Этапы анализа:
1. Экстракция БАВ из ЛРС (вода, спирт, кислоты, растворители). Выбор растворителя определяется природой вещества: двухфазная – гидрофильные растворители, потом гидрофобные растворители.
2. Очистка сырья
3. Разделение смеси БАВ
4. Качественный или количественный анализ.
Первая группа – химические методы:
а) качественные реакции
б) количественное определение – гравиметрический метод
в) титриметрический метод. Основан на ОВР, КОР.
Вторая группа – физико-химические методы
А) Хроматографические методы (широко используются для очистки и разделения смесей):
— колоночная (жидкостная)
— бумажная
— планарная
— газовая
Б) Фотометрические методы:
— спектрофотометрический
— фотколориметрический
В) Биологические методы – количественное определение содержания сердечных гликозидов.
Выбор метода зависит от физических и химических свойств БАВ.
Используют гравиметрические (весовые), титриметрические (объему и физико-химические (инструментальные) методы анализа.
Гравиметрические методы
Гравиметрические (весовые) методы основаны на избирательной различной растворимости биологически активных веществ в воде и неполярных органических растворителях. Происходит выделение суммы веществ путем их осаждения или получения нерастворимых комплексных соединений с последующим установлением их постоянной массы. Применяют для сырья, содержащего гликозиды: полисахариды (хорошо растворимы в воде и нерастворимы в крепких спиртах — осаждаются 95% этанолом); сапонины (растворимы в метиловом спирте и нерастворимы в диэтиловом эфире и ацетоне); дубильные вещества (осаждение желатином, солями тяжелых металлов или адсорбция кожным порошком); алкалоиды, выделяемые в виде солей или в виде оснований.
Методы просты в исполнении, но длительны, т. к. выделившийся осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием, высушивают и доводят постоянной массы. Кроме того, метод дает завышенные результаты, потому что вместе с БАВ осаждаются и сопутствующие вещества. Но для некоторых видов сырья, например, содержащего полисахариды, этот метод наиболее специфичен, поэтому включен в статьи ГФ-XI, вып 2 на листья подорожника большого, траву череды, слоевища ламинарии. Используется для сырья, содержащего алкалоиды: сырье безвременника, дурмана индейского, плауна-баранца
Для многих видов ЛРС проводят количественное определение экстрактивных веществ. Методика их определения (ГФХI, вып 1) также основана на использовании гравиметрического метода.
Титриметрические методы
Титриметрические (объемные) методы основаны на химических свойствах БАВ:
1. На их способности легко окисляться:
— перманганатом калия (дубильные вещества)
— раствором йода (простые фенольные соединения — арбутин),
— 2, 6-дихлорфенолиндофеолятом натрия (аскорбиновая кислота).
2. На основных свойствах основаны титриметрические методы определения алкалоидов. Алкалоиды ведут себя как основания и могут быть определены путем:
— прямого титрования (сырье анабазиса, софоры толстоплодной, чилибухи);
— обратного титрования (листья белены, дурмана, красавки; трава термопсиса, корневища с корнями чемерицы) растворами кислот.
Слабые основания определяют методом кислотно-основного титрования в неводных средах, где титрантом служит хлорная кислота.
Точку эквивалентности устанавливают по индикатору или потенциометрически (ГФ-XI — трава чистотела — метод неводного потенциометрического титрования).
Титриметрические методы экономичны, быстры в исполнении но недостаточно точны и дают завышенные результаты. С их помощью можно определить только сумму биологически активных веществ.
Физико-химические методы
Наиболее точны и высокочувствительны фотометрические методы (фотоколориметрия и спектрофотометрия), основанные на измерении количества света, поглощенного веществом, суммой веществ или комплексом вещества в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной области спектра. Используют фотометрические методы для определения почти всех групп биологически активных веществ (сердечные гликозиды, экдистероны, сапонины, кумарины, хромоны, лигнаны, флавоноиды, антраценпроизводные, дубильные вещества, алкалоиды, каротиноиды).
Фотоэлектроколориметрические методы основаны на измерении степени поглощения немонохроматического (полихроматического) света на довольно широком участке спектра окрашенных растворов с помощью фотоэлектроколориметра. Для получения окрашенных соединений используют реактивы, дающие яркие, устойчивые окраски: на флавоноиды, кумарины, фенологликозиды проводят реакцию образования азокрасителя с диазотированными сульфаниламидами (ГФ-XI — листья вахты, корневища и корни родиолы розовой).
Для анализа алкалоидов используют частные цветные реакции, основанные на окислении, конденсации и дегидратации алкалоидов концентрированными кислотами (коробочки мака, трава мачка желтого).
Антраценпроизводные дают вишнево-красное окрашивание со щелочами (кора крушины, корни ревеня, корневища и корни марены красильной). Спектрофотометрические методы основаны на способности веществ или их окрашенных продуктов реакции избирательно поглощать монохроматический свет в определенной области спектра. Такими свойствами обладают флавоноиды, кумарины, антраценпроизводные, сапонины, индивидуальные алкалоиды, экдистероны. Измерение проводят с помощью спектрофотометра.
Для большинства видов сырья, содержащих флавоноиды, измеряют.
— собственное поглощение суммы флавоноидов (ГФ-Х1 — цветки бессмертника, цветки пижмы);
— поглощение окрашенного комплекса с алюминия хлоридом (трава горца перечного, горца птичьего, зверобоя, листья сумаха, скумпии).
Для сырья, содержащего антраценпроизводные, используют реакцию со щелочью (листья сенны).
Для сырья, содержащего фенологликозиды, используют реакцию диазотирования (корневища и корни родиолы розовой).
Наиболее точными являются хроматоспектрофотометрические методы, основанные на разделении веществ с помощью хроматографии с последующим их определением спектрофотометрически. Можно определять количественное содержание как суммы веществ, так и индивидуальные вещества.
Реже для анализа лекарственного растительного сырья применяется флюорометрия, полярография, денситометрия, амперометрия, кондуктометрия.