорбционный пламенный спектрофотометр.
  3. Многоцелевые биохимические автоматические устройства, предназначающиеся для установления содержания в биологичес­ких жидкостях большого количества различных по химической природе компонентов, которые в лечебно-профилактических уч­реждениях республики наиболее широко применяются для вы­полнения ординарных и некоторых специальных клинико-лабораторных исследований специальных клинико-лабораторных исследований.

Технико-аналитические возможности биохимических авто­анализаторов во многом зависят от заложенного в них принципа действия: «поточного» или «дискретного» (см. рис. 6).
Впервые поточный принцип действия автоанализатора был предложен Скеггсом (1954). Согласно этому принципу, все хими­ческие реакции при анализе проводятся в потоке транспортируе­мых по трубкам и разделенных воздушными прослойками проб.

Автоанализаторы, использующие дискретный принцип работы, применяются в клинико-лабораторной практике с начала 60-х годов XX в. Согласно этой технологии из специального пробо­отборника в реакционную емкость приготовителя вносятся ана­лизируемая проба, разбавитель (при необходимости) и соответ­ствующие реагенты. Смесь термостатируется, после чего замеря­ется ее оптическая плотность (в видимой, ультрафиолетовой об­ласти).

Методы исследования. Основные преимущества полностью автоматизированых устройств следующие.

  1. Экономичность (экономное расходование реагентов). Если при работе на ФЭКе обычно требуется 3—4 мл реактива, то при выполнении исследований на автоанализаторе всего лишь 350— 500 мкл (и менее). Отсюда возможность 10-кратной экономии ре­агентов (!).
  2. Использование весьма небольшого объема анализируемой биологической жидкости (3—7 мкл).
  3. Высокая производительность (до 800 и более исследований в час).
  4. Достаточно большая загруженность. Автоанализатор дол­жен эксплуатироваться не менее 5—6 ч в сутки (!).
  5. Гибкость в работе. Обеспечивается возможностью выпол­нения разных режимов определения: по конечной точке, двух- и многоточечной кинетике, с привлечением технологии турбидиметрии (иммунонефелометрии), ионометрии, поляризационной флюориметрии и др. В последнее время используется принцип турбидиметрии с фиксированной абсорбцией. Особенностью этого технологичес­кого процесса является измерение времени прироста оптической плотности до заданного ее значения. Реализуется в коагулологии.
  6. Возможность программирования автоанализатора под ре­активы разных фирм-производителей, так называемая «откры­тость» системы, которая предполагает введение в компьютер всех необходимых параметров биохимической реакции и осуществле­ние самостоятельного программирования. Открытость системы имеет большое значение, так как стоимость одного биохимичес­кого исследования на 50% определяется использованными реа­гентами, на 30% стоимостью анализатора и на 20% — всеми ос­тальными затратами.
  7. Применение небольших (в том числе и моющихся) измери­тельных кювет.
  8. Системный подход, который расценивается как возмож­ность «просмотреть» сам ход реакции, что позволяет, в частности, выявить фазу исчерпания субстрата, кофакторов (при «ручном» определении это обнаружить невозможно).
  9. Программное сохранение базы данных.
  10. Возможность выполнения экстренных исследований (пос­тановки так называемых «цитовых» проб).
  11. Связь с компьютерами: многие автоанализаторы имеют выход на центральный, «хохстовый» компьютер.
  12. Широкие возможности измерительного модуля. В отличие от обычных фотоэлектроколориметров, позволяющих замерять оптическую плотность растворов в пределах до 0,2—0,7 ед, совре­менные биохимические автоанализаторы дают возможность регистрировать абсорбцию (при условии соблюдения закона Бугера—Ламберта—Беера) в диапазоне до 2,5 ед: это достигается ис­пользованием мощного источника облучения и более чувстви­тельных приемников света. Некоторые из современных биохимических автоанализаторов оснащены также ионоселективным блоком, позволяющим, в час­тности, проводить определения ионов валиномициновым мето­дом.
  13. Использование неагрессивных жидкостей. Ферментные наборы реагентов не содержат агрессивных жидкостей, практи­чески не обладают токсическим эффектом.
  14. Надежность устройства, связанная с применением в нем новейших технологий.

Категории
Рекомендации
Подсказка
Нажмите Ctrl + F, чтобы найти фразу в тексте
Помощь проекту
А знаете ли вы, что нажав сочетание клавиш Ctrl+F - можно воспользоваться поиском по сайту?
X
Copyrights © 2015: FARMF.RU - тесты, лекции, обзоры
Яндекс.Метрика
Рейтинг@Mail.ru